موضوع:
استفاده از فشارهای بالای هیدرو استاتیک بر روی مخمر و درصنایع غذایی
اثر فشار ایزو استاتیک بالا برفعالیتهای متابولیکی و ریخت شناسی مخمر Saccharomyces cerevisiae
چکیده
استفاده از فشار ایزو استاتیک بالا در تحقیقات بیولوژیک و مواد غذائی در دهه اخیر مورد توجه زیادی قرار گرفته است. در این پژوهش به منظور بررسی اثر فشار ایزو استاتیک بر فعالیت متابولیکی مخمر ابتدا سویه خالص تجارتی مخمر Saccharomyces cerevisiae را به مدت 5،10و 15 دقیقه تحت فشارهای 150,125,100,75,50 مگاپاسکال قرار داده و یک نمونه نیز به عنوان شاهد و بدون اعمال فشار نگهداری گردید .
کلیه نمونه ها پس از 24 ساعت نگهداری در 4°C از نظر تعداد پرگنه در واحد حجم (CFU) فعالیت آنزیمی و تغییرات ریخت شناسی ، مورد ارزیابی قرار گرفتند نتایج پس از تجزیه و تحلیل آماری نشان داد که فشار50 MPa هیچ تا ثیری بر مخمر نداشته اما فعالیت آنزیمی مخمر تحت اثر فشار های 75 و 100 مگاپاسکال در مدت 10 و 15 دقیقه اعمال فشار به میزان قابل ملاحظه ای افزایش می یابد . با اینحال تصاویر میکرو گراف الکترونی به روش اسکن میکروسکوپ الکترونی(SEM) حاکی از تغییرات شدید سلول تحت اثر فشار 100 MPa علیرغم افزایش فعالیت مخمر می باشد.
میزان فعالیت آنزیمی مخمر تحت اثر اعمال فشارهای 125 و 150 مگاپاسکال کاهش یافته و تعداد پرگنه در واحد حجم به اندازه حداقل یک چرخه لگاریتمی کاهش نشان می دهد که این اثرات می تواند ناشی از تغییرات شدید ساختمان سلول مخمر تحت اثر اعمال فشارهای 125, 100 و 150 مگاپاسکال باشد . هم چنین بررسی ریخت شناسی سلولی مخمر پس از یک ماه نگهداری در4°C نشان داد که کلیه نمو نه های تیمار شده با فشار تجزیه شده و ازبین رفته اند.
مقدمه
استفاده از فرآیند فشار بالا یک امکان بالقوه برای فرآوری و نگهداری موادغذایی به شمار می آید. این فرآیند قادر به غیرفعال ساختن میکرواورگانیزمها و آنزیمها بوده و بکارگیری این فناوری در صنایع غذایی نیازمند شناخت سازوکار و سینتیک فشار در تخریب و نابودی و یا غیرفعال کردن میکرواورگانیزمها، آنزیمها و پروتئینها می باشد1)و(2 . اولین گزارشها در مورد تاثیر فشار ایزواستاتیک بر میکروارگانیزمها توسط Cretes در سال 1883 منتشر گردید. او باکتریهای زنده ای را در عمق5100 متری دریا مشاهده نمودار [ 3] همچنین اثر استفاده از فشار بالا برای نگهداری شیر توسط Hit و همکاران در دانشگاه ویرجینای غربی مورد بررسی قرار گرفت (4).
اصولا سلولهای رویشی مخمرها وکپک ها نسبت به فشار حساس هستند و در فشارهای 300 – 600 مگاپاسکال غیرفعال می شوند .اما باکتریها نسبت به فشار بسیار مقاوم بوده و غیر فعال نمودن آنها نیازمند اعمال فشارهای بالاتر است . مقاومت باکتریها در مقابل فشار متفاوت است .
شکلهای گرد یا کوکسی نسبت به شکلهای، باسیل یاکشیده و نیز باکتری های گرم مثبت نسبت به باکتر یهای گرم منفی مقاومترند . علاوه بر این ثابت شده است که هاگهای باکتریها مقاوم ترین اشکال میکروبی نسبت به فشار به شمار می آیند [ 5].
در این بین اعمال فشارهای کمتر از حد کشندگی در میکروارگانیزم ها سبب تغییر در فعالیتهای حیاتی و متابولیکی آنها می شود مثلا " اعمال فشارهای 200 تا 400 مگاپاسکال سبب جوانه زنی اسپور باکتر یها و یا اعمال فشارهای 200-50 مگاپاسکال در مخمرها سبب تغییر در ترشح متابولیتهای آنها می گردند .
نتایج برخی از آزمایشها نشان می دهد که اعمال فشار سبب تاخیر در رشد سلولهای مخمر سویه و کاهش IFo 2347 تعداد سلول 106)* 5سلول در میلی لیتر) در فاز لگارتیمی می گردد و فشار بیش از 40 مگا پاسکال تقسیم سلولی را کاملاً متوقف می سازد.(7,6)
فشار ایزواستاتیک در محدوده 100 مگا پاسکال و بالاتر سبب ایجاد جهش در سلولهای مخمر و تولید شکل های چهارتایی و دوتایی می شود و ساختمان حیاتی سلول را تحت تاثیر قرار می دهد.
فشارهای بالاتر از 150 مگا پاسکال سبب آسیب به غشاء و ساختار پروتئینی مخمر شده و باعث مرگ سلول می گردد8) و (9مشاهده شده است که فشار ایزواستاتیک 60 مگا پاسکال سبب افزایش اسیدی شدن و کاهشpH واکوئل می گردد که به نظر می رسد دلیل این امر تولید دی اکسید کربن و احتمالا افزایش فعالیتها ی آنز یمی و ترشح متابولیتها توسط مخمر باشد10) و.(11
در سالKilbanov 1983 ثبات آنزیم اینورتاز حاصل از مخمر Saccharomyces cerevisiaeتحت فشارهای بالا را مورد بررسی قرار داد ودریافت که در دامنه 250مگاپاسکال آنزیم دارای ثبات نسبی بوده و نیمه عمر این آنزیم 200 ± 15 دقیقه است و برای غیرفعال شدن نیازمند فشارهای بالاترمی باشد12) و.(13
هدف از این پژوهش بررسی اثر فشار هیدرواستاتیک درافزایش فعالیتهای حیاتی مخمر از جمله ترشح آنزیم می باشد که نقش مهمی در بهره وری بیشتر از این میکروارگانیسم درصنایع تخمیر ی و بخصوص صنایع پخت دارد.
