میکروسکوپ هم کانون
CONFOCAL Mic
فهرست مطالب
مقدمه
اصول کار میکروسکوپ
بررسی عملکرد میکروسکوپ
عکس ها یی که به وسیله ی میکروسکوپ گرفته شده
کاربرد های میکروسکوپ
مقدمه
میکروسکوپی لیزری هم کانون ابزاری مفید برای بازسازی سه بعدی و بدست آوردن تصاویر سه بعدی با کیفیت بالاست. خصوصیات کلیدی میکروسکوپی هم کانون توانایی آن در ایجاد تصاویر بدون کدورت از نمونه ها ی ضخیم در عمقهای مختلف است. اصول این نوع خاص از میکروسکوپی توسط ماروین مینسکی در سال1953 کامل شد اما هنوز سی سال دیگر زمان لازم بود تا لیزر بتواند بعنوان یک منبع نور نقطه ای برای میکروسکوپی هم کانون و بعنوان روشی استاندارد در اواخر دههٔ 1980 مورد استفاده قرار بگیرد.
اصول کار میکروسکوپ
دواصل وجود دارند که اساس کارمیکروسکوپ بر انها قرار دارد:
(1نمونه توسط پرتو بسیار کوچکی از نور روشن می شود (درحالی که در میکروسکوپ نوری معمولی پرتو بزرگی از نور را در بر می گیرد)
2)تصویر جمع اوری شده از نمونه باید از درون یک روزنه ی کوچک بگذرد .نتیجه ان که فقط تصویر حاصل از سطح به کانون در امده ،به ابزار کشف کننده میرسد در حالی که تصویر حاصل از مناطق جلو یا پشت این سطح متوقف می شود .درخشش(نوردهی)مضر اشیا ی خارج از کانون از میان می رود و شی به کانون در امده ،از وضو ح بهتری برخوردار و امکان ان فراهم می شود که موقعیت هر بخش از نمونه با دقتی بسیار بیش از ان چه از میکروسکوپ نوری معمولی به دست می اید تعیین شود
بررسی عملکردمیکروسکوپ
در بیشتر میکروسکوپ های هم کانون ترتیب زیر به کار میرود:
1)نورپردازی توسط یک منبع لیزری تامین می شود
2)آن جا که این منبع یک نقطه بسیار کوچک است. باید برروی نمونه حرکت داده (اسکن)شود تا امکان مشاهده منطقه وسیع تری از نمونه فراهم شود.
3)بخشی از نمونه که مورد بررسی قرار دارد،باید توسط یک ملکول فلوئور سانس نشان دار شود.(این بدان معنا است که برش معمولی نمی تواندبه این روش مورد بررسی قرار گیرد)
4)نوری که توسط نمونه انعکاس می یابد، برای تشکیل یک تصویر مورد استفاده قرار می گیرد.
5)نور منعکس شده توسط یک ابزار کشف شده(دتکتور)گرفته می شود،به نحوی که سیگنال حاصله می تواند به طریق الکترونیکی تقویت شودتا روی یک نمایشگر (monitor)مشاهده شود.
در اسکن میکروسکوپی لیزری هم کانون یک پرتو لیزری از روزنهٔ منبع نوری گذشته و سپس توسط عدسی های شیئی به حجم کانونی کوچکی بر روی یک نمونهٔ فلورسانت متمرکز می شود. سپس مخلوطی از نور فلورسانت تابیده شده و لیزر بازتابیده شده از نقطهٔ مورد تابش قرار گرفته ،توسط عدسی های شیئی جمع آوری می شود. یک جدا کنندهٔ طیفی مخلوط نور را با گذر انتخابی نور لیزری و بازتاباندن نور فلورسانت به دستگاه جداساز از هم مجزا می کند. پس از گذر این نور، نور فلورسانت توسط یک وسیلهٔ جدا کنندهٔ نور( لولهٔ تشدید کنندهٔ نور و یا دیود بهمن نوری) باعث تغییر سیگنال نوری به یک سیگنال الکترونیکی شده که در مرحلهٔ بعد این . سیگنال الکتریکی توسط رایانه قرائت می شود
روزنهٔ جداساز از ورود نور به اصطلاح تنظیم نشده یعنی نور فلورسانسی که از سطح کانونی عدسی های شیئی منشاء گرفته ممانعت به عمل می آورد. پرتوهای نوری از زیرسطح کانونی قبل از رسیدن به جداساز متمرکز می گردند و بخش عمده ای از آنها بواسطهٔ متمرکز نبودن بر روزنهٔ جداساز حذف می گردند و بقیهٔ پرتو ها به جداساز میرسند. در این روش بخش خارج از کانون قسمت بالا و پایین به میزان زیادی کاهش میابد که نهایتا باعث تشکیل تصویری واضح تر نسبت به روش های میکروسکپی سنتی می گردد. نور جداسازی شده ای که از بخش نورانی نمونه منشاء گرفته در تصویر حاصله بشکل یک نقطه نمایش داده می شود. بنابراین تصویر نهایی ردیف به ردیف و نقطه به نقطه تشکیل می گردد و درخشش نهایی تصویر حاصله با شدت نور جداسازی شدهٔ فلورسانت مطابقت خواهد داشت.
