تاخوردگی پروتئین ها در داخل بدن وشرایط ازمایشگاهی
استاد: دکتر پیشکار
دانشجو : مجتبی کریمی
رشته : ارشد ژنتیک دانشگاه آزاد الکترونیک
تاخوردگی پروتئین
برای درک تاخوردگی پروتئی باید درک درستی در مورد اصول کینتیک و ترمودینامیک داشته باشیم عمل تاخوردگی یک عمل برگشت پذیر میباشد
که در این فرمول حالت تا نخورده با حرف u نشان داده شده است و حالت تا خورده با حرف N نشان داده شده است
امروزه تاخودگی در تشخیص دلایل بیماری های مختلفی همچون الزایمر، سیستیک فیبروزیز ونورو پاتی بسیار حائض اهمیت هستند و یا حتی درنفخ معده میتوان رد پای این تاخوردگی ها را دید تا امروز تصور بر این بود که فقط اسید های نوکلئیک در انتقال بیماری ها نقش دارند ولی امروزه به اثبات رسیده که برخی بیماری ها فقط مربوط به تا خوردگی یک پروتئین میباشد
عوامل موثر در تاخوردگی پروتئین
در زنجیره های پروتئینی ،پروتئین های کروی قسمت خارجی آب دوست و قسمت مرکزی آب گریز است
عواملی که در تا خوردگی موثرند شامل
1-پیوندهای هیدروژنی
2-پل های دی سولفیدی
3-واکنش های اب گریزی و قطبی
تائیر این نیروها باعث ایجاد ساختار های سوم و تا خوردگی پروتئین و حتی سنگینتر شده انها میشود
البته با افزایش زیاد دما و نیز در حضور الکل یا اسید این ساختار ها در هم میشکند و این روند متوقف میشود
اندازه گیری پارامترهای مرتبط با کینتیک و تا خوردگی با وضعیت غیر تاخورده امکان توضیح علل دناتوره شدن را به ما میدهد
کاهش تاخوردگی معمولا با کاهش فلورسانس تشخیص داده میشوند
معمولا عمل تا خوردگی با مجموع عوامل و واکنش ها در یک زنجیره پلی پپتید رخ میدهد (نمودار بالا )
هرواکنش به طور انفرادی ضعیف است اما وقتی با هم انجام میشود وضعیت یک زنچیره پلی پپتید به حالت تاخورده در میاورد
در نمودار حاضر میبینیم که عوامل مختل کننده شیمیایی و دما تاثیر مهمی در امر دناتوراسیون دارند
اوره و گوانیدین هیدرو کلراید در تحقیقات بر روی دناتوراسیون بسیار کاربرد دارند که تائیر بسزایی در حلالیت مناطق قطبی و غیر قطبی پروتئین ها دارند
مطالعاتی که با ترکیبات مدلی توسط چارلزتانفورد در سال 1960 شروع شد نشان داد که انحلال پذیری اسیدهای امینه با افزایش اوره بیشتر میشود و به نظر میرسد به سطح قابل دسترسی زنجیره جانبی غیر قطبی بستگی داشته باشد
یک وضعیت تثبیت ساز شامل یونیزاسیون یک زنجیره فرعی داخلی است که در وضعیت تاخورده بدون بار است
وجود یک گروه بارداردر داخل یک پروتئین احاطه شده با واحدهای هیدروفوبیک بی ثبات کننده است و باعث باز شدن تا خوردگی میشود
موادی چون اوره و گوانیدین کلراید انحلال پذیری اسید های امینه را افزایش میدهند (نمودار پایین )
Lys، arg،asp ،glu، غالبا باردار هستند ودر سطح پروتئین ها قراردارند ودر تاخوردگی بسیار موثرند
تاخوردگی یک وضعیت مطلوب با کاهش انرژی ازاد میباشد
