تغییر در ترکیب اسید چرب در لیپید ها ی برگ گیاهان بیوتک کانولا تحت تنش گرمای کوتاه مدت

تغییر در ترکیب اسید چرب در لیپید ها ی برگ گیاهان بیوتک کانولا تحت تنش گرمای کوتاه مدت
بر اساس مطالعه تاثیر حالت منشا مختلف ژن های دگرساخت بهبود مقاومت گرمایی کانولا در سطح ترکیب اسید چرب غشای برگ تحت آزمایش کوتاه مدت بررسی شد . ژن CYP11A1 سیتوکروم P450SCC از میتوکوندری پوسته ی فوق کلیوی (آدرنال) گاوی را رمز گذاری کرد و تاثیر بیوسنتز ترکیبات استروئید را نشان داد ژن DesC و ∆ آسیل لیپید ولکانوس لینکوکوک سیونوباکتری ها را رمزگذاری کرد .کاهش در مقدار اسید پالمیتلینولنیک و شاخصه ی غیر اشباعی همچنین افزایش در اسید چرب کل و مقدار اسید پالمیتیک در کانولا Cyp11A1 در مقایسه با گیاهان وحشی
( نوع خودرو) در شرایط پرتنش تعیین و مشخص شد. اما کنترل و گیاهان DesC تغییرات مشابهی در اشباع ( 16:0 ) ترینویک ( 16:3 و 18:3 ) مقدار اسید چرب ، مقدار اسید چرب کل و شاخصه ی غیر اشباعی از خود نشان دادند. حالت ژن DesC دگرساخت بر ترکیب اسید چرب تاثیر نداشت و مزیت هایی به گیاهان تحت گرما نمی داد. ترکیب ژن Cyp11A1 در کانولا منجر به بهبود مقاومت گرمایی در سطح غشا شد. افزایش مقدار روغن ، کیفیت و تولید هدف اصلی پرورش شلغم روغنی ( براسیکا ناپوس ال ) باقی ماند. مقاومت در برابر تنش های غیر آلی ویژگی اصلی گیاهان به دلیل تغییرات محیطی شد رویکرد ژن های پیوندی به طور موفقیت آمیزی برای کشف مقاومت تنش غیرآلی گیاهان ( باتناگار ــ ماتور و همکارانش 2008 ) و به کارگیری برای تولید شلغم روغنی با مقاومت تنش مختلف استفاده شد.( باسوا 2001) گیاهان کانولا پیوندی پادگذر Na+/H+ واکوئلی از آرابیدوپسیس تالیانا قادر بودند تا دانه هایی با وجود 200mM Nacl تولید کنند . بازدهی دانه و کیفیت دانه تحت تاثیر غلظت بالای نمک نبود ( زان و همکارانش 2001 ) تغییر حالت سوپروکسید و دسیموتاز Mn میتوکوندری مقاومت سرما و خشکی و گرمایی کانولای پیوندی را تحت شرایط تنش مصنوعی و در محدوده ی آزمایشی افزایش داد . (گوستاو 2009 ) . گیاهان کانولا بیوتک با حالت دگرساخت عامل نسخه برداری rice dsmyb4 مقاومت افزایش یافته در برابر دمای مثبت پائین نشان داد که ناشی از تجمع ترکیبات پرولین و فنولیک بود ( گومو 2012) . B.napus پیوندی حمل کننده ی زیر واحدهای b آنتی سنس فارنسیل ترانسفراس ( ERA1 ) آراپیدوپسیس توسط ارتقاء دهنده ی خشکی rd29A را می سازد یا زیر واحد -α آنتی سنس فارنسیل ترانسفراس ارتقاءدهنده ریداکتاز هیدروکسی پیرودیت آرابیدوپسیس (AtHPR1 ) را می سازد که در برابر جذب دانه القاء شده توسط کمبود آب در طول گل دهی مقاوم تر بودند . تحقیقات بر محدوده ی آزمایشی نشان داد که با آب کافی ، کانولا پیوندی مقدار یکسان دانه مانند مرحله ی کنترل تولید می کند. تحت شرایط تنش خشکی متوسط در گل دهی ، تولید دانه ی گیاهان پیوندی به طور چشم گیری ( بیشتر از 16 درصد) بیشتر از مرحله ی کنترل بود ( وانگ 2005 و وانگ 2009 ) . گل دهی اولیه و بلوغ ، مقاومت خشکی را به دلیل تغییرات چشم گیر در حالت ژن و الگو های توزیع فیتو هورمون افزایش یافت که برای فسفاتیدی لینوسیتول فوسنولیپاس – کانولا مستند سازی شد. ( BnPtdlns-PLC2 ) (جورج و همکارانش 2009 ( . القای مازاد محدوده ی اتصال RNA پروتئین A مکان کنترل گل دهی منجر به افزایش اندازه ی گیاه ، اندازه ی اندام ، اندازه ی سلول ، حاصلخیزی گیاه و مقدار روغن در گیاهان شلغم روغنی پیوندی با تنظیم چرخه ی سلولی مرتبط ژن Cyclin – B2- 1 ، فعال کننده ی کیناز 1 سیکلین وابسته شد. ( کی و همکارانش 2012 ). ما مسیرهای باردهی Cyp11A1 گاوی (ساخنو 2010 ) یا ژن های هیبریدی دو کاربردی desC::licBM3 (ساخنو 2012 ) را در ژنوم هسته ای شان با استفاده از دیسک برگ آگروباکتریوم تومفاسین (ساخنو 2008 ) را به دست آوردیم . سیتوکروم p450scc از میتوکوندری پوسته آدرنال گاوی توسط ژن Cyp11A1 کدگذاری شد ونشان داده شد بر بیوسنتز ترکیبات استروئید در نیکوتیانا تاباکوم تاثیر داشت . (اسپیواک 2010). گیاهان کانولا Cyp11A1 در برابر آزمایش علف کش BASTA در شرایط گل خانه ای به دلیل القای ژن bar مقاوم بود که در نوار انتقال به عنوان شاخص انتخابی استفاده شد. برخی از گیاهان بیوتک مقدار کلی پروتئین های قابل حل افزایش یافته در برگ ها و دانه ها را جمع می کند . آنها فعالیت آنتی اکسیدان در بافت های برگ را افزایش دادند . برخی از آنها 5 تا 7 روز زودتر از گیاهان تحت کنترل گل دادند. (ساخنو 2010) .
ما نشان دادیم که ترکیب ژن Cyp11A1 منشا حیوانی تحت سازمان دهنده اصلی (35 S ) همچنین بر ترکیب روغن کانولا تاثیر می گذارد . (ساخنو 2011 ). افزایش اسید اولئیک ( از 66 مول درصد تا 73 مول درصد ) با افزایش اسید لینولینک (از 6 مول درصد تا 3 مول در صد) همراه بود . مقدار کلی اسید چرب در دانه های کانولا در سطح گیاهان کنترل باقی ماند. مقاومت گلیفوسیت و BASTA کانولا القاء کننده ژن desc::licBM3 هیبرید دو منظوره گروه دیگر گیاهان پیوندی بود . ( ساخنو و همکارانش 2012 ) . در ژن پیوندی توالی desc سیانوباکتری سینکوکوک و سکانوس بدون پلاستید با توالی ثبات گرمایی لیکناز ژن licBM3 ترکیب شد . فعالیت ژن licBM3 به عنوان بخشی از پروتئین هیبرید ارزیابی کمی و کیفی اشباع ژن را امکان پذیر ساخت . اشباع اسید چرب انتقال رشته ی منفرد بین اتم های کربن در زنجیره های آسیل درون رشته دوبل را کاتالیز می کند . ( موراتا 1997 ). تغییرات در عدم اشباع باقیمانده های اسید چرب در غشاهای سلولی ویژگی های غشایی را تعیین می کند که مقاومت در برابر دمای کم و زیاد را امکان پذیر می سازد. (واحید 2007 ) . گیاهان به پایداری غشای سلولی تحت شرایط تنش نیازمندند . ( بلام ، ابرکن 1981 ).
بررسی نمو دانه تحت دمای بالا تفاوت های بین کنترل و نهال Cyp11A1 در وزن تازه ، هیپوکوتیل و طول ریشه ، فعالیت SOD را نشان می دهد . ( ساخنو 2011 ) . تغییرات در ترکیبات اسید چرب لیپیدهای برگ دوگروه پیوندی کانولا بااستفاده از کروماتوگرافی گاز در طول رشد تحت شرایط مطلوب تعیین شد.(ساخنو 2010 ، ساخنو 2013 ) . هدف تحقیق کنونی مطالعه تغییرات ترکیب اسید چرب در لیپیدهای برگ Cyp11A1 و desC گیاهان کانولا تحت تنش گرمایی کوتاه مدت بود زیرا نتایج تست مقاومت گرمایی ( رشد کوتاه مدت تحت 42 درجه ی سانتی گراد در محفظه ی رشد ) به طور مثبتی مربوط به بهبود مقاومت گرمایی بالا در محدوده ی آزمایشی بود . ( گوستاو 2009 ) .

