بیان متمایز و نقش ژن های موثر درشدت بیماری زایی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس در مراحل تشکیل کلنی(بیوفیلم) و تهاجمی(بیماری زایی)
ABSTRACT
استافیلوکوکوس اورئوس جز باکتری گرم مثبت است، این باکتری در حالت غیر بیماری زا و خاموش در پوست و مجاری بینی و مجاری گوارشی کولون تشکیل می دهند ، افراد حامل کولون در معرض خطر افزایش یافته ای برای ابتلا به عفونت های پیشرفته استاف هستند که بازه وسیعی از یک عفونت پوستی یا بافت نرم تا بیماری های شدیدتر مثل اندوکاردیت، سپسیس، استومیلیت را در بر میگیرد. استاف اورئوس باید فاکتورهای بیماری زایی مختلفی داشته باشد تا در نقاط مختلف بدن ایحاد عفونت کند. در این مطالعه میزان بیان ژن های دخیل در بیماری زایی استاف که از سه محل کلنی بینی ، عفونت خونی یا باکتریمیا و سپسیس قلبی به دست آمده بودند باهم مقایسه شد این مدل انتخاب شد تا فرایند تبدیل استاف اورئوس از کلنی غیر بیماری زا به یک باکتری پاتوژن مهاجم بررسی و روشن شود. 23 ژن موثر در شدت بیماری زایی استاف اورئوس بررسی شداند که در بیان پروتئین ها و کربوهیدرات های چسبنده غشایی ، ترشح توکسین و بیان پروتئین های کانال یونی و فرار از سیستم ایمنی نقش داشتند، افزایش بیان ژن های sdrc,fnbA,fhuD,sstD و hla در گذر از مرحله کلونی به بیماری زایی به صورت مستمر دیده شد این نتیحه نقش موثر این ژن ها را در بیماری زایی استاف اورئوس مطرح می کند،در نهایت اطلاعات بیان ژن ها با استفاده از سوش حهش یافته ناک اوت شده در مدل حیوانی به مقش بیناری زایی ژن ها ارتباط داده شد.این نتایج یک دیدگاه از چگونگی عملکرد استاف اورئوس در تغییر بیان ژن ها بین حالت غیربیماری زا و بیماری زا را موجب شد
IMPORTANCE
بسیاری از باکتری ها ازجمله استاف اورئوس بدون علائم خاصی در بینی وپوست انسان ایجاد کلونی می کنند که البته می توانند موجب بیماری هایی مانند پنومونی ،استئومیلیت،سپسیس و عفونت خونی شوند. هدف از این مطالعه بررسی تفاوت در بیان ژن های انتخاب شده در استاف اورئوس در طی دو مرحله زندگی بیماری زایی و غیر بیماری زایی بود تا یک دیدگاه از چگونگی گذر باکتری از مرحله غیر بیماری زایی به بیماری زایی و چگونگی انطباق یک باکتری بیماری زا با محیط های مختلف در میزبان (از کلنی بینی به بیماری زایی ) به دست آید ، نتایج حاصل ازبررسی بیان ژن ها همچنین برای انتخاب ژن مناسب برای طراحی گونه جهش یافته ناک اوت شده در جهت بررسی نقش پروتئین های اصلی در کلونی بینی و باکتری بیماری زا مورد استفاده قرار گرفت. این نتایج نه تنها یک دیدگاه از فاکتورهای بیماری زایی استاف اورئوس بلکه یکسری اهداف درمانی بلقوه را نیز به وجود می اورند.