در یک واکنش تاخوردگی ساده ثابت تعادل به عنوان نسبت غلظت محلول به واکنش دهنده ها تغریف میشود طی این فرمول برای تاخوردگی تغییر در انرژی ازاد باید منفی باشد در هر شرایط در یک نمودار میزان غلظت پروتئن تاخورده و نخورده با روش فلورسنس اندازه گیری میشود و جمع جبری این دو باید 1 باشد
پروتئین هایی که معمولا شوک سرد نامیده میشونددرباسیلوس سابتیلیس مزوفیل و همتای ترموفیل آن بتا.کا لدولیتیکوس که به ترتیب شامل 67و66 واحدمی باشند دیده شدند و در 12 واحد با هم فرق دارند و تنها 2 واحد در پایداری دما نقش دارند Arg3و Leu66 که lu66درافزایش واکنش آب گریزی وArg در الکترواستاتیک نقش دارند تحلیل بازشدگی تاخوردگی ها حول فرمول زیر است که نتیجه ان این فرمول میشود انتالپی و انتروپی مرتبط با باز شدن تاخوردگی است مستقل از دما نیست ظرفیت گرمایی به عنوان تغییر در انتالپی با دما تعریف میشود
میزان بازشدن تاخوردگی پروتئین با تغییر درظرفیت گرمایی متفاوت است که تغییرات بسیار زیادی در انتالپی ایجاد میکند که به ترتیب cpuوcpf ظرفیت های گرمایی غیر تاخورده و طبیعی است ودلتا cp تغییر در ظرفیت گرمایی است که همراه با بازشدن تاخوردگی است در دمای Tمعادله زیرصدق میکند
اگرچه منطقی است که پروتئین با Tm بالا پایدار تر از پروتئین با مقادیر Tmپایین است اما این پارامتر یک عامل قوی وثابت نیست معادلات پایه وضعیت مربوط به تاخوردگی پروتئین نشان میدهد هنگامی که Tافزایش میابد دلتای Tتا اندازهای غالب میشود تا از دلتای Hبزرگتر شود در شکل زیردر یک کالوریمتری اسکن تفریقی سلول نمونه شامل پروتئی بعلاوه حلال است در حالی که سلول مرجع فاقد پروتئین در حجم های تقریبی 0/5 در هر سلول به کار می رود
در شکل زیر برای باز شدن تا خوردگی پروتئین که نشان دهنده نواحی قبل و بعد از دناتوراسیون و تصحیح خط پایه جهت رسیدن به تخمین صحیح است با روشهای کالریمتری نشان میدهد ظرفیت گرمایی مرتبط با وضعیت بدون تاخوردگی بزرگتر از ظرفیت گرمایی در حالت طبیعی است اما باید توجه کرد که هردو مقادیر + هستند
برروی یک دامنه دمایی گسترده تفاووت در ثابت تعادل با یک منحنی ،در مقابل یک خط مستقیم تعریف میشود این منحنی دارای 2 نقطه است که در آن ثابت تعادل 1 است و غلظت های اشکال تاخورده و غیر تاخورده برابر هستند اولین نقطه دناتوراسیون دمایی (Tm) است درحالی که نقطه دوم یک نقطه دناتوراسیون در دمای پایین را منعکس میکند دردماهای بالا و پایین مولفه آنتروپی در وضعیت غیر تاخورده غالب است با این حال نقطه دناتوره سرد زیر نقطه یخ زدگی آب قرار دارد و معمولا قابل دسترسی نیست یک روش مطرح در ارتقاء وضعیت بدون تاخوردگی با استفاده از دناتوره هایی چون اوره وگوانیدین هیدروکلراید است چرا که تفسیر منحنی های وضعیت بدون تاخوردگی معمولا ساده است
شکل زیر چهارمنحنی دناتوراسیون ایده ال نشان دهنده یک پروتئین با پایداری است
