پاورپوینت اصول آزمون باکتریولوژی آب و اهمیت آن

اصول آزمون باکتریولوژی آب واهمیت آن

مقدمه
با توجه به جایگاه آزمایشگاههای بهداشت آب وفاضلاب بعنوان ابزارو اهرمهای نظارتی در کنترل کیفی آب آشامیدنی از آبگیر تا مصرف وتشخیص واندازه گیری عوامل آلاینده موثر در کیفیت آب وتاثیر گذار بر سلامت ( ماده 3آئین نامه بهداشت محیط ) وتجهیز وراه اندازی آن ( بر اساس تبصره 3 ماده 3) ،ارتقاء سطح علمی وعملی کارشناسان آزمایشگاههای فوق وآموزشهای دوره ای وباز آموزیها از اهمیت خاصی برخور دار است .

آزمون های باکتر یولوژی آب
هدف از آزمون های باکتر یولوژی آب: کنترل کیفی آب آشامیدنی ، آب برای مصارف بهداشتی ویا آبهای تفریحی ، از دیدگاه استانداردهای باکتر یولوژی است وهر کدام از این مصارف استانداردهای خاص وشاخص های ویژه خود را دارند.
تعریف آب آشامیدنی:آبی است که ویژگی های فیزیکی ،شیمیایی ،بیولوژیکی ورادیو اکتیو آن در حدی باشد که،مصرف آن جهت آشامیدن ،عارضه سوئی را در کوتاه مدت یا دراز مدت ،برای سلامت انسان، ایجاد نکند.

ادامه…
آب آلوده : آبی را آلوده گویند که ترکیب یا شرایط آن بطوری تغییر یافته باشد که کمتر یا به هیچ و جه قابلیت استفاده معینی را نداشته باشد . این تغییر شامل تغییرات فیزیکی ، شیمیایی وبیولوژیکی ورادیولوژیکی بوده ومی تواند به سلامت انسا ن و محیط زیست لطمه بزند.

آلودگی میکروبی آب آشامیدنی
آب خام حاوی دو دسته میکروارگانیسم است:
میکروارگانیسمهای دائمی که بطور طبیعی ساکن آب بوده ودارای نیازهای غذایی کمی هستند وشامل گونه های
Acinetobacter
Flavobacteriumو
Chromobacterium
میکرو ازگانیسم های گذرا که از محیط اطراف ( خاک ،انسان ، حیوان و.. )به آب منتقل می شوند و میکروارگانیسم های بیماری زا در این دسته قرار دارند.مانند سالمونلا ، شیگلا، اشریشیاکلی ، کریپتوسپوریدیوم و….

معیارهای شاخص میکروبی آب آشامیدنی
میکروارگانیسم هایی که بعنوان شاخص انتخاب می شوند:
این میکرو ارگانیسم ها باید عضو فلور طبیعی روده افراد سالم وجانوران خونگرم باشد
این میکروارگانیسم ها باید به سادگی، جداسازی، شناسایی و شمارش گردند.
این میکرو ارگانیسم ها نباید خودشان بیماریزا باشند.
این میکروارگانیسم باید هم در موقع وجود قطعی عامل بیماریزا و هم در موقع احتمال وجود عامل بیماریزا حضور داشته باشد.
تعداد این میکروارگانیسم باید بیشتر از آن تعدادی باشد که برای شناسایی عوامل بیماریزا لازم است
این میکروارگانیسم ها باید نسبت به شرایطی محیطی مقاوم باشد و به اندازه عوامل بیماریزا و کمی بیشتر از آنها بتواند فرایندهای تصفیه آب و فاضلاب را تحمل کنند.

انتخاب شاخص باکتر یولوژی
با توجه به ویژگیهای ذکر شده ، در حال حاضرگروه کلیفرم (کلیفرم گرماپای ) به عنوان شاخص های استاندارد وشاخص های اصلی آلودگی مدفوعی آب آشامیدنی به کار می روند.
گروه کلیفرم شامل باکتری های اشریشیاکلی، سیتروباکتر،انتروباکتر وکلبسیلاکه از خانواده انترو باکتر یاسه می باشندو از دسته باکتری های هوازی وبیهوازی اختیاری ، گرم منفی بدون اسپور ومیله ای شکل که قادرند لاکتوز را را در دمای 35 درجه سانتیگراد به مدت 48 ساعت تخمیر نمایند.