-2 مواد و روشها
-1-2 خالص سازی و تهیه استوک حاوی سویه
مورد آزمایش: مخمرنانوایی واریته تجاری
(Saccharomyces cerevisiae)از شرکت ایران ملاس خریداری گردید . تحت شرایط سترون 11 گرم سلول مخمر با 99 میلی لیتر آب سترون مخلوط و تعلیق میکروبی تهیه گردید . تعلیق میکروبی آماده شده در رقتهای10تا 108سلول در میلی لیتر تهیه گردید .و آنگاه این رقتها بر روی محیط PDA به روش خطیTrisector شت داده شده و در دمای 30 درجه سانتی گراد به مدت 24 ساعت گرمخانه گذاری شدند.
از پرگنه های تکی مجدداً بر رو ی محیط جدید کشت خطی تهیه شد این عمل 3 بار به طور متوالی تکرار گردید هدف از این کار اطمینان از تهیه کشت خالص بود . از بشقابهای سوم پرگنه های تکی انتخاب شدند و از این پرگنه ها بر روی محیطهای شیب دار PDA در تیوپ کشت به عمل آمد پس از گرمخانه گذاری و رشد بر روی این محیط ها، لوله های آزمایش به عنوان منبع کشت خالص مورد استفاده قرارگرفت به این ترتیب 8 کشت مخمر در 3 تکرار تهیه گردید . از منبع مخمر که قبلا " بر روی محیط شیب دار تهیه شده بودند تحت شرایط سترون سوزن آنس به طور جز ئی با پرگنه ها آغشته شده و این سوزن واردمحیط YPD در لو له ها تلقیح گردید.
پس از طی دوره گرمخانه گذاری یک میلی لیتر از آن به ارلن مایرهای حاوی100 میلی لیتر YPDتلقیح شد . و مجددا گرمخانه گذاری گردید 30) درجه سانتی گراد به مدت 24 ساعت (. سلو لهای مخمر از محیط کشت توسط دستگاه نیروی گریز از مرکز 3000) دور در دقیقه و به مدت 20 دقیقه) جداسازی و با بافر فسفات 0/1 مول (pH=7)سه بار شستشو شدند و سپس در مقیاس McFarlane تعلیق مورد نظر آماده شد . از تعلیق به میلی لیتر لوله های دربدار سترون در حجمهای 1/5 منتقل گردید .(14)
2-2 فرآیند اعمال فشار
برای تحت فشار قراردادن نمونه ها ازپرس ایزواستاتیک مدل Dorst 2000 ساخت کارخانه Dorst- Maschinen and An Angen Bov کشورآلمان استفاده گردید نمو نه های حاوی تعلیق مخمر در حدود 108 سلول میلی لیتر به میزان 1 میلی لیتر درون لوله های پلی اتیلن با حجم 1 میلی لیتر به صورت سترون تهیه شده و پس از قرار گرفتن در محیط مایع(آب خالص) تحت فشار ایزو استاتیک قرار می گرفتند. اعمال فشار توسط برنامه داده شده به دستگاه در زمان لازم صورت می گرفت و پس از اعمال فشار نمونه ها به مدت 24 ساعت دردرجه حرارت 4C°نگهداری و سپس مورد میزان CFU ، میزان تولید دی اکسید کربن و فعالیت آنزیمی مورد اندازه گیری قرار گرفتند . میزان فشار، ایزواستاتیک در مقادیر0، 50،75 ،125 ، 100و 150 ، مگاپاسکال به مدت 10 ,5و 15 دقیقه اعمال می شد[15].
3-2فعالیت آنزیمی مخمر
500 میکرولیتر از تعلیق مخمر (معادل عدد ی مقیاس(McFarlane به ارلن مایرهای حاوی 50 میلی لیتر ساکارز 0/4 مولار در شرایط سترون افزوده شد . جمعیت میکروبی حدود (1*106) ارلنها به گرمخانه (25 ± 1C°)منتقل گردید. پس از 4 ساعت گرمخانه گذاری ارلنها را خارج کرده و پس از هم زدن ارلنها ، برای یکنواخت شدن جمعیت میکروبی 5 میلی لیتر از محیط مایع حاوی کشت سلول برداشته و به ارلن سترون دیگری منتقل گردید .سپس 15 میلی لیتر محلول DNS به آن اضافه شده و ترکیب حاصل شدید اً هم زده شد .
بعد از آن ارلن 15دقیقه در ظرف حاوی آب جوش قرار گرفت و بلافاصله در مخلوط آب و یخ ( 0 درجه سانتی گراد) به مدت 10دقیقه قرارداده شد و سپس به ارلن 20 میلی لیتر آب دیونیزه اضافه شده و شدید اً هم زده شد . مقدار 1 میلی لیتر از محلول برداشته شده و در کووتها ی طیف سنج نوری ریخته شده و جذب در 550 nm توسط طیف سنج نوری
(UV-VIS. Shimatzu) قرائت گردید هم چنین به منظور انجام مقایسه منحنی استاندارد گلوکز نیز تهیه گردید [ 16]
4-2 فرمانتوگرافی
برای اندازه گیری فعالیت مخمر ساکارومایسس سرویزیا از دستگاه فرمانتوگراف. SJA,Sweden استفاده گردید نتایج براساس میلی متر مکعب گاز دی اکسید کربن تولید شده در مجموع دو ساعت فعالیت م خمر در خمیر تهیه شده بوسیله دستگاه فرمانتوگراف گزارش شده است .
5-2 مشاهدات میکروسکوپی
به منظور بررسی اثر فشار بر ساختار سلول مخمر آزمایشهای میکروسکوپی توسط میکروسکوپ الکترونی مدلLeo 1450 VPبه روش ریخت شناسی انجام گرفت و نمو نه های شاهد و تیمار شده با فش ار با استفاده از میکروسکوپ الکترونی و به روش استاندارد SEMمورد مطالعه قرار گرفته و عکسبرداری به عمل آمد.