مطالعات آزمایش نشان میدهد که استفاده از اوره و کوانیدین هیدروکلراید یک توقف معنی دار در دناتوراسیون و ثابت تعادل را ایجاد میکند ریبو نوکلئاز طرح کلی تا خوردگی پروتئین در محیط آزمایشگاهی را مشخص میکند ریبو نوکلئاز کمک زیادی به درک ما از تاخوردگی پروتئین در محیط ازمایشگاه از طریق مطالعات برجسته ای که کریستین آنفیننس نموده است مینماید که این سوال را مطرح میکند که منشاء عوامل اصلی تاخوردگی چه میباشد ریبو نوکلئاز که دارای 124 واحد امینواسید و 4 پلی سولفات است هیدرولیز RNA را کاتالیز میکند کاهش پل های دی سولفید به صورت تیول ها به وسیله مرکاپتو اتانل درحضور اوره منجر به باز شدن تاخوردگی پروتئین و یک کاهش فعالیت همراه است آنفیننس اشاره میکند هنگامی که ریبو نوکلئاز اکسید میشود با حضور در مجاورت هوا و اوره با عمل دیالیز دفع میشود که فعالیت آنزیم به آهستگی در نتیجه تاخوردگی پروتئین ساختار سوم تشکیل و از همه مهم تر محل فعال آن بازیابی میشود تکرار این واکنش ها در حضورعامل دناتوراسیون منجر به احیای کمتر از 1درصد کل فعالیت انزیم میشود
اوره که از اتصال مناسب دی سولفید جلوگیری میکند منجر به ریبو نوکلئازی نامنظم میشود درحالی که درنبود آن شکل گیری صحیح پل دی سولفات امکان رسیدن به پایدارترین وضعیت تاخورده از لحاظ ترمودینامیک را میدهد این مطالعات کلاسیک نشان داد که تمام اطلاعات برای واحدهای تاخورده پروتئین در توالی اولیه لازم هستند مطالعات تاخوردگی شامل حذف توالی پشتیبان میباشد که نشان میدهد از دست دادن آن با کاهش تاخوردگی مجدد پروتئین همراه است در مقابل باز شدن تاخوردگی کل طول پیش پروتئینی منجر به یک آنزیم تا خورده جدید شد یک نقش اساسی در پایداری ترمودینامیک از سوی واکنش اب گریز است تا خوردگی پروتئین منجر به دفن زنجیره های فرعی به دور از آب و واکنش آنها با زنجیره های جانبی مشابه در داخل مولکول میشود در شرایط ترمودینامیک مولکولهای زنجره آب که خصوصا در وضعیت غیر تاخورده منظم میشوند از این وضعیت ازاد میشوند و حرکتی آزادانه دارند که در نتیجه انتروپی افزایش نمیابد و نقش مطلوبی را در تغییر انرژی آزاد کلی ایفا میکند شرایط انتالپی مطلوب شامل شکل گیری واکنش های تثبیت کننده در وضعیت طبیعی از طریق واکنش های باردار و پیوندهای هیدروژنی اندازی دلتا S و دلتا H از یک پروتئین به پروتئین دیگر متغییر است اما به نظر میرسد نتیجه تا حدی به مقادیر دلتا S وابسته میباشد
مسئله تاخوردگی و پارادوکس لونیتال
طرح راماجاندرا نشان میدهد که خیلی از ترکیبات دی هیدرال با ساختارهای ثانویه پروتئین سازگار هستند
که نتیجه این میشود که دریک پروتئن با میانگی 100 واحد تعداد ترکیبات احتمالی زیاد باشد
عوامل حاکم بر پایداری پروتئین
پایدار ترین وضعیت یک پروتئین حالت طبیعی آن است اما سوال این است عوامل مهم در پایداری چه هستند ؟
از مباحث مطرح شده میتوان فهمید که پل های دی سولفید یا پیوند های کوالانسی به طور کلی عامل اصلی پایداری هستند
یا به عبارت دیگر پیوند های کوالانسی هم باعث پایداری پروتئین های تا خورده و هم تا نخورده میشوند
اما واکنش های غیر کوالانسی شامل پیوندهای هیدروژنی ، نیروهای آب گریز و واکنش بین گروههای باردار است که جمعا در افزایش ثبات وضعیت طبیعی نقش دارند