میکرو ارگانیسم نشانگر
اشریشیاکلی به عنوان میکروارگانیسم نشانگر ، بر ای آلودگی مدفوعی انتخاب شده است،. اگرچه کلیفرم های گرماپای نیز می توانند به عنوان یک متغیر مورد آزمایش قرار گیرند وجود این باکتری ها در آب نشان دهند ه ناکافی بودن فرآیند تصفیه و همچنین آلودگی متناوب و اخیر آب با مدفوع انسان و حیوانات خونگرم می باشد.
کلیفرم های گرماپای به غیر از اشریشیاکلی مانند کلبسیلا از خانواده آنتروباکتریاسه می توانند از طریق آب های آلوده شده با فاضلاب صنعتی، گیاهان در حال فساد و خاک نیز وارد آب شوند .

سایر گزینه های مختلف به عنوان شاخص میکروبی آب
میکرو ارگانیسم های دیگری که ، به عنوان تعیین منشاء آلودگی آب با مدفوع و نشان دهنده آلودگی مدفوعی آب پیشنهاد گردیده است ودر تعیین منشاء آلودگی آب با مدفوع ،ارزیابی و کارایی روش های تصفیه وگند زدایی آب مهم می باشند. آنتروکوک های مدفوعی وکلستریدیوم های احیاء کننده سولفیت می باشند ، که می توان از آنها به عنوان یک نشانگر اضافی استفاده نمود.

ادامه…
کلستریدیوم های احیاء کنند ه سولفیت در مقایسه با کلیفرم ها و آنتروکوک ها نسبت به عوامل فیزیکی و شیمیا یی مقاوم تر هستند و اسپور آنها برای مدت طولانی در آب باقی می ماند. بنابراین وجود آن ها در آب نشان دهنده وقوع آلودگی آب در گذشته و همچنین ناکافی بودن فرآیند تصفیه است.
علیرغم مزایای فوق برخی خصوصیات این گروه موجب کاهش ارزش آنها به عنوان شاخص آلودگی گردیده است. این خصوصیات عبارتند از:
تعداد آنها در مدفوع انسانی کمتر از کلیفرم ها است که در تشخیص آلودگی مدفوعی انسان کم اهمیت تر از کلیفرم ها به نظر می رسد

ادامه…
در بعضی موارد برای تعیین وضعیت وصحت آزمایشهای مشکوک از سایر شاخص ها استفاده می شود. بعنوان مثال وقتی نمونه های با تعداد زیاد کلیفرم و بدون وجود آلودگی مدفوعی باشند،آنتروکوک های روده ای به عنوان شاخص کارایی سیستم تصفیه پیشنهاد می شود.
مزایای استرپتوکوک مدفوعی نسبت به کلیفرم ها به عنوان شاخص آلودگی عبارتند از:
استرپتوکوک مدفوعی به ندرت در آب تکثیر و رشد مجدد پیدا می کند.
نسبت به شرایط نامساعد و استرس های محیطی و کلرزنی مقاومت بیشتری دارد

ویژگیهای میکروبیولوژی آب آشامیدنی

شاخص های آب برای مصارف تفریحی
آلودگیهای احتمالی وشرایط غیر بهداشتی آب استخرهای شنا ممکن است خطرات عمده ای را برای سلامت افراد در ارتباط با بیماریهای منتقله از آب ایجادنماید بنا بر این لزوم تعیین شاخص و معیار بهداشتی و تطبیق با ضوابط واستاندارد ها در رابطه با کیفیت باکتر یولوژی آب استخر های شنا از اهمیت ویژه ای بر خور دار است