6-2 طرح آماری
برای تجزیه و تحلیل داد ه ها ی به دست آمده از طرح بلوک کاملا بلوک تصادفی به روش فاکتوریل استفاده گردید و میانگینهای بدست آمده از تجزیه آماری توسط آزمون چند دامنه ای دانکن P≤ 0/05 با یکدیگر در سطح مقایسه و کمترین حد اختلاف معنادار برای هرکدام از تیمارها تعیین گردید.
نتایج و بحث
1-3 تفسیر نتایج
کلیه داد ه های به دست آمده از آزمون فشار در زمانهایمختلف بر سلو لهای مخمر ساکارومایسس سرویزیا در صفات مورد مشاهده یعنی تعداد کلنی در واحد (C.F.U) میزان تولید دی اکسید کربن و فعالیتهای آنزیمی مورد تجزیه وتحلیل آماری قرار گرفت که در جدول ( 1) میانگین مربعات و درجه آزادی هر یک از تیمارها و اثرات متقابل آنها آورده شده است.
به طوری که در جدول ( 1) مشاهده می شود مقادیر به دست آمده در سطوح تکرارها و نیز سطوح زمان اعمال فشار در هیچکدام از صفات مورد مشاهده اختلاف معنادار آماری مشاهده نمی گردد . اما میزان اعمال فشار و اثر متقابل میزان فشار در زمانهای یاد شده دارای اثرات کاملاً معنا دار آماری می باشنددر بررسی و مقایسه میانگینهای به دست آمده در صفات میزان اعمال فشار دوره اعمال فشار و اثرات متقابل آنها توسط آزمون چنددامنه ای دانکن همان طور که در شکل ( 1) مشاهده می شود با افزایش میزان فشار تعداد سلو لهای زنده کاهش یافته است هرچند این کاهش تا فشار 100 مگاپاسکال کمتر از یک چرخه لگا ریتمی است اما در مقادیر فشار 125 تا 150 مگاپاسکال باندازه یک سیکل لگاریتمی کاهش مشاهده می شود [ 17 ]
تاثیر فشار بر فعالیت حیاتی سلو لهای مخمر توسط محققانی چون Pandyaو همکاران نیز بررسی گردیده است . آنها نشان دادند که فشار های کمتر از 60 مگاپاسکال تاثیر چندانی بر فعالیت حیاتی مخمر ندارد (18) . کاهش تعداد سلولها در فشار 50 مگا پاسکال به دلیل ایجاد شوک فشار نظیر شوک حرارتی است که بر سلو لهای مخمر حساس به فشار موثر بوده و سبب کاهش فعالیت حیاتی آنها شده است. بطوریکه در محدوده فشارهای 40 مگا پاسکال در فاز لگاریتمی تقسیم سلولی به طور کامل متوقف شده است.
علاوه بر این مخمرها به دلیل بزرگی قطر سلول نسبت به باکتریها به فشار، حساس ترند بطوریکه اعمال فشارهای بیش از 150 مگا پاسکال سبب مرگ کامل سلول مخمر می شود Rosin & Zimmermanمشاهده کردند که اعمال فشار هیدرواستاتیک از بالا تر از 100 مگاپاسکال سبب تخریب ساختمانهای حیاتی سلول Saccharomyces cerevisiae می گردد و فشارهای بالاتر از 150 مگاپاسکال باعث آسیب به غشاء و ساختار پروتئینیهای مخمر و بالاخره مرگ سلول می گردد .[19]
Knorr و همکاران کاهش تعداد سلو لهای مخمر فشار به بالا نشان 100MPa ساکارومایسس را از مقادیر دادند .[20]
شکل 1 اثر فشار ایزواستاتیک بر تعداد سلولهای مخمر
با افزایش زمان و میزان فشار تعداد سلولهای مخمر دچار کاهش قابل ملاحظه ای شدند. در 5 دقیقه اعمال فشار 125 مگا پاسکال کاهش تعداد سلول مشاهده می شود اما نه به اندازه یک چرخه لگاریتمی اما با افزایش زمان اعمال فشار به 10 و 15 دقیقه این کاهش به اندازه یک چرخه لگاریتمی بوده است(شکل2)
شکل 2 اثرمتقابل میزان و زمان اعمال فشار بر رشد سلولهای مخمر
Gould و همکاران یکی از موارد عمده مرگ میکروارگانیزمها را نگهداشتن آنها تحت فشار بر شمردند 21)و (22غیرفعال شدن سلو لهای مخمر با افزایش زمان اعمال فشار نیز توسط سایر محققان ثابت شده است و به مانند فرآیندهای معمول حرارتی با افزایش زمان اعمال فشار مقاومت بسیاری از میکروارگا نیزمها درمقابل فشار کاهش یافته و غیرفعال می شوند 23] و [24شدت اعمال فشار عامل بسیار موثر در کاهش تعداد سلولها در هنگام نگهداری سلو لهای میکروبها تحت فشار می باشد. بعضی از محققین معتقدند که سلولهای مخمر در فشارهای پایین (کمتر از 60 مگاپاسکال)حتی به مدت یک ساعت کاهش قابل ملاحظه ای ندارند ندارند اما با افزایش فشار در زمانهای 5 دقیقه و کمتر)150 مگا پاسکال به بالا (غیر فعال می گردند در صورت اعمال فشار 250 مگا پاسکال بیشتر از 90 درصد سلو لهای مخمر غیرفعال شدند [ 25 ].
اعمال فشارهای 50 و 75 مگا پاسکال هیچگونه تاثیر ی بر تو لید دی اکسید کربن توسط مخمر نداشته اند اما در فشار 100مگا پاسکال فعالیت متابولیکی و در نتیجه میزان تولید دی اکسید کربن آن افزایش یافته است و این مساله می تواند به علت واکنش قابل ملاحظه ای مخمر به صورت تشدید فعالیت متابولیکی و آزاد ساختن آنزیم در این میزان فشار باشد.
