روشهای تعیین فساد اکسیداتیو در چربی ها و روغن ها
I. مقدمه
اتو اکسیداسیون یک فرایند طبیعی است که بین مولکول های اکسیژن و اسید های چرب غیر اشباع اتفاق می افتد. اتو اکسیداسیون اسید های چرب غیر اشباع در حقیقت مکانیسمی از زنجیره رادیکال های آزاد تلقی می گردد که متشکل از سه مرحله ابتدایی (معادله 1)، مرحله انتشار (معادله 2 و 3)، و همچنین مرحله پایانی (معادله 4 تا 6)، میباشد. مرحله ابتدایی با جدا شدن هیدروژن مجاور پیوند دوگانه موجود در یک مولکول اسید چرب شروع می گردد که می تواند توسط نور، حرارت و یونهای فلزی به صورت رادیکال آزاد درآید. رادیکال آزاد آلکیل (R°) با اکسیژن اتمسفر واکنش میدهد و به صورت رادیکال آزاد پراکسی ناپایدار در می آید. سپس موجب جداشدن اتم هیدروژن از اسید چرب غیر اشباع به صورت هیدروپراکسید (ROOH) و رادیکال آزاد آلکیل می گردد. این رادیکال آزاد آلکیل به نوبه خود موجب پیشرفت بیشتر اکسیداسیون وهمچنین واکنش زنجیری خواهد شد .واکنش زنجیری می تواند توسط تشکیل محصولات غیررادیکالی که از ترکیب دو گونه رادیکال به وجود می آید، پایان یابد.
مرحله ابتدایی
RH R°+ H° (1)
مرحله انتشار
R° + O2 ROO° (2)
ROO° + RH ROOH + R° (3)
مرحله پایانی
R° + R° RR (4)
R + ROO° ROOR (5)
ROO° + ROO° ROOR + O2 (6)
مکانیسم اتواکسیداسیون لیپیدها توسط Farmer و همکارانش فرضیه سازی شد. مرحله انتشار در فرایند اتواکسیداسیون در زمانی که تشکیل هیدروپراکسید به کمترین مقدار خود می رسد، به صورت induction period رخ می دهد. میزان اکسیداسیون اسید های چرب با توجه به درجه غیر اشباعیت افزایش می یابد. میزان اتواکسیداسیون اولئات، لینولئات و لینولنات به ترتیب برابر با 100:50 – 40:1 بر حسب دریافت اکسیژن و 1:12:25 بر اساس تشکیل پراکسید می باشد. بنابراین روغن هایی که حاوی میزان بالاتری از اسید چرب غیر اشباع چندگانه میتوانند در معرض مسائل فراوانتری از لحاظ پایداری قرار گیرند. تجزیه محصولات هیدروپراکسید نظیر الکلها، آلدهیدها، کتون ها و هیدروکربن ها معمولاً موجب تولید طعم های نامطلوب می گردد .همچنین این ترکیبات می توانمند با سایر ترکیبات موادغذایی واکنش داده و منجر به تغییر عملکرد و ویژگی های تغذیه ای آن ها شوند.
II. تعیین فشار اکسیداتیو
روش های مختلفی برای اندازه گیری اکسیداسیون لیپید ها در مواد غذایی وجود دارد. تغییرات به وجود آمده در خصوصیات شیمیایی، فیزیکی و ارگانولیتیکی چربی ها و روغن ها در طول اکسیداسیون می تواند برای تعیین میزان اتکسیداسیون لیپیدها ارزیابی گردد. هرچندکه هنوز هیچ روش مشخص و استانداردی برای تعیین اکسیداتیودر طیف وسیع انواع مواد غذایی وجود ندارد. روش های موجود برای تعیین اکسیداسیون لیپیدها در مواد غذایی سیستم های بیولوژیکی می توانند در قالب دو گروه طبقه بندی شوند. گروه اول تغییرات اکسیداتیو و گروه دوم تغییرات ثانویه را در هرسیستم مشخص می نماید.