شاخص ها وویژگیهای باکتر یولوژی آب استخرهای شنا

شاخص باکتریولوژی آب شناگاههای طبیعی
مطالعات نشان داده است: انتروکوکسی که از دسته باکتریهای ساکن روده بزرگ انسان وسایر حیوانات خونگرم است ،در شرایط نامناسب محیط مقاومت بیشتری از خود نشان میدهد و از اشریشیا کلی پایدارتر است، از شاخص های باکتر یولوژی شناگاهها می باشد . حدود توصیه شده برطبق توصیه سازمان جهانی بهداشت برای شناگاههای طبیعی :
انتروکوکسی :کمتر از40 در صد میلی لیتر

پایش آب آشامیدنی
پایش آب بر مبنای دوفاکتور اصلی استوار است :
پایش آب با بازرسی مستمر از سیستم های تولید آب از آبگیر تا مصرف
نمونه برداری از آب به منظور آزمونهای باکتر یولوژی وشیمیایی
پایش باکتر یولوژی آب با تشخیص باکتریهای کلیفرم وکلیفرمهای گرماپای وسایر آزمونهای باکتریولوژی با توجه به کنترل های مورد نیاز می باشد.بنا بر این لازم است که آبهای آشامیدنی بطور مستمر وطبق دستورالعمل های استانداردنمونه برداری و مورد آزمون باکتریولوژی قرار گیرند.

نمونه برداری

تعریف نمونه برداری: فرایند برداشت قسمتی از آب است که نمایانگر کل آن فرض می شود.
بطور کلی هدف از نمونه برداری تعیین کیفیت آب و مطابقت با استانداردها و پایش کارایی فرایند تصفیه آب، همچنین با تعیین نوع ، میزان و منبع آلودگی انجام می شود.
پس بنابراین :نمونه برداری باتوجه به هدف آزمون باید به نحوی انجام شود که نمونه تهیه شده نمایانگر کل باشند.
اهمیت نمونه برداری استاندارد در تعیین نتیجه نهایی آزمایش آب بسیار مهم وبا ارزش است

عوامل موثر در نمونه برداری
عوامل مختلف مانند:
درجه حرارت
زمان نگهداری
انتقال نمونه
کاربرد اصول صحیح نمونه برداری
از جمله عوامل موثردررشد وتکثیر میکروارگانیسم هاو نتایج آزمون می باشند.

شرایط نگهداری وانتقال نمونه
پس از نمونه برداری نمونه ها بایددر دما ی4 -8 درجه سانتیگراد حد اکثر در فاصله زمانی 2 ساعت بعد از نمونه گیری به آزمایشگاه منتقل شوند
در صورت بعد مسافت ودر دسترس نبودن آزمایشگاه،نگهداری نمونه با رعایت زنجیره سرد ( استفاده از ice PACK ویا داخل cold box )در دمای 4- 8 درجه سانتیگرادباید باشد.
آزمون آبهای آشامیدنی برای آزمایشهای کلیفرم واشریشیاکلی، فاصله بین نمونه برداری تا ازمایش نباید بیشتر از 30 ساعت شودو نمونه هادردمای کمتر از 8 در جه سانتیگراد به آزمایشگاه انتقال ونگهداری شوند. وبرای آزمون هترو تروفیک از 8 ساعت نباید تجاوز نمایدودمای انتقال به آزمایشگاه ونگهداری کمتر از 8 درجه سانتیگراد باشد.

ادامه…

در آبهای غیرآشامیدنی مانند : منابع آب، رودخانه ها، آبهای تفریحی ونمونه های فاضلاب، ماکزیمم زمان 6ساعت در دمای کمتر از 8 درجه سانتیگراد وانجام آزمایش در عرض 2 ساعت می باشد، در صورت طولانی تر شدن زمان (بیشتر از 6 ساعت) نمونه به آزمایشگاه ، از آزمایشگاههای صحرایی باید استفاده نمود.