در شکل( 3) مشاهده می شود تعداد سلو لهای مخمر کاهش یافته اما فعالیت مخمر در دامنه این فشار افزایش یافته است.
افزایش قابل ملاحظه ای در تولید دی اکسید کربن و Mpa 100 در مدت 10 و 15 دقیقه اعمال فشار به وجود آمده و بطور کلی بالاترین میزان دی اکسید کربن در فشار Mpa 100 بوده است و زمان اعمال فشار بین 5 تا 15 دقیقه با یکدیگر فاقد اختلاف معنا دار آماری هستند.
شکل 3- اثر میزان فشار بر تولید دی اکسید
اما اعمال فشار در 15 دقیقه سبب کاهش تولید دی اکسید کربن توسط مخمر شده است و فشار های کمتر از 100MPa اثر قابل ملاحظه ای در فعالیت متابولیسمی مخمر و تولید دی اکسید کربن نداشته است . هم چنین بر اثر اعمال فشار بالاتر از 100مگا پاسکال به میزان 125 و 150 مگا پاسکال میزان تولید دی اکسید کربن توسط مخمر به مقدار قابل ملاحظه ای کاهش نشان می دهد اما هیچگونه اثر معنا داری بین زمانهای اعمال فشار 125 و 150 مگا پاسکال مشاهده نمی شود)شکل (4.
شکل 4 میزان و زمان اعمال فشار بر تولید دی اکسید کربن توسط مخمر
میزان فعالیت آنزیمی در فشارهای 50 و 75 مگا پاسکال برابر فعالیت آنزیمی نمو نه های شاهد می باشد اما در صورت اعمال فشار100MPa فعالیت آنزیمی افز ایش یافته در فشارهای بالاتر یعنی125 MPa و 150 مجدداً کاهش نشان150 به حداقل MPa می دهد بطوریکه فعالیت آنزیمی درمقدارنسبت به شاهد می رسد)شکل( 5.
شکل 5 اثر میزان فشار بر فعالیت آنزیمی مخمرS.cerevisiae
اعمال فشار در مقادیر مختلف و زمانهای 5و 10 و 15دقیقه بر فعالیت آنزیمی مخمر نشان می دهد که بالاترین فعالیت آنزیمی مربوط به اعمال فشار 100MPa در 10 و 15 دقیقه فشار می باشد و فشارهای بالاتر از این مقدار در زمانهای یاد شده کاهش قابل ملاحظه ای بر فعالیت آنزیمی مخمر دارد .
فشارهای 40-60 مگاپاسکال سبب کاهش pH واکوئل در حدود 0/33 واحد می شود و این کاهش pH در حضور گلوکز صورت می پذیرد pH سیتوپلاسم سلول نیز تمایل به کاهش نشان می دهد که نقش مهمی در فعالیت حیاتی سلول خواهد داشت . اسیدی شدن سیتوپلاسم در دامنه کمتر از100MPa ادامه می یابد که ظاهراً سبب واکنش و تحریک ترشحات متابولیکی مخمر می گردد . در شکل ( 6 ) مشاهده می شود اعمال فشار ایزواستاتیک تا مقادیر کمتر از 75 پاسکال اثر چندانی بر فعالیت آنزیمی ندارد.
اما با افزایش شدت و نیز زمان اعمال فشار از 75 مگاپاسکال تا 100MPa فعالیت آنزیمی افزایش می یابد و مجدداً در فشار125 Mpa و 150 کاهش نشان می دهد. آمار و ارقام به دست آمده نشان می دهد که فشار ایزواستاتیک در تنظیم فعالیت و ثبات برخی از آنزیمها نقش دارد فشار می تواندعملکرد هیدرولیتیکی آنزیمها را از طریق تغییر مسیر تنظیم سرعت و یا از طریق تنظیم قابلیت انتخابی آنزیم اصلاح نماید . افزایش ثبات آنزیمها در برابر دناتوراسیون ناشی از اعمال فشار اهمیت زیادی در فعالیتهای بیولوژیکی جهت تغییر و تبدیل آنزیمی در فشار بالا دارد [2]
شکل 6 اثر زمان وفشار بر فعالیت آنزیمی
اعمال فشار در مقادیر مختلف و زمانهای10, 5 و 15 دقیقه بر فعالیت آنزیمی مخمر نشان می دهد که بالاترین فعالیت آنزیمی مربوط به اعمال فشار100MPa در 10و15 دقیقه فشار می باشد و فشارهای بالاتر از این مقدار در زمانهای یاد شده کاهش قابل ملاحظه ای بر فعالیت آنزیمی مخمر دارد فشارهای40 – 60 مگا پاسکال سبب کاهش pH در حدود 33/0 واحد می شود و این کاهش واکوئل pHدر حضور گلوکز صورت می پذیرد.
pH سیتوپلاسم سلول نیز تمایل به کاهش نشان می دهد که نقش مهمی در فعالیت حیاتی سلول خواهد داشت . اسیدی شدن سیتوپلاسم در دامنه کمتر از 100Mpa ادامه می یابد که ظاهرا سبب واکنش و تحریک ترشحات متابولیکی مخمر می گردد.
3-2مشاهدات با میکروسکوپ الکترونی
بررسی اثر فشار ایزواستاتیک بالا بر ساختمان و ریخت شناسی سلول مخمرتوسط میکروسکوپ الکترونی نشان می دهد که به تدریج با افزایش فشار طول سلول مخمر افزایش می یابد ودر مقایسه با سلو لهای شاهد این تغییر ریخت شناسی کاملا مشهود است . شکل ( 7) تصویر سلو لهای مخمر را در حالتی که هیچگونه فشاری بر آنها وارد نشده است نشان می دهد . بطوریکه ملاحظه می گردد از نظر ریخت شناسی سطح سلولها صاف و تخم مرغی شکل بوده و هیچگونه آثار ناشی از اثر عوامل خارجی بر سلول مشاهده نمی گردد .