Intruduction
استافیلوکوک اورئوس از باکتری های گرم مثبت است که عفونت های بیمارستانی و غیر بیمارستانی را موجب میشود .نزدیک به 20-30درصد مردم به صورت دائم و حدود 60 درصد به صورت متغیر حامل کلونی های استاف در بینی خود هستند. افراد حامل کلونی در معرض یک خطر افزایش یافته برای تبدیل یک کلونی به عفونت میباشند .عفونت های استاف اورئوس یک طیف از عفونت های پوستی یا بافت نرم تا یک عفونت شدید شامل باکتریمیا سپسیس و استئومیلیت را در بر میگیرد.بیان متفاوت ژن ها در مراحل مختلف رشد و عفونت زایی این باکتری توصیف شده است.در نتیجه دشوار بودن مطالعه بیان ژن های باکتریایی در شرایط invivo بسیاری از مطالعات در شرایط آزمایشگاهی invitro با شبیه سازی شرایط موجود میزبان مثل یون ها /محدودیت های مواد مغذی /شرایط کمبود اکسیژن/رشد باکتریایی پلنگتونی در مقابل رشد بیو فیلم و در معرض خون قرار دادن باکتری در محیط ازمایشگاهی انجام گرفته است. این مطالعات اطلاعات ارزشمندی را در مورد ژن های درگیر در پاسخ به محیط در باکتری فراهم کرده اند با این وجود شرایط حقیقی invivo بسیار پیچیده تر است . علاوه بر مطالعات invitro شرایط بیان ژن های استاف اورئوس در شرایط invivo نیز مشخص شده است.بیان تعداد محدودی از ژن ها در هر حالت الودگی زخم و ابزارهای در ارتباط با بیمار،عفونت پوستی ، کلونی بینی انسان ،عفونت کلیوی موش و در کلونی بینی رت بررسی شده است. در این مطالعات سطح بیان ژن ها با سطح بیان ژن ها در شرایط invitroکه قبلا اندازه گیری شده بود مقایسه شدند. مقایسه ای برای سطح بیان ژن های استاف اورئوس در مراحل مختلف بیماری گزارش نشده است. هدف از این مطالعه مقایسه پروفایل بیانی 23ژن موثر در شدت بیماری زایی استاف اورئوس هایی است که در طی سه مرحله مختلف الودگی جدا شده اند.شامل : کلونی بینی،باکتریمیای اولیه و مشکلات بافت قلب (ترومبو امبولی) در سپسیس این الگو انتخاب شد تا فرایند تبدیل استاف اورئوس از شرایط غیر بیماری زا (کلونی بینی بدون علایم ) به حالت بیماری زا و پاتوژن (از عفونت باکتریمیایی اولیه تا یک عفونت مهاجم در نتیجه سپسیس )روشن شود . نتایج ما یک افزایش بیان در ژن های sdrL،fnbA،fhuD،sstD،hlaدر استاف اورئوس در حالت مهاجم و بیماری زا را در مقایسه با حالت غیر بیماری زا و خاموش نشان داد . این یافته ها نقش این پروتئین ها را در فرایند بیماری زایی استاف اورئوس مطرح میکند و نیاز به مطالعات بیشتر این فاکتورها به عنوان اهداف درمانی را پیشنهاد میکند .
RESULTS
REALTIME PCR کمی برای تائید چگونگی بیان ژن ها استاف اورئوس در پاسخ به تغییرات محیطی در میزبان مورد استفاده قرار گرفت از حیوانات ازمایشگاهی متفاوتی استفاده شد {کاتان رت برای کلونی بینی و مورین برای باکتریمیا و گونه کشنده }/کلونی بینی در کاتان رت مورد بررسی قرار گرفت که دو دلیل برای انتخاب این حیوان وجود داشت یکی شباهت تشکیل کلونی بینی این حیوان به انسان ودیگری مطالعات زیاد و کاملی که روی این حیوان انجام شده در مقابل استاف اورئوس در مورین یا تشکیل کلونی میدهد و یا نیاز به انتی بیوتیک برای تشکیل کلونی دارد. مدل باکتریمیا و سپسیس در مورین انتخاب شد زیرا این مدل و شرایط برای کاتان رت در کارهای قبل وجود نداشت . چهار گروه از ژن های استاف اورئوس برای بررسی انتخاب شدند پروتئین ها و کربوهیدرات ها چسبنده /دریچه های کاتیون های فلزی /اگزوتوکسین و پروتئین های فرار از سیستم ایمنی . یک نگرانی هنگام انجام qRT-PCRبر روی نمونه های خالص شده از شرایط invivo این است که الودگی هایی که مانع PCRمیشود همراه CDNAخالص می شوند.برای توجه به این نگرانی نمونه های CDNAاز هر کدام از محل های عفونی متفاوت {بینی کاتان رت خون و قلب موش مورین }به یک سنجش PCRویژه ی سودوموناس PCRVدر پلاسمید وارد شدند همه نمونه ها ژن PCRVرا با یک کیفیت مشابه تکثیر کردند که اشاره به این مورد دارد که هیچ یک از نمونه ها کارایی ان ها از لحاظ PCRتحت تاثیر محل عفونت قرار نگرفته است .