برای آزمایش پروتوزوآ ( کریپتوسپوریدیوم و ژیاردیا) زمان نگهداری حد اکثر96 ساعت در دمای کمتر از 20 درجه سانتیگراد

آماده سازی شیشه های نمونه برداری
ظروف نمونه برداری ممکن است از شیشه یا پلاستیک های مختلف(پلی پروپیلن، پلی استیرن، پلی اتیلن و پلی کربنات)باشد معمولاً ظروف شیشه ای برای استفاده مجدد و ظروف پلی اتیلنی . برای موارد یکبار مصرف ترجیح داده میشود.
برای انجام آزمایشات روتین باکتر یو لوژی نمونه برداری در بطریها ی شیشه ا ی درب سـمباده ای یا در پیچ دار با گنـجایش 250 -300 میـلی لیتر انجام میـشود . که در فـور یا اتـو کلاو استریل شده اند
غیر فعال سازی ماده گند زدا
برای خنثی کر دن کلر باقیـمانده به بطریهای نمونه برداری قبل از استریل کردن تیوسـولفات سدیم : ( با غلظت 10% که به ازای هر 120 میلی لیتر 0/1 میلی لیـتر تیو سولفات می افزاییم این مقدار تا 15 میلیگرم در لیتر کلر باقیمانده را خنثی می نماید ویا ( با غلظت 3% که به ازای هر 120 میلی لیتر 0/1میلی لیتر تیو سولفات می افزاییم این مقدار تا 5 میلی گرم در لیتر کلر با قیمانده را خنثی میکند )

برای تهیه تیوسولفات متناسب باتعداد آب تبلور موجود در فرمول شیمیایی آن مطابق با جدول زیر عمل می نماییم

ادامه…
برای نمونه برداری از آبهایی که شامل مس وروی بالاتر از 1 < میلی گرم در لیتر یا نمونه های فاضلاب دارای فلزات سنگین می باشند، باید از معرفات چلات کننده استفاده نمود تا سمیت فلزات سنگین را خنثی کنند. بویژه زمانی که انتقال چنین نمونه هایی برای 4 ساعت یا بیشتر طول می کشد.
برای رفع این مزاحمت 0/3 میلی لیتر محلول 15% اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (( EDTA به ازاء هر 120 میلی لیتر نمونه افزوده ویا میتوان آن را با تیوسولفات سدیم قبل از افزودن مخلوط کرده وبه بطری نمونه برداری قبل از استریل شدن اضافه نماییم.

سترون سازی بطریهای نمونه برداری
بطری ها را پس از تمیز کردن با آب دیونیزه یا آب مقطر آبکشی کنید سپس بطری را در اتوکلاو با دمای (° C3±121) به مدت 15 دقیقه سترون کنید. در صورت لزوم بطری ها را در آون برای مدت حداقل 1 ساعت در دمای (°C10±170)سترون کنید

استرلیزاسیون ظروف شیشه ای در حرارت خشک نباید کمتر از 60 دقیقه در 170 درجه سانتیگراد باشد، چنانکه از یکنواخت بودن حرارت آون وثبت دمای یکنواخت آن اطلاع داشته باشیم ،در شرایط استثنایی ،از حرارت 160 درجه سانتیگرادمی توان استفاده نمود.
استرلیزاسیون ظروف شیشه ای در ظروف فلزی در 170 درجه سانتیگراد نباید کمتر از 2 ساعت باشد .
رطوبت موجود در ظروف شیشه ای پس از استریل شدن با اتو کلاورا ، باقرار دادن ظروف به مدت 10-15 دقیقه در حرارت 100 درجه سانتیگرادمی توان خشک نمود.

ادامه…
(تاریخ سترون سازی ظروف باید قابل ردیابی باشد)
در صورتی که سترون سازی ظروف با هیچ روش دیگری امکان پذیر نباشد، می توانید ظروف و درپوش آن را با غوطه وری در آب جوش برای مدت حداقل 30 دقیقه گندزدایی کنید.
بلافاصله پس از جوشیدن آب ظروف را خالی کنید و پس از بستن درپوش، آن را در کاغذ تمیز بپیچید