الف) تغییرات اولیه
1) تغییرات واکنشگرها
روشهایی که تغییرات اولیه لیپیدها را اندازه گیری میکنند، براساس میزان کاهش واکنشگرهای این فرایند (اسید چرب غیر اشباع) طبقه بندی میگردند. البته این نوع اندازه گیری برای تعیین اکسیداسیون لیپیدها مورد استفاده واقع نشد چرا که این روش مستلزم استخراج کلی لیپیدها از مواد غذایی و متعاقب آن تبدیل به مشتقات مناسب جهت آنالیز با روشهای کروماتوگرافی گازی میباشد. جداسازی لیپیدها به انواع خنثی، گلیکولیپید، فسفولیپید و سایر انواع نیز ضروری تلقی می گردد. هرچند که اثبات شده این روش می تواند به عنوان تکنیکی مناسب و کارآمد جهت تعیین نوع لیپیدها و اسیدهای چربی که درتغییرات اکسیداتیو نقش دارند، به کار رود. از سوی دیگر با این تکنیک می توان اکسیداسیون ناشی از کمپلکس فلزات را ارزیابی نمود. تغییرات به وجود آمده در ساختمان اسیدهای چرب نمی تواند در بیشتر روغن های اشباع مورد استفاده قرارگیرد چراکه این شناساگر صرفاً تغییرات به وجودآمده دراسیدهای چرب غیر اشباع رادر طول اکسیداسیون نشان می دهد. به طورکلی تغییرات اکسیداتیو روغن های دریایی و همچنین روغن های گیاهی غیراشباع را می توان توسط این روش مطالعه و بررسی نمود.
2) اضافه شدن وزن
به طور کلی اضافه شدن اکسیژن به لیپیدها وتشکیل هیدروپراکسیدها در طول مراحل اولیه اکسیداسیون به طور معقولی کمی است. بنابراین اندازه گیری induction period بر طبق داده های کمی به نظر صحیح می رسد. در این روش نمونه روغن (در حدود0/2گرم) در ظرف پتری توزین می شود سپس مقدار آب اندک موجود در نمونه با قرار دادن آن به مدت یک شب در آون خلاء در دمای C° 35 خارج می شود. پس از آن ظرف دسیکاتور قرار داده می شود. نمونه ها مجدداً توزین و در آون به منظور تنظیم درجه حرارت قرار داده می شوند. Olcott و Einset این طور گزارش کردند که روغنهای گیاهی افزایش وزن نسبتاً زیادتری در انتهای induction period از خود نشان می دهند و در صورت افزایش وزنی در حدود 5/0-3/0درصد در دمای C°60-30 دچار فساد خواهند شد. Ke و Ackman نیز این روش را ساده و کارآمد توصیف نمودند و برای مقایسه اکسیداسیون لیپیدهای بخشهای مختلف ماهی کاربردی دانستند.
شکل 1: تاثیر آنتی اکسیدانهای تجاری بر اضافه شدن وزن روغن کانولا نگهداری شده در دمای 65 درجه سانتی گراد
اخیراً شهیدی و همکاران نیز این روش را برای مقایسه قابلیت پایداری روغن های گیاهی ودریایی در زمان ذخیره سازی که به آن ها آنتی اکسیدان اضافه شده بود مورد بررسی قرار دادند. از سوی دیگر این محققان با این روش به مقایسه فعالیت نسبی آنتی اکسیدان های به کار رفته نیز پرداختند. هرچند که قرارگیری نمونههای روغن در معرض هوا پارامتر مهمی در تعیین میزان اکسیداسیون تلقی می گردد. بنابراین انتخاب اندازه مناسب ظرف برای نگهداری نمونه ها در هنگام آزمایش ضروری است. به طور کلی اضافه وزن دارای معایب ذیل میباشد:
1) دمای پائین و یا معمولی نیازمند مدت زمان آنالیز طولانی تری می باشد.
2) حرارت دهی غیر مداوم نمونه ها می تواند موجب تولید محصولات نامناسب گردد.
3) این روش وابستگی زیادی به حضور نیروی انسانی دارد.
4) شرایط آزمایش (اندازه نمونه، شکل ظرف ودرجه حرارت) می تواند بر روی نتیجه نهایی تاًثیر بگذارد.
هرچند که این روش دارای مزایای زیادی نظیر هزینه پائین راه اندازی، ظرفیت نا محدود و سرعت فرآوری نمونه می باشد.