Nasal Colonization
ازمایش ها با دو سوش استاف اورئوس صرفا بیمارستانی SF8300{CC8 و USA300 استاف اورئوس مقاوم ب متی سیلین MRSA} و ARC633 {CC15 و حساس به متی سیلین MSSA} به دست امده از ابسه های پوستی و حاملین کلونی بینی انجام گرفت به عنوان یک معیار برای حالت غیر بیماری زایی سطح رونوشت های کاتان رت برای کلونی بینی اندازه گیری شد . برای اجتناب از خطای مقایسه اطلاعات بیان با اطلاعات بیان در سطوح مختلف ناشی از شرایط نا خواسته رشد در محیط invitro سطوح مختلف بیان بر اساس تغییرات فلدینگ در شرایط حداکثر و حداقل سطح بیان در شرایط invitroمطرح میشود 16SrRNAبه عنوان یک کنترل برای نرمال کردن نتایج انتخاب شد چون 16SrRNA درهر دو نوع سوش SF8300 و ARC633در شرایط مختلف رشد تنها به اندازه 2 واحد در فلدینگ تغییر میکند {لوگ اولیه /لوگ میانی و لوگ تاخیری و فاز ایستایی در محیط کشت TSB/RPMI و سرم انسانی } شکل S2. بر این اساس تغییر بیش از دو واحد در فلدینگ {کاهش یا افزایش }معیار تغییر در میزان بیان ژن قرار گرفت . در طی مرحله کلونی بینی سطح رونوشت های چهار ژن چسبنده {sdrD.tarK.clfB.sdrL } افزایش بیانی بیش از حد اکثر بیان مشاهده شده در محیط invitro در هر دو سوش داشتند .علاوه بر این چهار ژن دیگر تنها در یک سوش افزایش بیان بیش از حداکثر بیان مشاهده شده در محیط invitro داشتند. (clfA.icaB.efb.sasG)(شکل 1).افزایش در سطح رو نوشت ژن های sasG.clfB.sdrC.sdrD.tarKمهر تاییدی بر نتایج پژوهش های قبلی مبنی بر این است که محصول این ژن ها در پاسخ به شرایط تشکیل کلونی بینی مسئول هستند یون های فلزی در محیط invivoمحدود اند در نتیجه انتظار میرود کانال ها یونهای فلزی افزایش بیان داشته باشند . طبق انتظار اکثر کانال های یون های فلزی نسبت به حداقل سطح بیان در محیط invitroافزایش بیان داشته اند .ژن هایی که SPAوsbi راکد میکنند نسبت به حداقل سطح بیان خود در محیطinvitro افزایش بیان و نسبت به حداکثر بیان خود کاهش بیان داشتند.ژن توکسین ها نسبت به حداقل بیان در invitro کاهش بیان داشتند .شکل 3.لازم به ذکر است سوش ARC633 lukF-pv را بیان نمیکند.
Nasalcolonization versus early bacteremia
پس از ان بیان ژن ها در خون موش مبتلا به باکتریمیا یک ساعت پس از الوده کردن بررسی شد {تزریق داخل رگی }سطح رونوشت ها با مشاهدات دوران کلونی بینی مقایسه شد تا تایید شود باکتری کدام ژن ها را در مواجه با خون دچار تغییر در بیان میکند . از ژن های چسبنده در مقایسه با کلنی بینی تنها ژن fnbAدر هر دو سوش افزایش بیان داشت در حالی که icaB و sdrC در sf8300و sasA.tago.efb.ebpSدر سوش ARC633در مواجهه با خون افزایش بیان نشان دادند . سه ژن مسئول کانال کاتیون های مثبت در ARC633{sstD.fhuD.mntC}در مقایسه با حالت کلنی بینی افزایش بیان داشتند .ژن hlaدر هر دو سوش افزایش بیان داشت در حالی که lukF-pv{SF8300}وsbiوspa {ARC633}در یک سوش افزایش بیان داشت و از جمع بندی نتایج بالا به نظر میرسد هر استاف اورئوس استخراج شده به صورت متفاوتی به تغییرات محیطی جواب میدهد و عوامل موثر بر بیماری زایی متفاوتی در یک نوع عفونت مشابه در هر استاف مورد استفاده قرار میگیرد .
Trancsition from bactermia to heart lesions
سطح رونوشت در باکتری های مشاهده شده در قلب شسته شده با نرمال سالین 14 ساعت پس از الوده شدن با باکتری با سطح بیان باکتری در خون موشی که یک ساعت از الوده شدن ان میگذشت مقایسه شد قلب با سالین شستشو داده شد تا اطمینان حاصل شود سطح بیان در خون های باقی مانده در قلب اندازه گیری نشده باشد این مطلب باید مورد توجه قرار گیرد که همچون پژوهش های قبلی شواهد هیستولوژیکی مبنی بر وجود ترومبو امبولی در قلب موش های الوده شده وجود نداشت {اطلاعات وارد نشده }مقایسه انجام شده در اینجا با هدف مشخص کردن ژن هایی است که در تسریع گذر به مرحله ترومبوامبولی خاصه ی استاف اورئوس نقش دارند در مقایسه با مراحل اولیه عفونت باکتریایی خونی /ژن های چسبنده در هر دو سوش افزایش بیان نشان دادند .{clfA.sdrC.sasF.tagO.fnbA.tarK} و {sasA{SF8300}} و {icaB{ARC633}} در مقایسه با مراحل اولیه عفونت باکتریایی خونی در مرحله ترومبوامبولی تنها در یک سوش افزایش بیان نشان دادند . از این میان clfA.tagO.fnbA در تشکیل کلونی در اندامها مطرح شده بودند چهار ژن کانال کاتیونی در مقایسه با مرحله عفونت خونی افزایش بیان نشان دادند {isdB.isdA.mntC.fudD} در حالی که isdH و sstDافزایش بیان در ARC633را نشان دادند پس از تزریق به قلب hla.sbi.و lukF-pv هر سه افزایش بیان در SF8300نشان دادند در حالی که hla وsbi در ARC633تغییری در بیان نداشتند {شکل 5} در کل این نتایج نشان میدهد که استاف اورئوس از پروتئین های چسبنده متنوع به صورت چند گانه برای فرایند فرار از جریان خون و حمله به ارگان ها استفاده میکند .علاوه بر این افزایش بیان کانال های کاتیون های فلزی اشاره به طبیعت کمبود یونی قلب دارد در حالی که توکسین های خارجی و ژن های فرار از سیستم ایمنی معمولا برای فرار از جریان خون و سیستم ایمنی میزبان استفاده میشوند.
