بررسی نحوه تولید و سم زدایی آفلاترکیسن

مقدمه
آفلاتوکسین ها گروهی از مایکوتوکسین ها با قدرت سرطان زایی، جهش زایی و کاهش کارآیی سیستم ایمنی، می باشند (Eatan &Gallagher , 1294; IARC , 1993) آنها از متابولیت های ثانویه سنتز شده توسط سویه های سم زای ASpergillus flavus , Aspergillus parasiticvs و Aspergillus nomius می باشند. آفلاتوکسین B1 با توجه به پتانسیل بالاتری که دارد، بیشتر مورد توجه قرار دارد. رشد قارچهای مولد سم وآلوده شدن به آفلاتوکسین در بسیاری از محصولات غذایی دیده می شود (Wood , 1989). در صورت مصرف غذاهای آلوده به سموم آفلاتوکسین B1 و B2، این سموم به آفلاتوکسین های M1 و M2 متابولیزه می شوند و به درون بافت هاومایعات بیولوژیکی و شیر حیوانات شیرده ترشح می شوند (Zarba etal , 1992).
سویه های گونه های Bifidiobacterium , Lactobacillus , Lactococcus در تولید محصولات شیری تخمیری به عنوان استارتر کالچر و تولید کننده طعم و بو، به کار می روند نقش اصلی این کشت ها تولید اسیدهای آلی مثل اسیدلاکتیک در طی مراحل تخمیر است که سبب افزایش عمر قفسه ای محصولات می شود و هم محتویات حساس آنها را تغییر می دهد.
اگر شیر به آفلاتوکسین آلوده باشد، احتمال تخریب مرحله تخمیر و تولید ترکیباتی با بوی تغییر یافته و ناخواسته را در محصول ایجاد می کند (Sutic & Banina , 1990).
اخیراً EL – Nezami و همکارانش (1996 , 1998) گزارشاتی ارائه داده اند مبنی بر وجود سویه های خاص لاکتوباسیل که توانسته اند آفلاتوکسین ها را از محلول آبی جداکنند. به علاوه سویه های خاصی از باکتری های اسید لاکتیک، توانسته اند آفلاتوکسین M1 را از شیر آلوده هم جداکنند (Pierides etal . ;2000). جداسازی آفلاتوکسین در نتیجه اتصال فیزیکی سم به دیواره سلولی یا ترکیبات دیواره سلولی است (Haskard et al. 2000 ; EL- Nezami et al. 1998 b).
همچنین جداسازی بعضی متابولیت های ضدقارچی مثل دی پپتیهدهای حلقوی و فنیل لاکتیک اسید و اسیدهای چرب هیدورکسیله شده از باکتری های اسیدلاکتیک، توانایی این گونه ها در بازدارندگی رشد قارچ های فاسد کننده مواد غذایی و مواد سم آفلاتوکسین را نشان می دهد.
آفلاتوکسین در ذرت
متابولیتهای سمی تولید شده توسط قارچها، که به عنوان مایکوتوکسین شناخته می شوند، در طی چند سال اخیر بسیار مورد توجه واقع شده اند. مایکوتوکسین ها امروزه به عنوان تهدید کننده های سلامتی در حیوانات شناخته شده اند که بیماری هایی مثل equine leukoencephalo malaci در اسب ها و Porcine edema را در خوک ها ایجاد می کنند. کاهش وزن، کاهش باروری و کاهش مقاومت در برابر بیماریها و حتی مرگ را به مایکوتوکسین نسبت داده اند. هیچ حیوانی نسبت به آنها مقاوم نیست ولی به طور کلی حیوانات پیرتر مقاوم تر از حیوانات جوان هستند. بعضی مایکوتوکسین ها، مثل آفلاتوکسین در سلامتی اشان هم مخاطراتی را ایجاد می کنند. این مایکوتوکسین به عنوان یک موتاژن شناخته شده است. شناسایی آفلاتوکسین در ذرت می تواند باعث کاهش قیمت آن جهت بذر و یا حتی معدوم ساختن آن شود. آلودگی با مایکوتوکسین ها ارتباط مستقیم با تاثیرات جوی دارد.