نتیجه
طیف سنجی کروما توگرافی گازی استرهای اسید چرب
ترکیب کیفی اسیدهای چرب از برگ های مسیر های بیوتک بررسی شده از گیاهان تحت کنترل متفاوت نیستند . ( نمودار 1) . اسیدهای لینولنیک ( 18:3 ) پالمیتک (16:5 ) پالمیتلینولنیک (16:3 ) ، لینولیک ( 18:2 ) و پالمیتولیک (16:1 ) وجود دارد. گیاهان کشتی والدین در مقدار اسید پالمیتولیک متفاوت اند. که کمتر از 3 مول درصد در برگ های گونه ماریا (نموداراب) بود و در انواع اوبری (obreey ) یافت نشد. مقدار اسید لینولینک در کنترل و برگ های کانولا desc در دمای نرمال و گرم یکسان بود . (نمودار 1الف ) . تحت شرایط پر تنش کاهش یافت . مقدار اسید لینولینک در برگ های T21a به طور چشمگیری کمتر ( 1.47+ 56.28 مول درصد) در کنترل ( 1.04 + 59.07 مول درصد ) در 22 درجه ی سانتی گراد بود . ( نمودار1 ب ) . در T22c (1.61+ 58.48 مول درصد ) و برگ ها ، کنترل یکسان بود . تاثیر دمای بالا منجر به کاهش در مقدار اسید لینولنیک در گیاهان کنترل در 2.43 مول درصد (% 0004 ) شد ، اما تغییراتی در نمونه های پیوندی یافت نشد. تفاوت های چشمگیری در اسید پالمیتیک بین گیاهان پیوندی و اولیه تحت دمای مطلوب یافت نشد . (نمودار 1) . تحت مقدار C16:5 گرما در کنترل (بیش از 1.21 برابر ) همچنین در برگ های کانولا desc پیوندی ( بیش از 1.21 _ 1.18 برابر ) افزایش یافت . ( نمودار الف ). رشد دمای بالا همچنین بر مقدار اسید پالمتیک در انواع Cyp11A1 یعنی 12 درصد ( رشته T2 1a) – 19 درصد (T2 2c) تاثیر داشت . اما در گیاهان غیر پیوندی ماریا cv تغییر نکرد . ( نمودار1 ب ) . در مقدار اسید پالمیتلینولنیک ( رشته 18b ) desC پیوندی اولیه بیشتر از شرایط کنترل تحت 22 درجه ی سانتی گراد (36 درصد ) و 42 درجه سانتی گراد ( 26 درصد ) بود، که به طور چشمگیری در گیاهان غیرپیوندی (10.07 و 9.12 مول درصد ) 18b/25 (11.4 و 10.01مول درصد ) در دو مقدار دمای آزمایش شده متفاوت نبود . (تفاوت نداشت ) . مقدار C16:3 در برگ های کانولا Cyp11A1 و کنترل ( 13 ~مول درصد) در 22 درجه سانتی گراد یکسان بود . تحت تنش گرمایی در گیاهان کنترل تغییر نکرد و در انواع پیوندی 31 _ 33 درصد کاهش یافت . (نمودار1 ب ).
مقدار اسید لینولیک در برگ های cv obreey غیر پیوندی در دمای نرمال ( 75/7 مول درصد) و گرما ( 9.29 مول درصد) بیشتر از انواع desC بود . ( نمودار 1 الف ) . در گیاهان desC بیوتک در 42 درجه سانتی گراد تغییرنکرد ( به ترتیب 7.08 و 7.72 ) و در کنترل 20 درصد افزایش یافت. تحت دمای بیشتر مقدار C18:2 ، 24 ~ درصد در برگ های کانولا Cyp11A1 و کنترل ماریا cv افزایش یافت . (نمودار 1 ب ). هیچ تفاوتی بین گیاهان پیوندی و کنترل در شرایط بدون تنش یافت نشد.
تحت گرما مقدار اسید لینولیک به طور چشمگیری در T2 2c در مقایسه با برگ های T2 1a و کنترل کاهش یافت . مقدار اسید پالمیتولیک 31 درصد در گیاهان کنترل در مقایسه با Cyp11A1 در 22 درجه سانتی گراد کمتر بود. تحت تنش گرمایی در سطح گیاهان پیوندی افزایش یافت . مقدار اسید پالمیتولیک در برگ های T2 2c و T2 1a تحت تست دمای گرم تغییر نیافته باقی ماند. (4 ‍~ مول درصد).