Isogenic mutant analysis
برای مقایسه بیان یک ژن با نقش ان در بیماری زایی رده های دارای جهش های حذف تک ژنی در SF8300ایجاد شد ژن های {clfA.clfB.sdrC.isdH.isdB.hla.spa} انتخاب شده تا نمایند تنوع پروفایل بیانی در سه مدل الودگی باشند. ژن چسبنده clfA و sdrC بر اساس افزایش بیان پیوسته شان در طی الودگی انتخاب شدند clfB.isdH.isdBبر اساس افزایش بیان در مدل کلونی بینی انتخاب شدند و همچنین نقش در گذر جریان خون به حالت مهاجم بیماری زا {isdB}ژن های باقی مانده {hla.spa}در نهایت افزایش بیان در دو مدل الودگی را نشان داده و به عنوان ژن های موثر در بیماری زایی استاف اورئوس شناخته شده اند .کاتان رتها از طریق بینی با سوش های جهش یافته تک ژنی آلوده شدند و CFU چهار روز پس از آلودگی با نتیجه حاصل از در معرض مدل وحشی و جهش یافته قرار گرفته مقایسه شد . (شکل 6) جهش یافته دلتا sdrC تمایلی به کاهش (0.5log) در تشکیل کلونی بینی نشان داد که این تمایل هم بارز نبود زمانی که هر دوی sdrc و clfB (ژن های چسبنده ای که نشان داده شده بود در تشکیل کلونی بینی نقش دارند)حذف شدندیک کاهش شاخص در CFU مجاری بینی مشاهده شد. سوش های جهش یافته با سوش های جهش نیافته برای تغییر در CFU قلبی پس از آلوده سازی از طریق تزریق داخل وریدی باهم مقایسه شدند،سوش های جهش یافته در clfA,sdrC,isdB,hla همه کاهش در CFUقلبی را نشان دادند،با افزایش بیان مشاهده شده در ترومبوآمبولی همخوانی داشت(شکل7)حذف ژن هایی که کاهش بیان داشتند یا بدون تغییر در مرحله ترومبوآمبولی بودند در سوش های جهش یافته تاثیری در احیای CFU قلبی نداشت به جزdspA (شکل7) این مطلب باید مورد توجه قرار گیرد که سوش های جهش یافته تک ژنی از لحاظ عدم نقص رشد در TSB در مقایسه با سوش بدون جهش SF8300 بررسی و تایید شده بود (داده ها نمایش داده نشد)
DISCUSSION
فهم این که چگونه استاف اورئوس بیان ژن های خود را در گذر از مرحله کلونی به مرحله عفونی تغییر می دهد برای درک چگونگی بیماری زایی استاف اورئوس بسیار حیاتی است ، ما از qRT-PCR برای بررسی سطح رونوشت های عوامل موثر و شناخته شده در میزان بیماری زایی باکتری های تخلیص شده از مدل های مناسب حیوانی استفاده کردیم،داده های بیان ژن های باکتری ها در محیط invivo، معمولا در مقایسه با شرایط پیش فرض invitro ارائه شده است که تفسیر اطلاعات بیان ژنها در حالت بیماری را مشکل میکند، برای رهایی از این محدودیت اطلاعات بیان ژن ها به طور مستقیم از کلونی بینی به عفونت خونی و از آن به ترومبوآمبولی باهم مقایسه شد به این صورت نیاز به مقایسه با یک شرایط invitro کاهش میابد و هم فرصتی برای ارزیابی تغییرات بیان ژن های باکتری در مراحل مختلف آلودگی(خاموش به بیماری زا) را فراهم میکند،بیان در حالت کلونی بینی علی رغم عدم ضرورت با بیان در invitro مقایسه شد تا یک معیار برای مقایسه های بعدی به دست دهد. مستندات خوبی در ارتباط با نقش عوامل چسبنده در تشکیل کلونی بینی داده شده است و این عجیب نیست که چندین ژن چسبنده به صورت شدیدی حداقل در یک سوش افزایش بیان در مقایسه با حالت حداکثر بیان در حالت invitro خود داشتند (5-21000 فلد) برای مثال clfB,sdrC,sdrD,sasG چه در مطالعات invivo و چه invitro مطرح شده که در تشکیل کلنی بینی نقش دارند. یک نقش اساسی در تشکیل کلنی بینی توسط sdrC,clfB به اثبات رسیده همان طور که دلتا sdrCدلتاsdrB سوش دارای دو جهش در تشکیل کلنی بینی یک کاهش چشم گیر در CFU در مقایسه با حالت غیر جهش یافته SF8300 نشان داد. این اولین شاهد مستقیم و عینی نقش داشتن sdrc در تشکیل کلنی بینی