حجم مورد نیازنمونه برای آزمون های باکتر یولوژی آب
برای انجام برخی از آزمون ها مانند آزمون میکروارگانیسم های زیر حجم هایی از نمونه به شرح ذیل لازم است :
الف. برای گونه های مختلف میکروارگانیسم ها برای هر میکروارگانیسم 250 میلی لیتر
ب . برای گونه های ویبریوکلرا سه لیتر تا پنج لیتر
پ . برای گونه های لژیونلا یا گونه های سالمونلا، تا یک لیتر
ت . برای ویروس ها، کیست ژیاردیا، اووکیست کریپتوسپوریدیوم و آمیب بسته به نوع آب ده لیتر تا چند صد لیتر یا بیشتر مورد آزمون قرار می گیرد

کنترل کیفی
برنامه کنترل کیفی شامل یک سری عملیاتی است که بکار گرفته می شود تا اشتباهات راندوم وسیستماتیک مربوط به وسایل ، تجهیزات ، معرفات، نمونه برداری، روش های نمونه برداری وازمایش ، ثبت اطلاعات و گزارشات وخطاهای مربوط به عملکرد اپراتور را به حد اقل برساند.
بنا بر این لازم است که در این راستا معرفات ،ترمومترها ، pH متر، اتو کلاو، فور، انکوباتور، یخچال ، فریزر، تجهیزات صافی غشایی ، میکروسکوپ، هود بیولوژیک، محیط های کشت و… کنترل شوند
که هرکدام از موارد فوق دستورالعمل های وتناوب کنترل کیفی خاص خودشان را دارند
بعنوان مثال : درجه حرارت یخچال باید روزانه ، انکوباتور 2 بار در روز وpH برای هربار استفاده کنترل شوند.

کنترل کیفی ظروف مواد خنثی کننده کلر
از آنجا که تیو سولفات بعنوان ماده خنثی کننده کلر به شیشه نمونه برداری اضافه می شود.،وجود آن را طبق زیر می توان به روش یدومتری بررسی کرد.
مقدار 10 میلی لیتر آب مقطر را به بطری های نمونه برداری حاوی مواد خنثی کننده بیافزایید سپس آن را با محلول ید mol/l 5% تیتر کنید. از نشاسته جهت تعیین نقطه پایانی تیتراسیون استفاده نمایید .

کنترل کیفی ظروف نمونه برداری
آزمون کننده باید از استریل بودن ظروف نمونه بردای اطمینان حاصل کند ظروفی که به طور تجاری تهیه می شوند باید همراه با گواهی سترونی در شرایط قابل قبول به آزمایشگاه تحویل داده شوند.
سترونی بطری ها با کنترل فرایند سترون سازی تضمین می شود در غیر اینصورت آزمون سترونی ظروف باید انجام شود مثال هایی از روش آزمون که معمولاً برای 1% بطری ها انجام می شود به شرح زیر:

ادامه…
مقدار 20 تا 50 میلی لیتر آگار مغذی ذوب شده(پلیت کانت آگار) را درون بطری بریزید و بوسیله چرخاندن بطری سترونی در حالیکه آگار سرد می شود (درصورت لزوم استفاده از جریان آهسته آب)دیواره های ظروف را با،لایه ای از آگار بپوشانید سپس ظروف را در دمای (°C2±22) برای مدت 5 روز گرمخانه گذاری کنید. پس از پایان این مدت نباید رشد قابل مشاهده ای در بطری ها دیده شود.
مقدار 20 تا 50 میلی لیتر محیط کشت مایع تیوگلیکولات یا سایر آبگوشت مغذی را درون بطری بریزید برای آغشته کردن دیواره ها بطری های سترون شده را بچرخانید و سپس آن را در دمای (°C2±22) به مدت زمان پنج روز گرمخانه گذاری کنید پس از پایان این مدت نباید کدورتی در بطری دیده شود

کنترل کیفی محیط های کشت
برای کشت میکروارگانیسم ها از محیط های کشت و محلول های رقیق کننده که به صورت آماده در دسترس هستند و یا طبق دستورالعمل شرکت سازنده آنها را آماده می کنند می توان استفاده نمود.
محیط های کشت و محلول های رقیق کننده را پس از تهیه در ظروف مناسب تقسیم و در اتوکلاو در درجه حرارت (° C3±121) به مدت 15 دقیقه سترون می کنیم. اگرچه در بعضی از موارد ممکن است استفاده از دما و زمان خاص لازم باشد. برای سترون سازی مواد حساس به حرارت در صورت توصیه سازنده می توان از صافی غشایی با اندازه روزنه mµ0/2 استفاده نمود.
محیط های کشت پس از تهیه، از نظر صحت استریل بودن باید کنترل شوند 5% از محیط های کشت خام را به مدت 24 ساعت در 37 درجه کشت داده و کدورت آنرا بررسی می نماییم