3) هیدروپراکسیدها
در اکسیداسیون چربی ها و روغن ها، میزان تشکیل اولیه هیدروپراکسیدها می تواند افزایش میزان تجزیه روغن موردنظر را به همراه داشته باشد، این در حالی است که در مراحل انتهایی، این موضوع برعکس خواهد بود. بنابراین کنترل میزان هیدروپراکسیدها در طول زمان این امکان رافراهم می آورد تا میزان تجمع این ترکیب را در ماده غذایی مشخص نمود. این اطلاعات راهنمای مناسبی برای پذیرش کلی فراورده های غذایی مورد استفاده قرار گیرد.
اندیس پراکسید
روش کلاسیک برای کمی نمودن هیدروپراکسیدها، تعیین اندیس پراکسید میباشد. در حقیقت می توان چنین اذعان داشت که میزان هیدروپراکسید به اندیس پراکسید بر می گردد. اندیس پراکسید توسط روش یدومتری اندازه گیری می شود. این روش بر اساس کاهش گروه های هیدروپراکسید (ROOH) با یون یدید (I-) بنا نهاده شده است. میزان ید آزاد شده بیانگر میزان پراکسید خواهد بود.
واکنشهای شیمیایی درتعیین اندیس پراکسید به شرح ذیل می باشند:
ROOH + 2H+ + 2KI I2 + ROH + H2O + 2K+
I2 + 2Na2S2O3 Na2S4O6 + 2NaI
معایب این روش شامل جذب ید در مناطق غیر اشباع اسید های چرب و همچنین آزادسازی ید از یدید پتاسیم توسط اکسیژن موجود در محلول تیتراسیون می باشد. از سوی دیگر نتایج بدست آمده می تواند تحت تاًثیر ساختار و دهمچنین درجه حرارت و مدت زمان واکنش قرار گیرد. روش یدومتری برای تعیین اندیس پراکسید قابل کاربرد برای تمامی انواع چربی ها و روغن هاست اما در عین حال توجه به این نکته ضروری است که این روش بسیار تجربی است و هرگونه تغییری در اجرای روش می تواند بر نتیجه نهایی اثر گذار باشد. البته این روش برای اندازه گیری اندیس پر اکسید در مقادیر اندک قابل کاربرد نیست چرا که تعیین نقطه پایانی تیتراسیون با مشکلاتی مواجه خواهد شد. بنابراین روش تیتراسیون یدومتری به منظور تعیین اندیس پر اکسید با هدف افزایش حساسیت برای اندازه گیری مقادیر اندک پر اکسید، مورد تغییر و تجدید نظر قرار گرفت. تغییرات اعمال شده شامل جایگزینی مرحله تیتراسیون با روش الکتروشیمی بود که در نتیجه آن ید آزاد شده توسط الکترود پلاتین احیا شده و موجب برقراری پتانسیل ثابتی می شود. بر طبق این تکنیک می توان اندیس پراکسید را در مقدار 20-06/0 میلی اکی والان بر کیلوگرم مورد شناسایی قرار داد اما لازمه آن هواگیری تمامی محلول ها برای جلوگیری از تشکیل مقادیر بیشتر پراکسید می باشد. روش های شیمیایی دیگری نیزبرای بررسی اندیس پراکسید توسط محققان پیشنهاد شده است. روش های رنگ سنجی بر اساس اکسیداسیون Fe2+ و Fe3+ و همچنیتن تعیین Fe3+ به عنوان فریک تیوسیانات و روش 2و6-دی کلرو فنول- ایندوفنول نیز جزء روش های ارائه شده توسط پژوهشگران مختلف بوده است. در بررسی های بافت های بیولوژیکی و مایعات، اندازه گیری هیدروپراکسید های اسید چرب نسبت به محصولات تجربه شده آن ها عمومیت بیشتری دارد. هیدروپراکسید های اسیدچرب میتوانند توسط کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا(HPLC) و همچنین سایر محصولات احیا شده ی اسید هیدروپراکسی نیز می توانند به وسیله کروماتوگرافی گازی- اسپکترومتری جرمی (GC-MS) اندازه گیری شود. روش فلوئورسانت یکی دیگر از این روشهاست که برایتعیین هیدروپراکسیدها به کارمی رود. در این روش به هیدروپراکسیدها اجازه واکنش با مواردی نظیر لومینول و دی کلروفلوئورسین داده می شود. هرچند که تعیین اندیس پراکسید بسیار معمول است اما کاربرد آن محدود به مراحل آغازین اکسیداسیون لیپیدها میباشد.