مطابق شکل ( 8) فشار 50 مگا پاسکال در مدت 15 دقیقه توانسته است اندکی تغییرات در بعضی از سلو لهای مخمر ایجاد نماید. این تغییرات شامل افزایش طولی ودربعضی بزرگ شدگی سلول می باشد که این تفاوتی که در عکس العمل سلو لها نسبت به فشارکه در این دامنه ظاهر می شود احتمالا به دلیل اختلاف در زمان تقسیم سلولی می باشد شکل 8 تصویر میکروگراف الکترونی را 24 ساعت پس از اعمال فشار50Mpa و نگهداری در 4C°نشان می دهد. هم چنین یک نوع تجمع سلولها ناشی از تنش ایجاد شده بر اثر فشار دیده می شود .در بعضی از سلولها ی تیمار شده در فشار 75 مگا پاسکال تغییرات سطحی در دیواره سلول مخمر کاملا قابل مشاهده است.
شکل 7 سلولهای مخمر
Saccharomyces cerevisiaeسالم
و بدون اعمال فشار (شاهد)
به علاوه همانطور که در شکل ( 9) مشاهده می شود تجمع سلولی بیشتر شده است به طوری که کناره های دیواره سلولی مخمر فرو رفتگی هائی با اشکال منظم ویا نامنظم هندسی به خود گرفت ه اند. که در تصویر میکروگراف الکترونی 24 ساعت پس از اعمال فشار 75Mpa قابل مشاهده است .
شکل(10) تصویر میکروگراف الکترونی را براثر اعمال فشار در 100 MPa نشان می دهد در فشار 100 مگاپاسکال دیواره سلولی در برابر فشار نتوانسته است مقاومت کند و به طرف داخل فرو رفتگی عمیقی ایجاد شده است و به نظر می رسد که به علت تشدید فعالیت متابولیکی مخمر براثر واکنش شدید سلو لها در مقابل این دامنه فشار می باشد . می توان گفت که تقریبا کلیه سلولها تحت تاثیر فشار 100 مگا پاسکال دچار تنش شدید شده اند. ایجاد تغییرات در فشارهای 125و 150 مگا پاسکال به قدری شدید شد ه اند که منجر به غیر فعال شدن و نابودی کامل سلو لهای مخمر شده است ، و کاهش فعالیت متابولیکی آن شاید به دلیل غیرفعال شدن اکثر فعالیتهای حیاتی سلول مخمر باشد و به نظر می رسد شکلهای11) و (12
شکل 8 سلولهای مخمر S. cerevisiae
شکلهای (10و11)تصاویر میکروگراف الکترونی را اعمال فشار 150 MPa و 125 نشان می دهد . در فشارهای 125 و 150 محتویات سلولی مخمر دچار تغییرات شده و به خارج از سلول سرازیر می شوند که نتیجه آن کاهش فعالیت متابولیسمی وبالاخره نابودی مخمر می باشد . این نتایج توسط دیگر محققین نیز تایید شده اند (27)
بررسی اثرات فشار برسلول مخمر پس از یک ماه نگهداری در4C° توسط میکروسکوپ الکترونی :
مشاهدات میکروسکوپی با میکروسکوپ الکترونی پس از یک ماه نگهداری در حرارت یخچال نشان می دهد که سلو لهای مخمر در فشارهای 50 و 75 مگا پاسکال نسبت به شاهد چندان تغییری نمی کنند (اشکال (14,13 اما کلیه سلو لهای مخمر تیمار شده درفشارهای 100MPaو 125MPa به بالاپس از یک ماه به طور کلی نابود شده و از بین می روند (اشکال 15 و (16 این نتایج از دو جنبه دارای اهمیتند.
الف : اعمال فش ارهای بیش از 100 MPa نه تنها مفید نیستند بلکه سبب نابودی کامل مخمر ها در دراز مدت می گرددکه نتیجه آن تغییرات مضر وشدید درون سلولی می باشد و فشارهای کمتر از این مقدار تاثیر چندان مضری ندارند .[28]
ب: با استناد به این نتایج و تخقیقات تکمیلی می توان امیدوار بود که با استفاده از فشارهای نه چندان بالا و در دامنه 125 و 150MPa که هیچگونه تغییر محسوسی در کیفیت مواد غذائی ند ارند و به علاوه هزینه چندان گرانی را در بر ندارند و می توان سلولهای مخمر را درفرآورده هائی نظیر آب میوه که مضر شناخته می شوند غیر فعال نمود28] و [29
بطور کلی می توان نتیجه گرفت که اعمال فشارهای پائین و متوسط)کمتر از 100 مگاپاسکال (بیشتر سبب تحریک سلولهای مخمر شده و بر اثر تحریک واکنش های متابولیکی، تقسیم سلولی و ساختار فیزیولوژیک سلول دچار تغییراتی می گردد که از جمله اسیدی شدن سیتوپلاسم و واکوئل ، اختلال و یا تحریک تقسیم سلولی، ایجاد جهش و بالاخره تحریک ترشح بیشتر متابولیتها و در نتیجه تشدید فعالیت آنزیمی مخمر ساکارومایسس می گردد .
این تغییرات در حضور بعضی از افزودنیها نظیر قندها، پلی اولها و یا ترکیبات غنی کنند.
یا بازدارنده به صورت متفاوتی اتفاق می افتد28) و (29مثلا" حضور قندها اثر محافظت کنندگی روی پایداری آنزیمها دارد از طرف دیگر فشارهای 50 مگاپاسکال و کمتر تاثیر چندانی روی این قبیل واکنش ها ندارند لذا می توان امیدوار بود که با اعمال فشار و تحریک سلولهای مخ مر در محیط های مختلف سبب ایجاد جهش و افزایش فعالیت آنزیمی شده که استفاده از سو یه ها ی تیمار شده و یا جهش یافته در افزایش راندمان تولید فرآورده های تخمیری و نانوائی نقش به سزائی خواهند داشت . البته انجام تحقیقات بیشتر به خصوص در مدلهای واقعی غذائی و بررسی فعا لیت آنزیمی در حضور مواد افزودنی برای اطمینان از حصول نتایج لازم است.