مقدار کلی اسید چرب در برگ های پیوندی desC و کنترل ( نمودار 2 الف) تحت دوره های دمایی مختلف یکسان بود به جز 15 درصد افزایش در رشته 18b/25 تحت تنش . مقدار کلی اسیدچرب به طور چشمگیری 27 ‍~ درصد درصد در برگ های Cyp11A1 کمتر از انواع کنترل تحت شرایط دمای نرمال در محل رشد بود . ( نمودار 2 ب). بیش از 33 درصد در کنترل به دلیل تاثیر گرما کاهش یافت ، در حالیکه در کانولا Cyp11A1 در هر دو شرایط بدون تغییر باقی ماند. در 42 درجه سانتی گراد مازاد مقدار کلی اسید چرب 20 تا 25 درصد در گیاهان پیوندی تحت کنترل بود . شاخص غیراشباعی برای گیاهان پیوندی و کنترل در دمای نرمال یکسان بود ( نمودار 3 ) به جز افزایش 1/04 درصد در رشته ./abدر برگ های کنترل تغییر نکرد اما به طور چشمگیری ( 0/05 درصد) از2.39±0.02 به 0.03±2.27-در گیاهان Cyp11A1 در تنش گرمایی کاهش یافت . ( نمودار 3 ب ) . شاخص عدم اشباع در گیاهان پیوندی desC و cv obreey کنترل تحت 42 درجه سانتی گراد 05/0 درصد کاهش یافت . ( نمودار 3 الف )
نمودار 1 : ترکیب اسید چرب لیپیدهای برگ کانولا در desC الف) Cyp11A1 ب) برگ های کانولا قبل از تنش گرمایی (دمای رشد 22 درجه ی سانتی گراد ) و بعد از ( دمای 42 درجه سانتی گراد)
: Bn18 و Bn12 گیاهان کنترل هستند.
(به ترتیب ماریا cv و اوبری cv ) ; 18b و 18b/25 گیاهان پیوندی ( به ترتیب نسل T2 و T0) القای اشباع لیپید آسیل و∆ از S.vulcanus ; T2 2c و T2 1a رشته های Cyp11A1 از نسل دوم همجورتخمی است.
اسیدهای چرب شامل پالمتیک (C16:5 )، پالمیتولیک (C16:0) پالمیتلینولنیک (C16:3 ) لینولیک ( C18:2 ) لینولنیک (C18:3 ) است.
ستون های خط میانگین ±انحراف استاندارد را نشان می دهد و تفاوت چشمگیر بین مقادیر آزمایشی در مقایسه با انواع کنترل را نشان می دهد. (p ≤05/0)
نمودار 2 : مقدار کلی اسید چرب در desC الف) و Cyp11A1 ب) برگ های کانولا قبل از تنش گرمایی ( دمای رشد 22 درجه ی سانتی گراد ) و بعد از ( دمای 42 درجه ی سانتی گراد ) : Bn18 و Bn12 گیاهان کنترل هستند ( به ترتیب ماریا cv و اوبری cv ) ; 18b (نسل T0 ) 18b/25 (نسل T2)
گیاهان پیوندی القای اشباع لیپید_ آسیل .9 ∆ از S.Vulcanus هستند ؛ T2 2c و T2 1a رشته های Cyp11A1 از نسل دوم هم تخمی هستند .
نمودار 3 : شاخص اشباع لیپیدهای غشایی در desC (کپی)
بحث
تنش گرمایی در طول رشد گیاهی موجب تغییرات فیزیولوژیکی و متابولیک شد که شامل تغییر در تعادل هورمون ، کاهش فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدان ، اصلاح عملکرد غشایی عمدتاً به دلیل تغییر سیالی غشا می باشد . (بارناباس 2008 ( . دمای بالای برگ رشد گیاه را کاهش می دهد و بازدهی محصول را محدود می کند . گیاهان پیوندی و تحت کنترل ژن های desC یا Cyp11A1 دگرساخت در ترکیب کمی اسیدهای چرب در طول رشد تحت دمای بالا و مطلوب در محل رشد متفاوت بودند . تحت تنش گرمایی مقدار اسید چرب (لینو لنیک و پالمیتلینولنیک در برگ های کانولا Cyp11A1 در مقایسه با انواع desC وتحت کنترل کمتر بود زیرا مقدار C16:3 ، 31_33% کاهش یافت . کاهش در مقدار اسید چرب ترینوئیک شرط لازم برای مقابله با تاثیرات تقریبی دمای بالا می باشد(ایبا ، 2002 ).