است ،sdrC گزارش شده بود که به پرتئین بتا نرو اکسین وصل میشود ،یک پروتئین که به صورت اولیه در بافت مغز پیدا میشود نه اپیتلیال بینی که یک لیگاند جایگزین را برای sdrc مطرح میکند. علاوه بر clfBوsdrC افزایش سطح بیان در clfA,icaB,sdrD,tarK,sasGوefb داشتیم که نشان دهنده این است که آن ها نیز در تشکیل کلنی بینی نقش دارند . این اطلاعات از این نظریه حمایت میکند که تشکیل کلنی بینی یک پروسه چند عاملی است که به تعداد زیادی پروتئین های اتصالی نیاز دارد نزدیک به همه ژن های کانال های یونی بررسی شده در طی تشکیل کلونی بینی کاهش در بیان در مقایسه با حداکثر سطح بیان خود در حالت invitro خود نشان دادند هر چند بیانشان نسبت به حداقل سطح بیان در invitro بالاتر بود.دور از انتظار نبود زیرا اگرچه مجرای بینی محیطی کم یون است در مقایسه با محیط RPMI کمتر به محدودیت یون های فلزی دچار است اگر چه بیان isdH افزایش ملایمی را نشان داد(3فلد) در طی مرحله ی تشکیل کلنی بینی در مقایسه با حداکثر بیان در invitro تغییری در CFUباکتریایی کلونی که در مجرای بینی کاتان رت توسط دلتاisdH تشکیل شده بود در مقایسه با سوش فاقد جهش ایجاد نشد این مسیله نقش isdH در کانال های یونی را رد نمیکند بلکه بازگو کننده فراوانی ذاتی سیستم های موثر در کانال های یونی در استاف اورئوس است مشابه نتایج به چاپ رسیده قبلی بیان hla در مجرای بینی پایین بود و جهش یافته دلتاhla تاثیری بر CFU در مجرای بینی نداشت که نشان میدهد hla نقش مهمی در تشکیل کلنی بینی ندارد. به هر حال به دلیل ذات چند عاملی فرایند تشکیل کلنی بینی وجود نقش برای تکسین ها نمیتواند نادیده گرفته شود و در نهایت پروتئین های فرار از سیستم ایمنی یک افزایش بیان فراوان در مرحله کلنی بینی داشتند که دور از انتظار نبود زیرا این اولین مواجهه باکتری با سیستم ایمنی است. چندین ژن چسبنده(fnba,sdrC,icaB,sasA,tagO,efb,ebpS) همه ی ژن های فرار از سیستم ایمنی و هر دوی توکسین ها حداقل دو فلد در جریان خون موش در مقایسه با کلنی بینی افزایش بیان داشتند در حالی که ژن های گیرنده کاتیون های فلزی به صورت وسیعی تغییر نکرده و یا کاهش بیان در مقایسه با مجرای بینی داشتند. افزایش بیان ژن های چسبنده حاکی از آن است که در اثر افزایش مواجهه با جریان خون استاف اورئوس شروع به اتصال به سلول ها یا اندام هی میزبان میکند در حالی که نقشی برای icaB در طی عفونت خونی باکتریایی گزارش شده هیچ گزارش برای نقش داشتن sasA,sdrC,tagO,efb,ebpS در مرحله عفونت خونی باکتریایی وجود نداشته است چندین مورد از این چسبنده ها نیز در آزمایشات invivo و هم invitro مطالعه شده اند و نتایج این آزمایشات در مقایسه با نتایجی که اینجا بیان شد بینشی را در مورد نقش این ژن ها در بیماری زایی استاف اورئوس ایجاد میکند. برای مثال گزارش شده است که fnbA و tagO در چسبیدن به اندوتلیال نقش دارند. اگرچهsasA در عفونت خونی دخیل دانسته نشده گزارش شده است که آنتی بادی های آن در سرم بیمارانی که دوران نقاهت را میگذرانند پیدا شده که شواهد بیشتری را فراهم میکند که استاف اورئوس sasA را طی عفونت سیستمیک بیان میکند این اطلاعات حاکی از آن است که استاف اورئوس حتی در مراحل اولیه خونی سریعا پروتئین های چسبنده را بیان میکند تا اتصال به سطح اندوتلیال و احتمالا فرار از جریان خون و تشکیل کلونی در بافت میزبان را تسهیل کند ، سه ژن چسبنده دارای افزایش بیان (sdrC,ebpS,efb)در عفونت خونی استاف اورئوس مطرح نشده اند که ما نقش داشتن آن ها در عفونت خونی استاف اورئوس یا اتصال آن به اندوتلیال را مطرح میکنیم.