-4 نتیج گیری کلی
استفاده از فناوریهای نوین از جمله اعمال فشارهای بالا سبب تحولات اساسی در بعضی از فرآیندهای مواد غذائی از جمله سالم سازی غیرحرارتی، بهبود ویژگیهای کیفی، بافتی و ارزش تغذیه ای مواد غذائی می گردد . از طرف دیگر ، فشارهای پائین و متوسط قادرند موجب تحریک بعضی از میکروارگانیزمها شده و در آنها ایجاد تنش نموده که در نتیجه فعالیتهای متابولیکی را افزایش دهند. سلولهای مخمر ساکارومایسس که دارای ارزش تجاری بسیار زیادی در تولید فرآورده های تخمیری و صنایع پخت هستند تحت اثر اعمال فشارهای 50 و 75 مگاپاسکال بدون تغییر می مانند اما فشار 100 مگاپاسکال تنش زیادی در این سلولها ایجاد کرده و آنها را واداریه ترشح بیشتر آنزیم نموده که افزایش فعالیت نسبی مخمر را در مقایسه با سلولهای شاهد نشان می دهد.
اما افزایش فشار در مقادیر 125 و 150 مگا پاسکال مجدداً سبب کاهش فعالیتهای حیاتی مخمر شده وعلاوه بر کاهش فعالیت آنزیم تغییرات ساختمانی از جمله فرورفتگیهای دیواره سلول و حتی در بعضی موارد پارگی دیواره و غشاء سلولی رابه دنبال داشته است . همچنین با افزایش زمان نگهداری تغییر چندانی در سلولهای تحت فشار قرار گرفته در فشارهای کمتر 100MPa مشاهده نشد. اما فشارهای بالاتر از این مقدار سبب نابودی کامل آنها می گردد.
با بررسی کلی نتایج طرح می توان امیدوار بود که با اعمال فشار در دامنه بین 50 تا 100 مگاپاسکال بتوان فعالیت آنزیمی مخمر و در نتیجه بهره وری آن را در مقیاس تجاری افزایش داد . معذالک مسائلی از قبیل برگشت فعالیت به حالت اولیه بر اثر گذشت زمان و نیز تغییرات درونی سلولی مخمر که منجر به نابودی آنها می شودجزو تحقیقاتی است که در آینده بایستی صورت گیرند.
فرآوری مواد غذایی با استفاده از فشار هیدرواستاتیک بالا
((HPP) High Pressure Processing )
فناوری فشار بالا،به علت غیر فعال کردن میکروارگانیسم ها و همچنین تولید محصولاتی با کیفیت بالا اهمیت خاصی در صنایع غذایی پیدا کرده است. در ابتدا فناوری فشار بالا در تولید انواع سرامیک،استیل و آلیاژهای خاصی مورد استفاده قرار می گرفت. در دهه گذشته،فناوری استفاده از آن در صنایع غذایی نیز گسترش یافت.
تولید فشار بالا:
در صنایع فلزی و سرامیک از مخازن تحت فشاری که تحمل فشارهای بالا را دارند استفاده می شود. البته،در صنایع غذایی تجهیزاتی مورد نیازند که تحمل فشارهای بسیار بالاتر یعنی تا حدود4000 اتمسفر را داشته باشند.
فشار بالا را می توان به روشهای ذیل تولید نمود:
1-) تراکم مستقیم با فشردن ماده ناقل فشار در پیستونی که قطر قسمت انتهایی آن کم می باشد.انتهای قطر پیستون توسط یک پمپ کم فشار به حرکت در می آید. در این روش تراکم بسیار سریع صورت می گیرد،اما محدودیتهای ارتباط دینامیکی فشار بالا بین پیستون و سطح داخلی مخزن کاربرد این روش را در سیستمهای نیمه صنعتی و آزمایشگاهی با مشکل مواجه می کند.
2-) درتراکم غیر مستقیم از یک تشدید کننده فشاربالا برای انتقال ماده ناقل فشار از یک مخزن به مخزن بسته تحت فشار بالا استفاده می شود تا اینکه فشار به مقدار دلخواه برسد. در اکثر سیستمهای صنعتی فشاردهی ایزواستاتیک،از روش تراکم غیر مستقیم استفاده می شود.
3-) با حرارت دادن ماده ناقل فشار درجه حرارت آن افزایش یافته،منبسط شده و فشار زیادی تولید می شود. بنابراین، حرارت دادن ماده ناقل فشار زمانی انجام می شود که همزمان از فشار بالا و درجه حرارت زیاد استفاده گردد. در این روش کنترل دقیق درجه حرارت در تمام حجم داخلی مخزن تحت فشار ضروری است.
شرح فرآیند * طرز کار مخزن فشار بالا
در این سیستم ابتدا ماده غذایی در یک ظرف استریل پر می شود وپس از محکم شدن درب آن در مخزن فشار قرار می گیرد تا فشار مورد نظر اعمال گردد. لفافی که برای بسته بندی مواد غذایی فرآوری شده در فشار بالا توصیه می شود کوپلیمر اتیلن و وینیل الکل و پلی وینیل الکل می باشد.
از آنجا که فشار اعمال شده یکنواخت است،بسته بندی تغییر شکل پیدا نمی کند. پس از آنکه مخزن از مواد غذایی بسته بندی شده پر شد ودرب آن مسدود گردید ماده ناقل به داخل آن تزریق می شود. دراغلب سیستمهای متداول ماده ناقل فشار آب می باشد که به منظور ایجاد حالت لغزندگی وضدخورندگی آن را با مقدار کمی روغن مخلوط می کنند.
اساس استفاده از فشارهای بالا در فرآوری مواد غذایی متراکم نمودن آب اطراف آنها می باشد. در دمای اتاق حجم آب در فشار 1000 اتمسفر تا 4%، در فشار 2000 اتمسفر تا 7%، درفشار4000 اتمسفر تا 11.5%و در فشار 6000 اتمسفر تا 15% کاهش می یابد.از آنجا که متراکم کردن مایعات تغییرات حجمی کمی در آنها ایجاد می کند، خطرات ناشی از مخازن فشار بالایی که در آنها از آب استفاده می شود کمتر از مخازنی است که در آنها از گاز متراکم استفاده می گردد.