نشان داده شد که مقاومت گرمایی 13 رشته ی مختلف آرابیدوپسیس تالیانا جهش یافته های سه گانه fad8 fad 7-2 fad3-2 شدیداً مرتبط به مقدار برگ 16:3 و مقدار 18:3 یا حاصل جمع 16:3 +-18:3 –
میانگین رشته های دوبل هر مولکول گلیسرولیپید یا دیگر مقادیر غیراشباعی غشایی می باشد . ( رتابول و همکارانش 2012 ) جهش یافته های مقاوم تر حاوی کمتر از 16:3 2 % در مقایسه با 12 %آرابیدوپسیس نوع خودرو است . در مقابل ، سطوح 18:3 بین این جهش یافته ها از 0 تا 54 % متغیر است . رشته هایی که در برابر گرما حساس تر بودند حاوی 12 تا 13 درصد 16:3 در لیپید برگ هایشان با 37-48 درصد 18:3 بودند، درجه ی ارتباط خطی r2 بین PSLL غیرفعال و مقدار 16:3 ، 0/88 بود در حالی که r2 برای مقدار 18:3 فقط 0/37 بود . همچنین سه جهش یافته ی آرابیدوپسیس در 16:3 مقاومت گرمایی افزایش یافته ای نسبت به نوع خودرو وحشی داشت . هنگامی که گیاهان در 17 درجه ی سانتی گراد رشد کردند . مقاومت گرمایی این رشته های جهش یافته در 29 درجه ی سانتی گراد تغییر نکردند . اما در نوع خودرو که برابر با جهش یافته ها بودند به دلیل 67 % کاهش در بخش 16:3 در لیپیدهای کلی ،برگ گیاهان خودرو افزایش یافتند. (فالکون 2004 ) تحت دمای نرمال اسید پالمیتیک در برگ های گیاهان پیوندی و تحت کنترل یکسان بود . در گیاهان ماریا cv تحت کنترل تغییر نکرد اما در اوبری cv در 42 درجه ی سانتی گرادافزایش یافت . که نشانه ی انطباق پذیری بهتر نوع دوم تحت تنش گرمایی کوتاه مدت می باشد. تحت افزایش گرما در مقدار اسید چرب اشباع نشده ( C16:0 ) در برگ های desC و (اوبری cv ) کنترل یکسان بود . اما در برگ های کانولا Cyp11A1 در مقایسه با ماریا cv کنترل بیشتر بود که نشان دهنده ی 12 تا 19 درصد افزایش مقاومت گرمایی بود . ( موراتا ، لاس 1997 ) . در جهش های سه گانه fad8 fad 7-2 fad3-2 آرابیدوپسیس تالیانا که با اسیدهای چرب ترینوئیک ترکیب نمی شد در اسید پالمیتیک تحت تنش گرمایی افزایش یافت (روتابول 2012 ) مقدار کلی اسید چرب برگ های کانولا Cyp11A1 تحت تاثیر تنش گرمایی قرار نگرفت و در گیاهان کنترل بیش از 25 درصد کاهش یافت مقدار کلی اسید چرب برگ های اوبری cv کنترل و desC در 22 درجه ی سانتی گراد یکسان بود و تحت 42 درجه ی سانتی گراد بدون تغییر حفظ شد بدیهی است که گیاهان صحرایی در عدم اشباع کلی لیپیدهای برگ در دمای بالا کاهش یافتند (پیرسی 1978 ) . در آزمایشات ما شاخصه ی عدم اشباع برای گیاهان پیوندی و کنترل در دمای نرمال یکسان بود . برای برگ های ماریا کنترل تغییر نکرد اما به طور چشمگیری در Cyp11A1 تحت تنش گرمایی کاهش شاخص عدم اشباع یکی از ویژگی های متمایز گیاهان مقاوم در برابر گرما است (ایبا 2002 ) شاخص عدم اشباع در گیاهان پیوندی desC و اوبری cv در 42 درجه ی سانتی گراد کاهش یافت بنابراین تفاوت این ویژگی بین این گیاهان در گرما مستند سازی نشد برخی ویژگی های گیاهان کانولا Cyp11A1 مثل کاهش مقدار 16:3 و شاخص عدم اشباع افزایش در مقدار کلی اسید چرب و اسید پالمیتیک تحت تنش گرمایی کوتاه مدت به ما این امکان را داد تا این رشته های مقاوم تر در برابر گرما را از انواع تحت کنترل غیر پیوندی در نظر بگیریم القای ژن desC دگرساخت بر ترکیب اسید چرب تاثیر نداشت و هیچ مزیتی برای گیاه تحت شرایط گرمایی نداشت
1