قارچ Aspergillus Flavus تولید کننده آفلاتوکسین در محصولاتی مثل ذرت، پنبه دانه و بادام زمینی است. قارچ به طور معمول در طبیعت وجود دارد، اما مقدار آن در هوای گرم و خشک افزایش می یابد. آلودگی آفلاتوکسین در ذرت هایی بیشتر است که تحت شرایط استرس تولید شده اند. بنابراین، خشکی، گرما، حشرات، کرم ها و استرس ناشی از بارورکنندگی همگی منجر به ایجاد مقادیر بالای آفلاتوکسین در گیاه می شوند. تلاش برای ایجاد هیبریدهای ذرتی که به آلودگی قارچی مقاوم باشند و سم را در خود انباشته نکنند، وجود دارد، با وجود این هیبریدها بسیار مقاوم هستند ولی از تجمع سم به طور کلی نمی توان جلوگیری کرد. با کاهش استرس و مراقبت از حمله حشرات می توان در مقدار آفلاتوکسین کاهش ایجاد کرد (CAST , 1999) .
دمای Fْ100-80 و رطوبت نسبی %85 (% 20-18 رطوبت در دانه ها وجود دارد) شرایطی بهینه برای تولید سم و رشد قارچ است.
از طرف دیگر مصرف این محصولات به عنوان خوراک دام می تواند سبب ایجاد انواع دیگری از آفلاتوکسین ها (M1 , M2) در شیر حیوانات شود. آلودگی ذرت به عنوان غذای دام و طیور و نیز ماده اولیه جهت فراهم کردن انواع گسترده ای از مواد غذایی و تنقلات، دارای اهمیت ویژه ای است و کاهش آفلاتوکسین به روشهای مختلف ضروری می باشد.
محصولات کشاورزی مثل ذرت، علوفه، بنشن، گندم و یونجه را می توان با سیلوکردن نگاهداری کرد. در بسیاری از کشورها محصولات سیلویی دارای ارزش غذایی بالاتری به خصوص برای دام ها می باشند. در کشورهای اروپایی مثل هلند، آلمان و دانمارک بیش از %90 محصولات تولیدی در سیلوها نگاهداری می شوند. حتی در کشورهایی با شرایط عمومی آب وهوایی مناسب جهت خشک کردن مثل فرانسه و ایتالیا، حدود %50 از محصولات خود را در سیلوها نگاهداری می کنند. (wilkson et al.1996) . جهت تولید سیلویی با کیفیت بالا نیاز به مراحل تخمیر میکروبی مناسب وجود دارد. میکروارگانیسم های دخیل در مراحل تخمیر سیلوها، علاوه بر افزایش کیفیت غذایی محصول، قادر خواهند بود تا از رشد میکروارگانیسم های بیماری زا و همچنین قارچ های مولد توکسین، جلوگیری کنند.
از آنجاییکه سیلوکردن محصولات بر پایه تخمیرهای متنوع اسید لاکتیکی تحت شرایط بی هوازی است، به کار بردن سویه های باکتریایی تولیدکننده اسیدلاکتیک که در سم زدایی و کاهش تولید آفلاتوکسین موثر هستند، منطقی تر به نظر می رسد. باکتری های اسیدلاکتیک محیطی و ساپروفیت موجود در محصولات، کربوهیدارتهای محلول در آب (WSC) موجود در محصولات را به اسیدلاکتیک و نیز مقدار کمی اسیداستیک تخمیر می کنند. بر اثر تولید این اسیدها، PH مواد سیلو شده پایین آمده و رشد میکروارگانیسم های فاسدکننده، باز داشته می شود. باکتری های اسیدلاکتیکی که عمدتاً در سیلوها یافت می شوند. اعضای جنسی های لاکتوبا سیلوس، پدیوکوکوس، لوکونوستوک، انتروکوکوس، لاکتوکوکوس و استرپتوکوکوس می باشند. اکثر باکتری های اسیدلاکتیک موجود در سیلوها، مزوفیل اند، یعنی در دمای بین Cْ50-5 رشد می کنند که دمای بهینه رشد آنها بین Cْ40-25 می باشد. آنها PH سیلو را تا 5-4 پایین می آورند که این به گونه و شرایط محصول بستگی دارد.