پروتئین های کاتیون های فلزی( به جز isdA و isdB) همواره در جریان خون بیان بالا داشتند در حالی که آن ها در جمع آوری یون ها کمک میکنند. تفاوت در بیانisdA و isdB در مقایسه با بیان در کلنی بینی میتواند نشونه ای برای برجسته بودن تفاوت در مواد مغذی در دسترس و پروتئین های جمع آوری کننده یون میزبان در مجرای بینی در مقابل خون باشد . افزایش بیان sbi,spa,lukF-PV حاکی از آن است که باکتری ها به صورت موثری درگیر فرار از سیستم ایمنی میزبان به محض مواجهه با خون هستند . افزایش بیان hla در طی عفونت خونی از مطالعات قبلی مبنی بر نقش آلفا توکسین(AT) در عفونت های خونی همایت میکند گذر از عفونت خونی به بافت قلب موجب افزایش بیان شدید اکثر ژن های چسبنده همه ی گیرنده های کاتیون فلزی ،توکسین و ژن های فرار از سیستم ایمنی میشود به جز spa در مقایسه با بیان در جریان خون افزایش بیان ژن های چسبنده شاید مورد انتظار بود زیرا این ژن ها به صورت کلی ژن های تسهیل کننده اتصال و تشکیل کلنی در بافت میزبان در نظر گرفته میشوند اگرچه برخی از ژن های چسبنده که افزایش بیان داشتند به عنوان عامل آسیب دیدن اندام ها نشان داده شده اند. clfA,fnbA,tagO بسیاری از آن ها گزارشی مبنی بر نقش داشتن در شکل گیری آسیب بافتی نداشته اند. افزایش بیان sdrC(13فلد)sasA(_4فلد) و sasF(11فلد) به صورت خاص مورد توجه است زیرا شناخت کمی در مورد نقش آن ها در شدت بیماری زایی استاف اورئوس وجود دارد. علی رغم اینکه سوش جهش یافته دلتا sdrC موجب کاهش نسبی CFU احیا شده از آسیب قلبی در مقایسه با سوش جهش نیافته میشود آزمایشات بیشتری نیاز است تا نقش این چسبنده های مفروض در عفونت شدید استاف اورئوس روشن شود. افزایش بیان همه ی ژن های گیرنده یونی( به جز isdH و sstD در سوش SF8300) در مطالعات قبلی نشان داده شده بود که محتوای یونی در اندام ها متنوع است ودر ماهیچه قلب کمتر از اندام های دیگر است اگرچه سطح یون جریان خون آزاد در این مطالعات بررسی نشده بود. بیانspa در قلب در مقایسه با جریان خون کاهش یافته بود با این وجود دلتاspa موجب کاهش CFU قلبی در مقایسه با آلودگی با سوش جهش نیافته شد که این ممکن است به دلیل افزایش بالای spa در جریان خون باشد و بنابراین کاهش بیان spaبین جریان خون و مرحله قلب باعث ارایه مقدار بارزی از پروتئین A بر سطح باکتری شود در مقابل شاید دلتاspa باعث کاهش قدرت بقای باکتری در خون شود در نتیجه کاهش شمار باکتری های که به بافت قلب حمله میکنند،اگرچه نشان داده شده AT برای ایجاد عفونت استاف اورئوس مهم است مثل اندوکارتیت عفونی شواهدی مبنی بر نقش ان در ترومبا امبولی وجود ندارد. اطلاعاتی که در اینجا ارایه شده حاکی از ان است که AT در الوده کردن بافت قلب نقش دارد .در هر دو دسته اطلاعات ، هم از طریق افزایش سطح رونوشت ها و هم کاهش CFU احیا شده از بافت قلبی که از طریق دلتا hlaالوده شده بود در مقایسه با الوده شدن با سوش جهش نیافته .یک نظریه برای نقش ATدر ایجاد اسیب قلبی به نقش برش کادهرین Eبه واسطه ADAM10اشاره داردکه سبب نشت عروق و هجوم باکتری به بافت قلب میشود. بر اساس اطلاعات ما این نتایج اولین مثال است مطالعه طراحی شده با هدف مقایسه مستقیم بیان فاکتورهای موثر بر شدت بیماری زایی توسط باکتری در زی مراحل غیر بیماری زایی و بیماری زایی میباشد.همچنین این مطالعه نشان داد این شیوه از انالیز ممکن میباشد و میتوان اطلاعات ارزشمندی با مقایسه الگوی بیان بین حالت بیماری و کلونی جمع اوری کرد و با تکیه بر یک مطالعه بنیادی و وسیع میکرو ارایه به یک دید وسیع از استاف اورئوس در شرایط خاموش و بیماری زایی رسید.