4) روش اکسیژن فعال و اندیس پایداری روغن
روش اکسیژن فعال (AOM)، که با نام روش آزمون Swift نیز در انجمن شیمیدانان روغن خوانده میشود، روشی سریع برای سنجش ثبات و پایداری چربیها و روغن ها میباشد. دراین روش، هوا به صورت حبابهایی درون روغن داغ با دمای C°100-98 درزمان های مختلف دمیده می شود و بر این اساس اندیس های پراکسید تعیین می گردد. پس از آن، این اندیسها بر روی نمودار هایی با مبنای زمان و induction period ترسیم خواهند شد. هرچند که این روش برای سال های متمادی است که مورد استفاده قرار میگیرد اما نقاط ضعف و عیوبی آن نیز تا حدودی مشخص شده است. این موارد را میتوان به صورت ذیل بیان نمود:
1) نقطه پایانی توسط میزان پر اکسیدها در روغن اکسید شده مشخص میگردد. این در حالی است که پراکسیدها از لحاظ ساختاری بسیار ناپایدارند و به سرعت به فرآوردههای ثانویهای با پایداری بیشتر تبدیل میشوند.
2) در طول فاز اکسیداسیون سریع، این واکنش نسبت به مقادیر مختلف اکسیژن، حساسیت بسیار بالایی دارد.
تجهیزات اتوماتیک مورد استفاده برای روش اکسیژن فعال به طور کلی تحت عنوان روش پایداری روغن (OSI) و رنسیمت شناخته میشوند. روش رنسیت معمولاً با دستگاه تجاری ساخت کمپانی Metrohm سوئد انجام میگیرد و همچنین برای اجرای روش پایداری روغن نیز از دستگاه مجهز به کامپیوتر کمپانی Omnion استفاده میشود.
هر دوی این روش ها تغییرات به وجود آمده در نتیجه یونهای فرار اسید های آلی بالاخص اسید فوماریک را مورد مطالعه قرار میدهند اما روش اکسیژن فعال به تعیین اندیس پراکسید میپردازد. اسیدهای آلی در طول اکسیداسیون مقاوم هستند و درزمانی به وجود میآیند که روغن توسط جریانی از حبابهای هوا اکسید گردد. در روش پایداری روغن و رنسیمت، اکسیداسیون در ابتدا به کندی صورت میگیرد چرا که در طول دوره انگیزش اسید فرمیک به آهستگی آزاد میشود. رنسیمت در اوایل دهه 1980 در دسترس قرارگرفت و در آن زمان قابلیت راه اندازی تنها هشت نمونه را به طور همزمان دارا بود. هر چند که روش OSI میتوانست تا 24 نمونه را در زمان مشابه مورد بررسی قرار دهد. از نمونهای از مجموعه تجهیزات مورد استفاده میتوان به میکرولب اشاره نمود که ساخت کمپانی Aarhus دانمارک است. در اکسیدوگراف نمونه ای از روغن و چربی در معرض اکسیژن و یا هوا در درجه حرارت مشخص قرار میگیرد. حرارتدهی در بلوکهای آلومینیومی اتفاق میافتد. با جذب اکسیژن توسط نمونهها، فشار موجود در لوله واکنش تغییر میکند که توسط ترانسدیوسر فشار1 الکترونیکی اندازهگیری میشود. میزان مصرف اکسیژن در طول مراحل اولیه نگهداری لیپیدها، پارامتر مناسبی برای تعیینshelf life فرآورده تلقی می گردد. Wewala از این روش برای پیش بینی مدت زمان ماندگاری شیر خشک کامل استفاده نمود و رابطه بسیار خوبی بین میزان اکسیژن موجود در فضای بالای بطری و همچنین مدت زمان نگهداری برقرار نمود.