معمولا نقش آنتروپی در تا خوردگی ها نامطلوب است و کاهش آنتروپی در مقابل تا خوردگی پروتئین عمل میکند و تا حد زیادی عامل تانخوردگی است پس پروتئین ها باید بر نیروهای انتروپیک و انتالپیک غلبه کنند تا بتوانند یک تاخوردگی مناسب داشته باشند
کینتیک تاخوردگی پروتئین
سوال این است که مقیاس زمانی تا خوردگی چیست ؟
این تحقیقات شامل قراردان پروتئین تانخورده در یک سیستم بافری است که تاخوردگی را ارتقاء میدهد که میتوان در مقیاس زمانی بین 1 ثانیه تا 10دقیقه ان را دنبال کرد یک روش ، روش کینتیک جریان متوقف شده است که در ان واکنش دهنده ها در یک سلول ترکیبی در یک فرایند دنبال شده با استفاده از تغییرات د رفلورسنس تشخیص داده میشوند در روشهای مدرن امکان اندازه گیری تغییرات وجود دارد اما از نظر تکنیکی موانع بسیاری وجود دارد
در آزمایش جریان متوقف شده (شکل بعدی ) سرنگ های تعبیه شده با فشار به واکنش دهندگان درون سلولی نیرو وارد میکنند که در نتیجه محلول حاصل را در کمتر از 1 دقیقه جابجا میکند که ان زمان مرده نامیده میشود این اندازه گیری واکنش تاخوردگی و مشخصا فعالیت جنبشی را موجب میشود که برای بدست اوردن نتایج مشاهدات (K0BS)و ماکسیمم دامنه (Ai) از فرمول زیر استفاده میشود
قانون هس
با اندازه گیری فعال سازی (دلتاG)و سایر مشخصات مرتبط وضعیت انتقال را تخمین میزنند قانون هس بیان میدارد که تغییر انتالپی کلی برای یک واکنش مستقل تا زمانی که محصولات اولیه و نهایی ثابت هستند یکسان است این قانون فقط اصل بقای انرژی را توضیح میدهد
اما جالب این است که واحدها در مرکز بتا یک پروتئین به سرعت شکل میگیرند اما بقیه در زمان طولانی تری تا میخورند
مدل های تاخوردگی پروتئین
سرعت های استثنایی تاخوردگی پروتئین با ثابت های زمانی کمتر از 5 میکرو ثانیه مشاهده میشوند اما اغلب پروتئین های با کمتر از 100واحد کند ترتا میخورند در اغلب دامنه های کوچک تا خوردگی با جمعیت ناپایدار واسطه های قابل تشخیص مشخص میشود این پروتئین ها نشان دهنده احتمال پیشبینی وضعیت تا خوردگی و زیر دامنه ها است امروزه ثابت شده است که پروتئین صفحات بتا ی کوچک نیز به یک طریق خیلی مشارکتی تا میخورند در حالی که دامنه صفحات بتای بزرگ خصوصا انهایی که دارای توپولوژی پیچیده هستند یک حد واسط دارند
تشکیل مارپیچ
شکل گیری بخش های ساختار مارپیچ با ثابت های زمانی حدود 1 میکرو ثانیه رخ میدهد واکنش ها با یک مرحله اولیه کند پیش میرود اغلب آزمایشات انجام شده در خصوص مارپیچ پروتئین با استفاده از هوموپلی پپتیدها ی جنبشی است اما این مسئله حائض اهمیت است که داده های زیادی در مورد مارپیچ پروتئین جمع اوری شده است اما این نشان میدهد که شکل گیری ساختار بتا به بیش از یک عنصر ساختار ثانوی برای تثبیت بستگی دارد و هیچ مدل و سیستم قطعی وجود ندارد و فقط مارپیچ پلی آلانین سنتتیک به طور منطقی و پایدار توصیف میشود