به تازگی یک مطالعه بر اساس میکرو ارایه بر استاف اورئوس جدا شده از عفونت پوستی انسان انجام شده و همان گونه که انتظار میرفتبسیاری از ژن هایی که افزایش بیان داشتند با نتایج مطالعه invivoما همخوانی خوبی داشتند (برای مثال hla.isdB.isdA.sitC) نتایج به دست امده در این مطالعه از گزارشات قبلی که وجود ژن های استاف اورئوس به صورت منحصر به فرد در هر یک از سه مرحله بیماری را توصیف میکرد حمایت میکند و انها اطلاعات جدیدی در مورد ژن هایی که ممکن است در مراحل کلونی بینی (icaB.clfA.efb) عفونت اولیه جریان خون (sdrC.sasA.tagO.fnbA.sstD.fhuD.mntC.ebpS.efh) ترومبا امبولی (sdrC,sasA,sasF,isdH,mntC,sstD,fhuD,spA,sbi,hla) افزایش بیان پیوستهsdrC,fnbA,fhuD,sstD و hla (در حداقل یک سوش )از مرحله کلونی بینی به عفونت خونی و آسیب قلبی بر این ژن ها یک نقش فعال در گذر ازمرحله خاموش به بیماری زایی را مطرح می کند.الگوی بیان ژن های انتخاب شده اغلب بین سوش های تست شده متنوع بوده است ،که تنوع استاف اورئوس را نمایان می کند و بر نیاز به ارزیابی باکتری های جدا شده از چند درمانگاه هنگام تعیین اهمیت فاکتورهای بیماری زائی تاکید دارد.اطلاعات جمع اوری شده یک فهم پایه از بیماری زاییی استاف اورئوس و چگونگی تبدیل باکتری خاموش به بیماری زا را ایجاد میکند، این فهم پایه ممکن است سرانجام موجب توسعه درمان های هدفمند شود.
MATERIALS AND METHODS
سوش های استاف اورئوس،محیط کشت و رشد
SF8300 یک نمونه اصلی از سوش مقاون به متی سیلین استاف اورئوس است و ARC633 یک سوش جداشده از کلونی بینی توسط دکتر دیوید بروکنر در مرکز پزشکی UCLA است.باکتری ها با تکان (250rpm) در دمای 37 درجه در محیطTSB برای به دست آوردن منحنی رشد و برای بیان ژن ها در محیط invitro کشت شدند برای تخلیص RNA از کشت انجام شده دز invitro نمونه ها با ماده نگهدارنده RNA شرکت کیاژن با نسبت 1 به 2 ترکیب شد . در دمای اتاق به مدت 5 دقیقه اینکوبه شد و با سانتریفیوژ ته مشین شده و سپس نمونه حاصل در 1میلی لیتر از تریزول شرکت اینویتروژن دوباره به صورت محلول درآمد،نمونه های تریزول دیده با استفاده فست پرپ24 همگن کننده به همراه ماده تجزیه B Tube(شرکت بیومدیکالMP)تجزیه شدند تخلیص RNA به شیوه تشریح شده در زیر انجام شد.استوک های باکتری های مورد استفاده برای آلوده کردن حیوانات با رشد باکتری در طی شب در TSB آماده شد و سپس کشت ها به درون TSB تازه رقیق شده و تا رسیدن به OD 600 رشد داده می شود حدود 0.8 . باکتری ها با سانتریفیوژ جمع آوری شده در PBS شرکت اینویتروژن دوباره حل می شوند با افزودن 10درصد گلیسرول در دمای منفی 80 در واحدهای جدا فریز می شوند تا در همه مطالعات حیوانی استفاده شوند.
مدل کلونی بینی کاتان رت
5 میکرولیتر استاف اورئوس با CFU 5*105 در هر بینی کاتان رت ریخته شد چهار روز بعد مجراهای بینی بریده شد و در ml20 نگهدارنده RNA برای RT-PCR قرار داده شد و برای 5دقیقه اینکوبه شد یا در 2ml PBS+0.1%tween20 برای محاسبه CFU قرار داده شد . برای RT-PCR مجرای بینی در 10ml تریزول قرار داده شد و به شدت ورتکس شد تا باکتری ها جدا شوند،نمونه های تریزول دیده با استفاده از همگن ساز فست پرپ 24و ماده تجزیه اییB tube تجزیه شدند،RNA به روش توصیف شده تخلیص شد.همه داده های RT-PCRبر اساس سه ُآزمایش مستقل بر روی 12 حیوان/آزمایش گزارش شده اند.برای شمارش CFU،مجرای بینی با استفاده از دستگاه پلی ترون Pt-10-35GT همکن شد.نمونه ها پشت سرهم رقیق و وارد پلیت استاف کروم آگار شدند همه حیوانات از پروتکلMedimmunes IACUC استفاده کرده و با حیواناتی که تحت شرایط رفاهی USDA بودند مقایسه شدند
عفونت خونی موش(مورین)
موش ماده از طریق تزریق وریدی 20میکرولیتر استاف اورئوس با CFU 1*108 آلوده شد. 1ساعت پس از بزریق خون جمع آوری و در 20ml نگهدارنده RNA ریخته شد باکتری ها با سانتریفیوژ جمع آوری شده در تریزول دوباره حل شده وبه شیوه توصیف شده در بالا کار ادامه ادامه پیدا کرد همه نتایج RT-PCR در سه آزمایش مستقل و روی 10حیوان/آزمایش کزارش شده اند.