6( دی ان های مزدوج2
اکسیداسیون اسید های چرب غیر اشباع با افزایش جذب نور فرابنفش توسط محصول همراه میباشد. لیپیدها شامل دی ان و پلی ان هایی هستند که با واحدهای متیلنی ازهم مجزا شدهاند و در طول اکسیداسیون تغییر موقعیت پیوندهای دوگانه به علت ایزومراسیون و مزدوج شدن از خود بروز میدهند. دی ان های مزدوج درطول موج 234 نانومتر بیشترین میزان جذب را نشان میدهد که علت آن تشکیل دی ان های مزدوج است. شهیدی و همکاران در تحقیقات خود به این نتیجه رسیدند که دی ان های مزدوج و اندیس پراکسید روغنهای گیاهی و دریایی در طول اکسیداسیون با یکدیگر مرتبط است. اگرچه روغن های حاوی کارتنوئید به دلیل وجود باندهای دوگانه در ساختار کارتنوئیدها، دارای جذب زیادی از 236-234 نانومتر میباشند. روش دی ان های مزدوج نسبت به تعیین اندیس پراکسید به مراتب سریعتر و ساده تر تلقی می شود. از سوی دیگر به واکنشهای شیمیایی و توسعه رنگ نیازی ندارد و به راحتی با مقدار نمونه کمتر نیز انجام میگیرد.
شکل 2: تغییرات میزان اکسیژن موجود در فضای بالای بطری شیر خشک کامل
شکل 3: ارتباط بین اندیس پراکسید و دی انهای مزدوج در روغنهای گیاهی اکسید شده
Parr و Swoboda روش، اسپکتروسکوپی جایگزینی را برای تعیین اکسیداسیون لیپیدها در روغنها تشریح نمودند. در این روش، هیدروپراکسیدهای اسید چرب پلی انوئیک و همچنین ترکیبات هیدروکسی و کربونیل مشتق شده از آنها به کروموفورهای مزدوج تبدیل میشوند. این تبدیل طی دو مرحله واکنش شیمیایی رخ میدهد که به ترتیب احیا و سپس دهیدراسیون نامیده میشوند. این واکنشها موجب تولید فرآوردههای اکسیداسیون قابل مزدوج شدن میشوند که به صورت اندیس COP شناخته میگردد. مرحله اول این روش شامل احیای گروههای کربونیل توسط سدیم بورهیدرید میباشد که در نتیجه آن نامرئی شدن ترکیبات کربونیل اسیدهای چرب پلی انوئیک اکسیده شده در نور ماورای بنفش میباشد. کاهش جذب در 275 نانومتر به عنوان اندیس اکسو دی ان3 خوانده میشود. مرحله بعدی شامل تغییرات به وجود آمده در طیف ترکیبات احیا شده به counterpart های دهیدراته خود میباشد که در طول موج 268 و 301 نانومتر بیشترین میزان جذب را از خود نشان میدهند.
ب) تغییرات ثانویه
محصولات اولیه اکسیداسیون روغنها و چربیها (هیدروپراکسیدها) به سرعت به محصولات ثانویه تجزیه میشوند. بنابراین اندازه گیری این محصولات میتواند به عنوان مبنایی برای اکسیداسیون لیپیدها در نظر گرفته شود. محصولات ثانویه اکسیداسیون به طور معمول دارای عطر و آرومای مخصوص به خود میباشند، این در حالی است که محصولات اولیه اکسیداسیون بدون رنگ و عطر هستند. محصولات ثانویه اکسیداسیون شامل آلدهیدها، کتونها، هیدروکربنها و الکلها هستند. بخشهای بعدی روشهای معمول مورد استفاده برای اندازهگیری محصولات ثانویه اکسیداسیون لیپیدها را تشریح مینماید.
شکل 4: مراحل واکنش شیمیایی در محصولات حاصل از اکسیداسیون
اندیس تیوباربیتوریک اسید
یکی از قدیمیترین و پرکاربردترین آزمونهای اندازهگیری اکسیداسیون لیپیدها درمواد غذایی و سایر سیستمهای بیولوژیکی، آزمون 2-تیوباربیتوریک اسید میباشد.میزان اکسیداسیون لیپیدها (تحت عنوان TBA) به صورت میلی گرم مالون آلدهید (MA) اکی والان به ازای هرگرم نمونه ارائه میشود.
1 Pressure transducer
2 Conjugated dienes
3 Oxodiene
—————
————————————————————
—————
————————————————————
12