همه باکتری های اسیدلاکتیکی هوازی های اختیاری اند اما بعضی شرایط بی هوازی را ترجیح می دهند (Holzapfel and schillinger , 1992; Teuber et al. 1992) . جمعیت LAB در فاصله بین دروکردن و سیلو کردن محصول افزایش می یابد، که این بر اثر احیاء حالت های تاخیری است و نه اضافه کردن مصنوعی و تلقیح میکروارگانیسم. محتوای قندی و ترکیبات قندی موجود در محصول و مقدار ماده خشک و شرایط اسیدی و اسمزی موجود در سیلو، بر رشد و رقابت باکتری های اسید لاکتیک در تخمیر سیلویی تاثیر می گذارند. فاز تخمیری سیلوها در زمانیکه شرایط سیلو بی هوازی شود، آغاز می شود که این عمل معمولاً بعد از چند ساعت از سیلوکردن که اکسیژن اتمسفری موجود در اعضای گیاه و فواصل محصول خارج شد، آغاز می شود و بسته به نوع محصول سیلو شده و شرایط سیلو، برای چند روز تا چند هفته ادامه پیدا می کند. در این فاز، لاکتو باسیل ها میکروارگانیسم های غالب سیلو هستند و PH سیلو را با توجه به عمل تخمیر خود بین 5-8/3 پایین می آورند.
در فاز سوم که فاز ثابت می باشد که در صورت عدم دخول هوا به داخل سیلو، در بعضی مواقع به وجود می آید. در این حالت اکثر میکروارگانیسم های فاز تخمیری کاهش پیدا می کنند و تنها بعضی باکتری های مقاوم به اسید که قادر به تولید پروتئازها و کربوهیدراتازهای مقاوم به اسید هستند، مثل lactobacillus buchneri در مقادیر کم قادر به رشد خواهند بود.
در فاز چهارم که به محض قرار گرفتن سیلو در برابر هوا آغاز می شود، اسید آلی نگاهدارنده تولید شده توسط مخمرها و گاهی نیز باکتری های اسید استیک تخریب می شوند و درنتیجه PH بالا می رود و در مرحله بعد میکروارگانیسم های فاسد کننده شروع به فعالیت می کنند و قارچ های تولیدکننده توکسین مثل آسپرژیلوس فلاووس در این مرحله شروع به رشد و تولید سم می کنند (Nout et al, 1993) .
به نظر می رسد که نگاهداری سیلو در فازهای 2 و 3 با استفاده از افزودنیها و کاهش اکسیژن در هنگام سیلوکردن محصول، باعث جلوگیری از فساد قارچی و تولید سم خواهد شد.(Ste Fanie J. W. H. Oude Elferin Ketae. 2000) .
خصوصیات بیولوژیکی و مورفولوژیکی Aspergillus Flavus
آسپرژیلوس فلاووس متعلق به جنس آسپرژیلوس است که دومین گونه متداول بعد از آسپرژیلوس فومیگاتوس می باشد. کلنی های A. flavus سریع رشد می کنند و قطر کلنی آنها به cm 7-6 در 14-10 روز می رسد. رنگ کلنی در ابتدا زرد است و سپس به زرد متمایل به سبز یا سبز زیتونی تبدیل می شود. کلنی های قدیمی سبز تیره می شوند. شکل کلنی ها صاف است و بعضی دارای چروک های شعاعی اند. پشت کلنی بدون رنگ و یا به رنگ کرم است. محیط افتراقی، A. flavus , parasiticus آگار (AFPB) است که برای غربالگری و شناسایی گونه های A. flavus طراحی شده است. I- Pitt , A.D.Hocking , 1985; H.Govrama , L.B.Bullerman ,1995 A.parasiticus , A. Flavas در این محیط با تولید اسپورهای تیپیک زرد تا سبز زیتونی و پشت کلنی نارنجی روشن، متمایز می شوند. (K. B. Raper, (D.I.Fennell,1965) . جزئیات بیشتر را می توان زیر میکروسکوپ الکترونی اسکنینک (SEM) دید: کنیدیوسپورها بلند هستند ( 800 -400) و اغلب ظاهری سخت درست در کنار وزیکول های کروی دارد (253-24). فیلایدها به شکل پیرامونی بلند شده اند و در دو ردیف قرار دارند و بعضی اوقات تک ردیفی هستند؛ شکل سرهای کنیدیال از ستونی تا شعاعی و کروی متغیر است؛ طرز قرارگیری فیلایدها بر روی وزیکول شکل سرکنیدیال را تعیین می کند. قطر آنها بین 65 -10 متغیر است (J.I.PiH & A.D.Hocking 1985) کنیدی ها از جدایی های A. flavus صاف تا کمی خشن هستند، در حالیکه کنیدی ها از A. Parasiticus خشن هستند. گونه های خاصی تولید اسکلروتیای قهوه ای می کنند.