سپسیس موش (مورین)
به موش ماده 200میکرولیتر استاف اورئوس با CFU 1*107 از طریق ورید دنی تزریق شد. 14ساعت بعد قلب موش برداشت و در 20mlنگهدارنده RNA(برای RT-PCR) قرار گرفته و 5دقیقه اینکوبه شد یا بافت در 1ml PBS+ 0.1% tween20 برای شمارش CFU قرار گرفت ،باکتری ها و بافت قلب به شیوه توصیف شده تجزیه و RNA آن ها تخلیص شد. همه نتایج RT-PCR بر اساس سه آزمایش مستقل و در 10 حیوان/آزمایش کزارش شده اند . برای شمارش CFU 1ml PBS+0.1 % tween20 در ماده تجزیه ایی A tube در همسان ساز فست پرپ 24 همسان سازس شد همه نمونه پشت سد هم رقیق و در پلیت آکار سوی تریپتیکاز قرار گرفتند.
حذف قالبندی شده ی ژن ها
حذف قالبندی شده ژن های انتخاب شده باروش جایگزینی اللی وبا استفاده از PKOR1 انجام شد.پرایمرx1-x2 (جدول S3) برای تکثیر حدود 1000 جفت بازی که مسئول اولین 84 تا 153 نوکلئوتید از کدون آغاز و ناحیه ّ5 هستند استفاده شد. از پرایمر x3-x4 برای تکثیر حدود 1000 جفت باز که مسئول 33 تا159 نوکلئوتید پایانی از کدون پایان و ناحیه ّ3 هستند استفاده شد(جدولS3) محصول PCR x1-x2 وx3-x4 با استفاده از overlap PCR با استفاده از پرایمر x5-x6 به هم وصل می شوند نقاط اتصال (attB)متصل شده به انتهای ّ5 پرایمر های x5 و x6 با توالی attP که یک کاست نوترکیبی لامبدا را روی PKOR1 در حضور اینتگراز باکتریوفاژ لامبدا و فاکتور اینتگریت شده در میزبان باکتری E.coli (اینویتروژن clonase) احاطه میکند و با الکتروپوریشن به درون E.coli وارد و نوترکیب می شوند . ساختارهای دارای حذف های قالب بندی شده به درون استاف اورئوس RN4220 الکتروپوریشن شده و سپس به وسیله Q11 به درون SF8300 منتقل می شوند ،جایگزینی اللی به شیوه توصیف شده در جای دیگر انجام گرفت. جهش یافته های دارای جایگزینی اللی با PCR و توالی یابی DNA با استفاده از پرایمر های x1 تا x4 و پرایمر های x1,x4,S1,S2 شناسایی شدند(جدول S3) سوش های دارای جذف های چند ژنی کنار گذاشته شدند.
آماده کردنRNA
20میکرولیتر کلروفرم به 1میلی لیتر از باکتری تجزیه شده اصافه و در 14000g سانتریفیوژ شد لایه شفاف بالایی خارج شد و به 1میلی لیتر ایزوپروپرانول اضافه شد و سپس در 20- درجه سانتی گراد در طول شب اینکوبه شد ،RNA به وسیله سانتریفیوژ 14000g به مدت30 دقیقه ته نشین شد سپس با اتانول 70% شستشو داده شد،خشک شد و سپس دوباره در 100میلی لیتر آب بدون RNase حل شد و با DNase بدون RNase هضم شدن DNA انجام شد برای 1ساع در ادامه هضم 1 میلی لیتر از تریزول و 200 میکرولیتر کلروفورم اضافه شد فرآیند رسوب RNA و هضمDNA تکرار شد،تخلیص RNA با استفاده از مینی کیت RNAeasy کیاژن انجام شد.
RT-PCR
ساخت cDNA از RNA با کیت اینویتروژن انجام شد ،پرایمر های تگ من (جدول S4) شامل 6کربوکسی فلوروسنت گزارشکر و غیرفلوروسنت خاموشگر ، با ابزار طراحی تگ من طراحی شدند. نمونه های cDNA در سه نسخه با استفاده از 16srRNA به عنوان کنترل ارزیابی شدند،RT-PCR با پروتکل تگ من انجام با نرم افزار SDS آنالیز شد ، ارزش نسبی بیان ها با متد cT∆∆ محاسبه شد با 16srRNA به عنوان یکسان کننده . 16srRNA به عنوان باثبات ترین ژن خانه دار بر اساس بیان طی شرایط مختلف رشد invitro (غنی ،حداقل، حضور سرم) تعیین شده بود.