نگهداری محیط های کشت
مامبران فیلتر براث در فلاسک های در پیچ دار در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 96 ساعت
مامبران فیلتر آگار در پلیت با پوشش های مناسب در دمای 4 درجه سانتیگرادبه مدت 2 هفته
محیط های آماده شده آگار یا براث در لوله های سر بسته مناسب در دمای 4در جه سانتیگراد به مدت 2هفته .
محیط های کشت آگار یا براث در لوله های در پیچ دار محکم در 4در جه سانتیگراد به مدت 3 ماه .
پلیت های آگار دار با درب شل ونگهداری درکیسه های پلاستیکی سر بسته دردمای 4 در جه سانتیگراد به مدت 2 هفته .
حجم زیاد آگار در ظروف بزرگ با درب محکم ( در پیچدار ) یا در لوله در 4در جه سانتیگراد به مدت 3 ماه .

ادامه…
محیط های کشت هنگامی که بسته محیط کشت باز میشود. تاریخ را روی برچسب ظرف یادداشت و برای آن حداکثر زمان نگهداری را رعایت کنید.
پیش از استفاده محیط کشت را به دقت از نظر آلودگی، تبخیر بیش از حد یا سایر شواهد فساد بررسی کنید.

انتخاب روش آزمون کلیفرم

گروه کلیفرمهااز دسته باکتری هایی هستند که بعنوان شاخص آلودگی باکتر یولوژیکی آب آشامیدنی پذیرفته شده اند وروشهای متفاوتی برای شمارش آنها بعنوان روش استاندارد در مراجع معتبر ارائه شده است . یکی از روشهای رایج روش تخمیر چند لوله ای است.

چنانکه نمونه برداری از شبکه توزیع آب آشامیدنی کلرینه با کلر باقیمانده در محدوده استاندارد(0/8-0/5) انجام شده باشد، روش 5 لو له ای ( هر لوله حاوی 10 سی سی لاکتوز براث قوی) +10 سی سی یا +20 سی سی نمونه ، استفاده شود.
تفاوت حجم نمونه 10 سی سی با 20 سی سی دقت را بالا می برد وبرای محاسبه MPN آنها مراجعه به جدول ویا استفاده از فرمول می باشد.

ادامه…

چنانکه نمونه برداری از شبکه توزیع آب آشامیدنی غیر کلرینه ، کلر باقیمانده صفرو یا کلر باقیمانده پایین تر از حد استاندارد انجام شده با شد،روش 9 لوله ای ویا 15 لوله ای قابل اجرامی باشد . که ا لبته 15 لوله ای چون تعداد لوله ها بیشتر می باشد دقت بیشتری دارد .

چنانکه نمونه برداری از آب خام وغیر آشامیدنی یا آب آلوده انجام شده است روش 15 لو له ای ویا 9 لو له ای با چندین رقت متوالی (بیشتر از سه رقت) استفاده شود.

ادامه…
در انتخاب روش 5 ،9 ویا 15لوله ای باید روشی انتخاب شود که حد اقل یک لوله منفی بعد از سپری شدن زمان کشت 2± 48 ساعت در دمای5/0 ±35 درجه سانتیگرادداشته باشیم . چنانکه همه لو له ها بعد از 48 ساعت در دمای 35 درجه مثبت شود روش مورد استفاده قابل قبول نبوده وباید روش با رقت های بیشتری را بکار برد .
MPN/100 با استفاده از فرمول توماس به صورت زیر قابل محاسبه می باشد

npos تعداد لوله های دارای واکنش مثبت
Vs حجم مرجع
Vneg حجم نمونه در لوله های منفی
Vtot حجم نمونه در تمام لوله ها

با تشکر از توجه شما