گونه های آسپرژیلوس فلاووس در خاک وجود دارند و طیف وسیعی از محصولات کشاورزی را در مزرعه محل های نگهداری و نیز در طی فرآوری و توزیع آلوده می کنند. Aspergillus Flavus زیرگونه A. bombycis , A.tamarii, A. nomius, Parasiticus تنها قارچهایی هستند که تولید آفلاتوکسین در آنها نشان داده شده است (C. P.Kurtmon, 1987 S. W. peterson, Y.Ito, B.W.Horn, T.Go to 2001; C.W.Hesseltin, B.W.Horn ).
سویه های آسپرژیلوس فلاووس دارای انواع غیرسم زا و تولید کننده های آفلاتوکسین (B1 , B2, ) می باشد که در این بین A. Flavus زیرگونه پارازیتیکوس، آفلاتوکسین های B1, B2, G1, G2. (AFG2, AFG1,AFB1, AFB2 ) را تولید می کند و جدایی های غیرسم زایی که آفلاتوکسین تولید نمی کنند در طبیعت نادر است (Du sanee Thanaboripat, Yang Qian, Lliu Ruigian, 2001)
تولید آفلاتوکسین
آفلاتوکسین ها گروهی از سم ها هستند که ساختار مولکولی مشابهی دارند. این توکسین برای اولین بار در سال 1960 وقتی که مرگ تعداد زیادی از بوقلمون های انگلیسی بر اثر بیماری کبدی روی داد، کشف شد. در آن سال بیش از صدهزار بوقلمون در طول چند ماه از بین رفتند.
(M. J. Carlie, S.C.Watkinson. G.W.Gooday. 2001) دانشمندان ابتدا این بیماری جدید را "بیماری X بوقلمون" نامیدند زیرا دلیل اصلی آن را نمی دانستند. در نهایت معلوم شد که همه پرندگان آسیب دیده با غذایی که با آرد بادام زمینی آلوده شده تهیه شده بود، تغذیه شده بودند. آزمایش آرد بادام زمینی مشکوک، وجود قارچ را به اثبات رساند (E. Moore- landecker , 1996) اصلی ترین آلودگی میکروبی مشاهده شده در آرد بادام زمینی، Aspergillus Flavus بود و سم تولید شده توسط آن آفلاتوکسین نامیده شد. تا به امروز، آفلاتوکسین به عنوان مضرترین مایکوتوکسین در دنیا شناخته شده است.
مولکول آفلاتوکسین حاوی هسته کورماین (Courmarin) متصل شده به یک بی فوران (bifuran) و یا به یک پنتانون است مثل AFB2 , AFB1 مشتق دی هیدرو، یا به یک لاکتون ششی جزئی مثل AFG1 و مشتق آن AFG2 متصل است (P.Sanz , R. Reig and J.Piguers et al. 1989). این چهار ترکیب با رنگ فلورسانسی که تحت تابش اشعه ماوراء بنفش موج بلند، از خود نشان می دهند از هم متمایز می شوند . (G Green; Bs blue) Hon(M.F.Dutton & J.G.Heathcote, 1966) تعیین آنها مربوط می شود به حرکت نسبی کروماتوگرافی آنها. از بین این چهار تا، B1 دارای بیشترین غلظت است که بعد از آن G2 , G1 قرار دارند. آسپرژیلوس فلاووس تنها B1 , B2 را تولید می کند و A.Parasiticus علاوه بر این متابولیت ها، G2 ,G1 را هم تولید می کند. Dutton & Heathcote مشتق های همی استال G1, B1 را به نام های B2a و G2a شناسایی کردند (M. F. Dutton , J. G. Heathcote , 1966). مشتق های 4- هیدروکسیلات این دو توکسین اخیر در ذرت و بادام زمینی یافت شده است. مشتق های AFM1 , AFM2 اول در شیر گاوهایی که با غذای آلوده به آفلاتوکسین تغذیه شده بودند، دیده شدند. سایر آفلاتوکسین های کوچک دیگر هم توسط A. flavus در محیط کشت و کبد و نیز احتمالاً در سایر اندام ها تولید می شوند. تولید آفلاتوکسین نتیجه ترکیبی از محیط و سوبسترا و گونه ها است. فاکتورهایی که بر تولید آفلاتوکسین موتراند را می توان به سه