روش های جداسازی و تفکیک سلولها
کاربرد جداسازی سلول ها :
HLA – Typing
WBC Cross – match (Screening for Alloantibodies)
LTT (Lymphocyte Transformation Test)
Rosette (B & T)
CH50
RIA
Culture
Cloning
PCR
روش های جداسازی سلولها:
روش های غیراختصاصی بر اساس وزن،چگالی و یا اندازه سلول
روش های اختصاصی با استفاده از آنتی بادی اختصاصی
فایکول و پرکول و حتی فیلتراسیون از جمله روشهای غیراختصاصی میباشند.
روشهای اختصاصی به دو دسته positive selection و negative selection تقسیم میشوند.
در positive selection آنتی بادی به کار رفته بر علیه سلول هدف است و برای جدا کردن همان سلول طراحی شده است.
اما در negative selection آنتی بادی به کاررفته بر علیه سلولهای دیگر است نه سلول هدف.
انواع روشهای غیراختصاصی:
استفاده از Percoll :
جهت جداسازی سلولها،ارگانهای سلولی و یا ویروس با استفاده از سانتریفیوژ و بر اساس چگالی استفاده میشود.
استفاده از LymphoPrep :
یک محلول استریل و مناسب جهت خالص سازی سلولهای تک هسته ای (مونوسیت و لنفوسیت) است.
استفاده از Ficoll :
فایکول یک پلی ساکارید هیدروفیل با شاخه های فراوان
فایکول با دانسیته g/ml 084 /1 ،1/077، 1/073جهت جدا کردن سلولهای تک هسته ای خون محیطی،سلولهای مغز استخوان وخون بندناف
استفاده رایج از فایکول با دانسیته077 /1 جهت جدا کردن PBMC میباشد
چگالی فایکول بیشتر از چگالی لنفوسیت ها و کمتر از چگالی اریتروسیت ها و گرانولوسیت ها است.
پس از سانتریفیوژ کردن اریتروسیت ها و نوتروفیل ها از از میان فایکول عبور کرده و زیر آن در کف لوله قرار می گیرند در حالیکه سلولهای PBMC در سطح مشترک پلاسمای غنی از پلاکت و فایکول قرار میگیرند.
در حدود 80% از سلولهای PBMC را لنفوسیت ها و 20% را مونوسیت ها تشکیل میدهند.
جداکردن PBMC از خون کامل انسان:
مواد و تجهیزات لازم:
نمونه خون انسانی
محیط کشت بافت مانند RPMI 1640
لوله سانتریفیوژ
فایکول هیپاک 077 /1 (Ficoll –hypaque)
پیپت
رنگ تریپان بلو جهت بررسی viability سلولها
روش انجام:
1. ml 2خون دفیبرینه(یا نمونه خون تهیه شده با EDTA،هپارین و سیترات) را باml 2 PBS رقیق نمایید.
2.با دقت و آهستگی نمونه خون را روی 2 ml فایکول طوری اضافه کنید که با هم مخلوط نشوند.
3.در rpm 2000 (900g) به مدت 20 دقیقه و در دمای 25- 18 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ نمایید.
4. با یک پیپت لایه سلولهای مونونوکلئار را که بین فایکول و پلاسما قرار گرفته جدا نمایید به گونه ای که حداقل فایکول با آن مخلوط شود.
5.سلولهای مونونوکلئار را با اضافه کردن محیط کشت و یا PBS شستشو دهید وسپس به آهستگی مخلوط کرده تا دوباره سلولها سوسپانسیون شوند و مجدد شستشو نمایید تا آلودگی پلاکتی کاهش یابد.شستشو در rpm 1200 به مدت 10 دقیقه و در دمای 20 درجه انجام شود.
6. با رنگ تریپان بلو میزان viability سلولها بررسی شود.
انواع روشهای اختصاصی:
: Rosetting
در این متدها با استفاده از RBC ، بیدهای مغناطیسی و ذرات لاتکس میتوان سلولها را جدا کرد که از معروف ترین آنها RBC Rosetting است.
مانند استفاده از گلبول قرمز گوسفند یا SRBC برای جدا کردن لنفوسیت های T
متداولترین متد Rosetting استفاده از بیدهای مغناطیسی در تکنیک MACS است.
MACS
(Magnetic_Activated Cell Sorting)
جهت خالص سازی جمعیت های مختلف سلولی بر اساس مارکرها و یا آنتی ژن های سطحی آنها انجام میشود.
روشهای ایمنوادهیژن مانند تکنیک Paning :
در متد Panning ، آنتی بادی ها به صورت غیرکووالانسی به این فاز جامد متصل میشوند و مخلوط سلولی به آن اضافه می گردد،سلولهای آنتی ژن مثبت به آنتی بادی اتصال می یابند و سلولهای آنتی ژن منفی به دقت شستشو داده میشوند.از آنجاییکه سلولهای متصل به پلیت تغییر می یابند. بیشترین کارایی این روش از میان برداشتن یک گروه از سلولها است.
کاربرد : جداسازی سلولهای Th و Tc با آنتی بادی های ضد CD4 و CD8 و یا جداسازی لنفوسیت های T از B با اتفاده از آنتی ایمونوگلوبولین
FACS :
Fluorescene Activated Cell Sorting
این تکنیک جداسازی بسیار اختصاصی است و تا 99% خلوص سلولی میدهد.
در این تکنیک آنتی بادی اختصاصی مارکرهای سلولی با مواد فلوروکروم لیبل میشوند و پس از اتصال این آنتی بادی ها به سلولهای مربوطه ، این کمپلکس سلول-آنتی بادی فلورسنت در یک میدان الکترومغناطیسی قرار گرفته و جدا میشوند.
روشهای ایمنوتوکسیسیتی :
مانند complement mediated cytotoxicity که جزو روشهای negative selection جهت القای سیتولیز انتخابی در سلولها میباشد.بدین منظور در سلولهای بیان کننده یک آنتی ژن خاص بواسطه آنتی بادی اختصاصی آن و کمپلمان ایجاد سیتولیز میشود.
Cell affinity chromatography :
در این روش آنتی بادی اختصاصی سلول به ستون متصل میشود و سپس سوسپانسیون مخلوط سلولی از ستون عبور می کند.این روش هم به صورت negative selection و هم به صورت positive selection انجام میشود.
Thank You
for
Your Attention