شروع تشکیل مارپیچ فرایندی کند و بسیار آهسته است و علت آن این است که 5 واحد باید وضعیتی دقیق داشته باشند تا اولین پیوند هیدروژنی بین واحد های 5و1 ایجاد شود
گلبول مذاب
در طی مطالعات تاخوردگی مشخص شد که وضعیت های حد واسط عامل خیلی از مشخصات تا خوردگی طبیعی است که میتوان آن را تشخیص داد این وضعیت را گلبول مذاب نامیده اند
که با یک ساختار فشرده مشخص شده است که شامل اغلب عناصر ساختار ثانویه هماند مارپیچ ها، ساختارهای پیچشی و رشته ها است
گلبول مذاب دارای یک هسته اب گریز و سازگار با زنجیرههای عمقی فرعی غیرقطبی بدور از حلال است به نظر میرسد که آن دارای ساختار ثانویه خاص اما بدون هیچ ساختار سوم باشد این وضعیت همانطور که گفته شد گلبول مذاب نامیده شده است
پروتئین هایی که وضعیت های گلبول مذاب مانند را نشان میدهند شامل خیلی از پروتئین های انحلال پذیر معروف ماننذد میو گلوبولین ، آلبومین و برخی از سیتو کروم ها میشود
این پروتئین ها تفاووت قابل توجه ای در محتوای ساختار ثانوی خود و نیز تاخوردگی های سوم دارند در مقابل برخی پروتئینها بدون واسط گلبول مذاب وجود دارد و یک نمونه جالب است خصوصا به این دلیل که لیزوزیم و آلفا لاکتا لبومین دو پروتئین متشابه ولی با ساختار تا خوردگی متفاووت هستند اگر چه وضعیت گلبول مذاب با پایداری و حضور ان درتعادل تحت شرایط دناتوراسیون جزئی تشخیص داده شده است
تاخوردگی پروتئین در شرایط درون بافتی
پروتئین ها تا میخورند تا وضعیت طبیعی را در محیط آزمایشگاهی ایجاد کنند اما ایا انها همین مسیرها ویا مکانیسم های مشابه را درداخل بدن بکار میگیرند ؟
سرعت ترجمه تقریبا 20 واحد در ثانیه است بااین حال بسیاری از پروتئین های قابل حل کوچک به طور کامل در100میکرو ثانیه تا میخورند تفاووت بین سرعت های ترجمه و تاخوردگی نشان میدهد محدودیت های درون بدن در فرایند های تاخوردگی دخیل است
PPI یکی از دو واکنش مهم اما اهسته مرتبط با تا خوردگی را کاتالیز میکند اولین انزیم از کلیه خوک در سال 1984 جدا شد اما در طی این زمان با تحقیق بر روی داروهای سرکوب کننده ایمنی سیکلوسپورین A که یک سرکوب کننده ایمنی قوی در جراحی پیوند اعضا ء استفاده میشوددر سلول کشف شد و ان را سیکلوفیلین نامیدند و مطالعات انجام شده نشان داد PPI جدا شده از کلیه خوک و سیکلو فیلین یکسان بودند اما ارتباط ان با T سل ها نامرتبط به نظر میرسید
علاوه بر سیکلو فیلین ها پروتئین های اتصال دهنده FK506 نشان دهنده گروههای مختلفی هستند که هومولوگ نیستند اما یک نقش بیوشیمیایی را به اشتراک میگذارند
دومین واکنش آهسته تاخوردگی پروتئین تشکیل پیوندهای دی سولفید است این واکنش با انزیم PPI کاتالیز میشود چون هر دو واکنش تا خوردگی سریع پروتئین را در محیط ازمایشگاه مهار میسازد که وجود آنزیم ها وقابلیت کاتالیزوری انها بر روی واکنش های اهسته شاهدی بر این مسئله است که میتواند مکانیسم های مشابهای برای تاخوردگی در بدن و ذر محیط آزمایشگاههی وجود داشته باشد
باتشکر از حسن توجه شما
و تشکر از استاد پیشکار