گروه تقسیم کرد: فاکتورهای فیزیکی، غذایی و بیولوژیکی. فاکتورهای فیزیکی شامل دما، PH، رطوبت، نور، هوادهی و درجه گازهای اتمسفری می باشد. آفلاتوکسین ها بین دمای C ْ12 تا 42 تولید می شوند و دمای بهینه Cْ35-25 است (N. D. Davis , U. L. Diener , 1966). تولید ‎آفلاتوکسین در سیلوهای ذرت %25 در Cْ30 است و پایین ترین رطوبت نسبی برای تولید آفلاتوکسین بین %88 و %83 متفاوت است. حضور CO2 و O2 بر رشد قارچ و تولید آفلاتوکسین اثر می گذارد. وجود %20 CO2 در جو، تولید آفلاتوکسین و رشد قارچ را به طور واضح کم می کند.
کاهش در مقدار O2 جو تا %10 تولید آفلاتوکسین را تحت تاثیر قرار می دهد، اما تنها در مقادیر O2 کمتر از %1 رشد قارچ و تولید آفلاتوکسین به طور کامل بازداشته می شود (U. L. Diener , N. D. Davis , K. E. landers, 1967). بسیاری نشان داده اند که PH اولیه به طور مشخص بر تولید آفلاتوکسین اثر گذار نیست، در حالیکه تحقیقات دیگر نشان داده است که PH اسیدی ضعیف سبب افزایش تولید آفلاتوکسین می شود و به طور واضح رشد قارچ را تحت تاثیر می گذارد (B. Jarvis , 1971). هر کدام از محیط های آزمایشگاهی و طبیعی، تاثیر بارزی بر تولید آفلاتوکسین می گذراند. عموماً منبع کربن ارجح برای تولید آفلاتوکسین، گلوکز، ساکارز یا فروکتوز است. منیزیم و روی برای بیوسنتز آفلاتوکسین ضروری است، اما ترکیبی از آهن و کادمیوم رشد قارچ و در نتیجه تولید سم را کاهش می دهند.
برای به دست آوردن روشهای موثر جهت جلوگیری از آلودگی غذا با آ‏فلاتوکسین، آشکار شدن مکانیسم بیوسنتز آفلاتوکسین در گونه های A.Flavus بسیار مهم است (به محض اینکه اولین ژن در سال 1992 جدا شد و مورد شناسایی قرار گرفت [P. K. Chang, C. D. Skry, J. E. Ginz , 1922] آخرین بررسی بر روی بیولوژی مولکولی بیوسنتز آفلاتوکسین، پیشرفت سریع و مشخص متعاقب کشف ژنهای دخیل در راههای بیوسنتز آفلاتوکسین، صورت گرفت). راه بیوسنتزی آفلاتوکسین شامل حداقل 18 واکنش چند آنزیمی است که از سنتز پلی پپتیر از استات که روشی مشابه سنتز اسیدهای چرب است، شروع می شود. راه کلی مورد قبول عموم برای تشکیل آفلا توکسین B1 به این شکل است. (P. Prieto, C. P. Woloshuk , 1997) :
NOR aerantinaverv fanin averufin (AVF) hydroxyversi color one versiconal hemiacetal acetate (VHA) Versiv color in A Strigmatocystin (ST) O- methyl sterig matocystin (OMSJ) aflatoxin B1
در بیوسنتز آفلاتوکسین، nor solorinic acid (NOR) اولین ترکیب حد واسط پایدار است. تبدیل ST به OMST , OMST به آفلاتوکسین، که آخرین مرحله مسیر سنتز است، اختصاص به دو قارچ تولید کننده آفلاتوکسین A. .Parasiticus , A. Flavus دارد. (J. W. Benoet , 1988, J. YU, P. K. chang , J. w. Cary, M. Wright, 1995; K. E. Papa ))
بعضی از آنزیم های شرکت کننده در بیوسنتز آفلاتوکسین مشخص شده اند و ژنهای مربوط به آنها نیز کلون شده است. این ژنها که برای یک فاکتور تنظیمی ای (AFLR) کد می شوند که رونویسی از ژنهای این مسیر را فعال می کند. عبارتند از:
PKSA, pks L1, Fas 1A, nor- 1, nor- A, av 1, vbs, ver 1, stc P, omt A , ord 1, avn A, aflr (Maris Motomura , Naomi Chihaya , 1999; P.P rieto C. P. Woloshuk, 1997).