در این روش ماده غذایی به مدت مشخصی تحت فشار بالا قرار می گیرد. زمان نگهداری ماده غذایی در مخزن تحت فشار به نوع ماده غذایی و درجه حرارت فرآیند بستگی دارد. در پایان زمان فرآوری،فشار داخل مخزن حذف می شود تا مواد فرآوری شده خارج گردند. سپس بخش دیگری از ماده غذایی در مخزن فشار قرار می گیرد واین چرخه تکرار می گردد.
به لحاظ مهندسی،معایب استفاده از فشار بالا در صنایع غذایی به طور عمده مربوط به ساخت مخازن تحت فشار جهت فرآوری مقادیر زیاد مواد غذایی و نیز تحمل فشار بالا می باشند. تمیزکردن دستگاه باید ساده و کار کردن با آن بدون خطر باشد. همچنین،دستگاه باید مجهز به سیستمهای کنترلی دقیق باشد.
اثرات بیولوژیکی فشار بالا
مطالعه اثر فشار بر موجودات زنده،بیولوژی فشار(باربیولوژی) نامیده میشود.همچنین به فشارهای بالاتر از فشار اتمسفر فشار بالا گفته می شود.فشار بالا تغییرات زیادی در سیستمهای بیولوژیکی،غشای سلولی و دیواره سلولی میکروارگانیسمها به وجود می آورد. به طور کلی باکتریهای گرم منفی نسبت به باکتریهای گرم مثبت در فشارهای پایین تری غیر فعال می شوند.
اثر فشار بالا برمیکروارگانیسمها
الف)تغییرات مرفولوژیکی:
اکثر باکتریها می توانند تا فشارهای 300-200 اتمسفر رشد کنند.میکروارگانیسمهایی که قادرند در فشارهای بالاتر از 500-400 اتمسفر رشد کنند" باروفیل"، میکروارگانیسمهایی که در فشار بالاتر از 400-300 اتمسفر قادر به رشد نبوده ویا رشد کمی دارند" باروفوب" نامیده می شوند.
توقف حرکت
اکثر باکتریهای اگر به مدت طولانی در معرض فشار400-200 اتمسفر قرار گیرند،قابلیت حرکت خود را از دست می دهند.Escherichia coli ، Vibrio وPseudomonas در فشار 100 اتمسفر فلاژلهای خود را حفظ می کنند، اما در فشار 400 اتمسفر آنها را از دست می دهند. از بین رفتن تحرک در بعضی از باکتریها برگشت پذیر است.
ب) غیر فعال شدن میکروارگانیسمها و اسپورها
درفرآیند HPP غیر فعال کردن میکروارگانیسمهای رویشی بدون تخریب عطر،طعم،بافت،رنگ و ترکیبات مغذی صورت می گیردو فشار به تمام قسمتهای فرآورده غذایی به طور یکسان منتقل می شود. اگر فشار به کاربرده شده به اندازه کافی باشد، تمام سلولهای رویشی میکروارگانیسم و اسپورها غیرفعال می شوند.
اثرات شیمیایی و میکروبیولوژیکی HPP به فاکتورهایی وابسته است، مهمترین آنها مربوط به دما و زمان است. باکتریها در مقابل فشارمقاومتهای متفاوتی از خود نشان می دهند. معمولا باکتریهای گرم منفی مقاومت کمتری نسبت به باکتریهای گرم مثبت در برابر فشار دارند. Staphylococcus aureus مقاومت بسیار زیادی نسبت به فشار بالا دارد، همچنین "اسپورهای کلستریدیوم" مقاومت زیادی به فشار دارند. ترکیب روش HPP با حرارت ملایم، به عنوان مثال فشار
atm700-500 و دمای o c110-90 اسپورهای Cl.botulinum را غیرفعال می کند،همچنین HPP در غیرفعال کردن میکروارگانیسم درPH اسیدی موثرتر است. کپک و مخمرهای مولد فساد،در کمتر از چند دقیقه تحت فشار atm400 غیرفعال می شود،هر چند این فرآیند برای کاهش مایکوتوکسین هایی مثل پاتولین کافی نیست.
اسپورها در فشار بالا جوانه زده و به سلول رویشی تبدیل می شوند و در مرحله بعد سلولهای رویشی غیر فعال می گردند. در درجه حرارتهای پایین، فشار کم باعث جوانه زنی و حساس شدن به حرارت می شود، اما اسپورهای جوانه زده در حد ناچیزی غیرفعال خواهند شد.
پدیده غیرفعال شدن اسپورها در فشارهای زیاد به شدت تحت تاثیر درجه حرارت و به میزان کمتری تحت تاثیرpH،فعالیت آبی و قدرت یونی قرار دارد. درجه حرارت بهینه برای آغاز جوانه زنی اسپورها در فشارهای مختلف متفاوت است. اسپورها در حدود pH خنثی بیشتر و درpH های اسیدی و قلیایی، به میزان کمتری غیرفعال می شوند. شرایط بهینه جوانه زنی اسپورها در اثر فشار در حدود pH خنثی است. حلالهای غیر یونی با فعالیت آبی کم اثر کمی بر میزان غیرفعال شدن اسپورها به وسیله فشار دارند در حالیکه حضور حلالهای یونی نظیر نمک طعام سرعت غیر فعال شدن را کاهش می دهد. اکثر اسپورها در غیاب یونهای غیر آلی در اثر فشار جوانه نمی زنند. یونها ممکن است بر تجزیه آنزیمی پپتیدوگلیکان در حین جوانه زنی اثر بگذارند. اثر یونهای هیدروژن،پتاسیم،منگنز،کلسیم،منیزیم،سدیم بر جوانه زنی تحت فشار به ترتیب کاهش میابد. همچنین،حضور یونها سبب افزایش حساسیت حرارتی اسپورها در محلولهای بافر نسبت به محلولهای آب مقطر در همان فشار و دما می شود.
عوامل موثر بر غیر فعال شدن میکروارگانیسمها در فشار بالا
غیر فعال شدن میکروارگانیسمها در فشار بالا بهpH ،ترکیب،فشار اسمزی ودرجه حرارت محیط بستگی دارد. فشار بالا pH محیط را تغییر می دهد که عامل تشدید کننده غیرفعال شدن میکروارگانیسمها می شود. حساسیت باکتریها به فشار بالا در محلول نمکهای معدنی و محیطهای مغذی بیشتر می شود. با افزایش فشار حساسیت باکتریهای باروفیل به فشار اسمزی بالا زیاد می شود.