. پرتو سرتاسر نمونه را بشکل صفحه های افقی و با استفاده از آینه های نوسانگر خود مهار شونده اسکن می کند. این روش اسکن( پویش) کردن معمولا امکان ایجاد واکنشهای نهفتهٔ کمتری دارد و با کم شدن سرعت آن نسبت قابل قبول تری از سیگنال به خطا را نتیجه می دهد و نهایتا تباین و کیفیت بالاتری نتیجه می دهد. اطلاعات لازم را می توان با صفحه های کانونی متعدد و با تغییر سطح میکروسکوپ به سمت بالا و پایین بدست آورد. رایانه می تواند یک تصویر سه بعدی از نمونه را بوسیلهٔ سری زدن تعداد زیادی از تصاویر دو بعدی متوالی ایجاد کند
بعلاوه میکروسکوپی کانونی پیشرفت زیادی را در کیفیت نهایی و ظرفیت برش نوری سری مناسب فراهم کرده که این امر حتی در نمونه های زندهٔ با حداقل آماده سازی قابل مشاهده است. با توجه به اینکه این روش وابسته به فلورسانس است، نمونه ها معمولا بایستی با رنگهای فلورسانس رنگ آمیزی شوند. با اینحال بایستی توجه کرد که غلظت مواد خارجی به حدی کم باشد که بر روی ساز و کار طبیعی زیستی تاثیر منفی نگذارد. برخی ابزار ها حتی قادر به ردیابی یک ملکول خاص فلورسانس نیز میباشند. همچنین روشهای ترنس ژنیک می توانند ارگانیسمهایی را بوجود بیاورند که خودشان ملکول فلورسانس تولید کنند.(مثل پروتینهای سبز فلورسانت)
عکس هایی که با استفاده از میکروسکو پ هم کانون
گرفته شده
کورتکس مغز یک موش صحرایی با پایانه های آستروسیتها (رنگ زرد) در اطراف رگهای خونی (رنگ قرمز) و هسته های سلولی (رنگ آبی).
چشمها و بام نوری یک نوزاد ماهی زبرا (راه راه) حامل یک جهش ژنتیکی که موجب شده است آکسونهای رتین در لُب بویایی قرار گیرند.
تقسیم سلولی و بیان ژن ها در گیاهان: این ریزنگاری هم کانون ظهور پروتئین های متعددی را در جوانه شاهی گوش موشی نشان می دهد. ژنوم این گیاه با نام علمی Arabidopsis thaliana اولین ژنوم گیاهی است که به طور کامل شناخته شده و یک الگوی مهم برای شناخت بیولوژی گیاهی به شمار می رود. بخش مرکزی تصویر ناحیه تکثیر سریع سلولی را نشان می دهد که عامل رشد جوانه و تولید برگ های تازه است.
شبکیه چشم موش: این ریزنگار هم کانون شبکیه چشم را در یک موش یک ماهه نشان می دهد. این بخش قسمت حساس به نور چشم است. برای تهیه این تصویر بزرگ و واضح از شبکیه 6 عکس کوچک تهیه و به دقت ادغام شده اند. پس از آن تصویر قرینه سازی شده تا این بخش از چشم را به خوبی به نمایش بگذارد
تصویر واقعی از سلول های نگهبان روزنه با میکروسکوپ هم کانون کلروپلاست ها قرمز و رشته های سلولزی ( شعاعی ) سبز
کاربرد های میکروسکوپ
به عنوان نمونه یکی از ابزارهای مهم تشخیص، میکروسکوپ لیزری هم کانون (Confocal) است که می تواند مراحل اولیه تغییرات در شبکیه را آشکار کند. به کمک این تکنیک، جدائی لایه داخلی شبکیه از اپی تلیوم پیگمانته و همچنین گلوکوم (Glaucoma) یا آب سیاه می تواند زودتر از موعد و در زمانی که می توان درمان موثر انجام داد، تشخیص داده شود
تشخیص سرطان، مطالعات و تحقیقات در زمینه های سرطان و کلیه زمینه های مربوط به بایولوژی و متالورژی کاربرد دارد
.