مطالعات نشان دادند که همه ژنهای مشخص شده ای که با بیوسنتز آفلاتوکسین رابطه دارند در یک ناحیه kb 75 از DNAی هر دو قارچ A. parasiticus, A. Flavus وجود دارند و موقعیت های نسبی آنها در کلاسترهای هر دو گونه قارچی مشابه است (J. YU, P. k. chang, J. W. Carg, 1995) از طرف دیگر، بسیاری از قارچها (Aspergillus nidulans , Bipolaris SPP, Monocillium SPP., Farrowia SPP., Chae tomium SPP)
استریگماتوسیستین، یک پیش ساز آفلاتوکسین ها، تولید می کنند و فرض شده است که راههایی که اغلب برای راه بیوسنتزی آ‎فلاتوکسین شناسایی شده اند در بیوسنتز استریگماتوسیستین هم دخیل هستند؛ در حقیقت ژنهای مشابه ژنهای شرکت کننده در بیوسنتز آفلاتوکسین از A.nidulans جدا شده است و معلوم شده است که این ژنها در کلاستر kb60 در ژنوم A.nidulans جا گرفته اند.
(N. P. keller, T.M.Hohn , 1997; D. W. Brown, J. H. Yu, H. S. kelkar, 1996)
بررسی آفلاتوکسین
قارچها و آفلاتوکسین ها در انواع مختلفی از محصولات غذایی دیده می شوند. بنابراین به طور قطع باید نمونه برداری به صورتی انجام پذیرد که بررسی نمونه به طور کلی نمایانگر شرایط محموله باشد. اشتباه در این مرحله می تواند بررسی های بعدی را بی اعتبار کند. (N.Ramakridhma, J. lacey, 1990; L. S. lee, J. H. Wall, P. J. cotty, 1990) . روشهای بررسی بر اساس TLC (thin layer chromatograohy) pressure liquid chromatography) HPLC (High یا (EnZym- linked immunosorbent assay) ELISA می باشند. استخراج به وسیله محلول آبی استونیتریل یا متانول صورت می گیرد که در ادامه به وسیله ستون های ایمونوافینیتی (Immunoaffinity columns)، محلول حاصل استخراج می شود و روشی مناسب برای طیف وسیعی از مواد غذایی و غذای دامی می باشد. در مقایسه با این سه روش، TLC قدیمی ترین روش کروماتوگرافی است که به تجهیزات ارزان تر و ابتدایی تری نسبت به دیگر روشها، نیاز دارد و کمی ساده تر است. اما دقت پایین آن باعث عدم مصرف آن در زمینه های تحقیقاتی شده است. HPLC یک وسیله بر مبنای شیمی است که امکان تعیین مقدار و بررسی مقدار یک ماده شیمیایی را در بین سایر مواد را فراهم می کند. وسیله ای بسیار دقیق است که به سرعت می توان چندین نمونه را به وسیله آن بررسی کرده با این حال وسیله گران قیمتی است که مراحل پیچیده آن استفاده گسترده از آن را محدود می کند.
(I. W. park , E. K. kim, D. H. shon &Y. B. kim, 2002) ELISA روشی است که اخیراً توسعه یافته است و با وجود سرعت و دقت بالایی که دارد، استفاده از آن بسیار ساده است و به همین دلیل در بررسی آفلاتوکسین در مواد غذایی به شهرت رسیده است. با این وجود به دلیل مثبت های اشتباهی که ایجاد می کند، ضروری است که نتایج مثبت دوباره بررسی شوند. (M. Sabino, T. V. Milanz, S. A. Navs, 1997)
روشهای سم زدایی
خطرات مربوط به محصولات آلوده به آفلاتوکسین را می توان با استفاده از مراحل ویژه سم زدایی و فرآوری، کاهش داد (Park DL. Adv Exp Med Biol, 2002). عواملی که بر موثر بودن مراحل فرآوری تاثیر دارند شامل، پایدار شیمیایی مایکوتوکسین ها، نوع روش فرآوری، نوع و واکنش بین موارد موجود در غذا و محصول با مایکوتوکسین موجود در آن ها می باشد.