فشار بالا در درجه حرارت متوسط اثر سینرژیستی دارد. افزایش فشار غیرفعال شدن میکروارگانیسمها در دمای بالا به تاخیر می اندازد. در دمای 46.9 درجه سانتیگراد سرعت غیرفعال شدن سلولهایE.coli در فشار 400 اتمسفر کمتر ازفشار 1 اتمسفر است. اسپورها هنگامی که در دمای 30 درجه سانتیگراد در فشارهای 1000-600 اتمسفر قرار می گیرند طی چند دقیقه یا چند ساعت غیرفعال می شوند،اما در درجه حرارت پایین تر وتحت همان فشار به مدت چندین ماه زنده می مانند.
فشار بالا همچنین سبب فعال یا غیر فعال شدن آنزیمها میشود. فعالیت سوکسینات دهیدروژنازها ، فورمات ومالات درE.coli ، با افزایش فشار کاهشمیابد.
استفاده و تاثیر مشخص وبارز این روش در غیرفعال کردن میکروارگانیسمهای پاتوژن آنزیمها درآبمیوه ها،خصوصا آب سیب وپرتقال می باشد. اثرگذاری این تیمار روی فعالیت پلی فنل اکسیداز درآب سیب وپکتین استراز درآب پرتقال مشخص می باشد. فعالیت پکتین استراز باقیمانده در آب پرتقال در شرایط فشار450 اتمسفر، دمای 50 درجه سانتیگراد ودر زمان 30دقیقه حدود 7% اندازه گیری شده که در مقایسه با 12% در شرایط فشار 450 اتمسفر،دمای 40 درجه سانتیگراد وزمان 60 دقیقه نتیجه مطلوب ومناسبی است. همچنین فعالیت پلی فنل اکسیداز در آب سیب پس از تیمار درفشار450 اتمسفر،دمای 50 درجه سانتیگراد و زمان 60 دقیقه حدود 9%محاسبه شده است.
ایزوآنزیمهای مقاوم به فشار عامل فعالیتهای پس از فرآیند فشار هستند. غیر فعال کردن آنزیمها در این روش برگشت ناپذیر است وآنزیمها دردوره نگهداری نمی توانند دوباره فعال شوند.
HPP به عنوان تکنولوژی سودمندی برای غیرفعال کردن آنزیمها درآبمیوه ها ثبت گردیده، فشار بالاتر از400 اتمسفربا حرارت ملایم کمتر از 50 درجه سانتیگراد همراه شده ودر نتیجه غیرفعال کردن آنزیمها تسریع یابد. تاثیرHPP در سرعت ومیزان دناتوراسیون برگشت ناپذیر آنزیمها به ترکیب وساختار آنزیم، pH، فشارودما بستگی دارد
استفاده از فشار بالا در فرآوری مواد غذایی
از فرآوری در فشار بالا می توان برای افزایش زمان نگهداری موادغذایی،انجماد زدایی موادغذایی منجمد ونگهداری مواد غذایی بدون استفاده از انجماد استفاده نمود. با استفاده از فشارهای مناسب ، میکروارگانیسمها ، اسپورها وآنزیمهای نامطلوب غیرفعال شده ودر نتیجه زمان نگهداری مواد غذایی افزایش می یابد.
اثر فرآیند HPP بر مواد غذایی مختلف:
میوه ها:
HPP می تواند رنگ طبیعی وشفاف،خصوصیات بافت وطعم طبیعی میوه ها را برای مدت طولانی حفظ کند.استفاده صحیح ودقیق این روش امکان فرآوری بسیاری از فراورده های میوه ای تازه را فراهم می کند، مانند قطعه های میوه در آبمیوه ، ژل میوه ای.آب گریپ فروتی که با این روش تهیه شود، فاقد طعم تلخ لیمونین خواهدبود که در فرآوری متداول حرارتی وجود دارد. اگر میوه هایی نظیر هلو و گلابی به مدت 30 دقیقه در فشار 4100 اتمسفر فرآوری شوند، حالت استریل خود را تا 5 سال حفظ خواهند نمود. طعم آب مرکباتی که بدون پاستوریزه شدن تحت تیمار فشار قرار گرفته اند همانند میوه تازه بوده و ویتامین C آنها حفظ می شود و تا 17 ماه قابلیت نگهداری دارند.
فرآورده های گوشتی:
اگر چه HPP در غیرفعال کردن باکتریهای مسمومیت زا مانند Listeria ،Salmonella و E.coli اثر قابل ملاحظه ای دارد،تاکنون صنعت گوشت در زمینه کاربرد HPP وسعت چندانی نیافته است. استفاده از HPP هزینه بالایی دارد ، همچنین HPP روی خواص حسی گوشت اثرگذار است واغلب باعث تسریع دناتوراسیون پروتینهای گوشت می شود.با این وجود استفاده از HPP در غذاهای آماده گوشتی مثل همبرگر وسالامی موفقیت آمیز بوده است.
فرآورده های لبنی:
فرآیند HPP،علاوه بر هزینه زیادی که دارد،در مورد تامین سلامت فرآورده لبنی قابل رقابت با فرآیند حرارتی نیست. HPP بیشتر در فرآوری پنیر،اصلاح حالت کف کنندگی،امولسیفیه کردن و اصلاح خصوصیات ژله ای شدن پروتینهای شیر استفاده می شود.
در انتها برای ارزیابی فناوری فشار بالا می توان گفت؛ مزیت عمده این روش غیر فعال شدن آنزیمها بدون تخریب مواد مغذی و تغییر طعم وبافت مواد غذایی می باشد،همچنین همراه با برخی اثرات مطلوب می باشد. واز محدودیت های آن،مشکل فنی نصب لوله های مقاوم به فشار بسیار بالا ،نیاز به سرمایه گذاری بالا و عدم کفایت این روش برای غیر فعال کردن برخی اسپورها می باشد.
Thank You !