مراحل سم زدایی سودمند باید این گونه باشد:
1) زدودن، غیرفعال کردن و یا تخریب سم
2) عدم به جا گذاشتن ترکیبات سمی در مواد غذایی
3) حفظ ارزشی غذایی ماده غذایی
4) عدم تغییر دسترسی یا خواص تکنولوژی محصول
5) در صورت امکان اسپورهای قارچی را هم از بین ببرد.
برای آفلاتوکسین ها، چندین مرحله سم زدایی و فرآوری چند مرحله ای موفق جهت کاهش مقادیر آفلاتوکسین تا حد مجاز وجود دارد.
روش های فیزیکی که شامل مراحل جداسازی و پاکسازی می باشد که در طی آنها، دانه های آسیب دیده توسط قارچ از دسترس دور می شوند و باعث کاهش مقادیر آفلاتوکسین تا %80-40 می شوند.
آمونیاسیون محصولات آلوده به آفلاتوکسین علاوه بر کاهش مقدار آن، اثرات سمی و سرطان زای آن را هم تا %99 کاهش می دهد.
مواد غیر بیولوژیکی مثل زئولیت ها هم به شکل کووالانتی به آفلاتوکسین در سوسپانسیون آبی متصل می شوند و مانع جذب آفلاتوکسین توسط حیوانات می شوند و مانع aflatoxicosis حاد در حیوانات و ورود باقی مانده های آن به شیر حیوانات می شوند. زئولیت ها شامل انواع سیلیکات آلومینیوم هستند که به آفلاتوکسین ها متصل می شوند و آن را از دسترس حیوان دور نگه می دارند.
روش های بیولوژیکی هم در کاهش مقدار آفلاتوکسین موثراند. این مساله هم در سیلوها دیده شده است که با رشد باکتری های تولید کننده اسید لاکتیک و اسید استیک، رشد قارچها مولد آفلاتوکسین و نیز تجمع سم در سیلو به مقدار زیاد کاهش یافته است. همچنین در فرآوری محصولات تخمیری دیده شده است که مقدار آفلاتوکسین به طور چشم گیری کاهش یافته است اخیراً تحقیقاتی مبنی بر فعالیت تخمیر اسید لاکتیکی محصولات تخمیری ذرت بر کاهش مقدار AFB1 صورت گرفته است. (Mokoena MP, chelule Pk, (Ggaleni N; 2006 و کاهش %75 در نمونه های تخمیری مشاهده شده است. باید تاکید کنیم که روشهای که روشهای بیولوژیکی موثر معمولاً در نتیجه تولید ترکیبات خاصی توسط میکروارگانیسم بوده است. (FAO Corporate Document Rcpositiry)
کنترل بیولوژیکی قارچهای مولدآفلاتو کسین و تولید آفلاتوکسین
آلودگی محصولات به آفلاتوکسین را می توان با برداشت به موقع و جلوگیری از آسیب های وارده توسط حشرات و نگهداری مناسب، به حداقل رساند (P. K. cotty, 1991). با این وجود حتی تحت کنترل و مدیریت بسیار دقیق هم، مقادیر غیرقابل انتظاری آفلاتوکسین بر اثر آسیب غیرقابل جلوگیری حشرات به محصول رسیده یا بر اثر در معرض قرار گرفتن محصول با رطوبت قبل از برداشت بعد از آن و یا در طی نگهداری و نقل و انتقال و حتی مصرف آن، در محصول مورد نظر ایجاد شود (P. J. cotty , L. S. Lee, 1989)
برای بسیاری از بیماری ها روشهای شیمیایی کنترل معمول همیشه نه به صرفه هستند و نه موثر و ضدعفونی کردن همانند سایر روشهای شیمیایی کنترل ممکن است خطرهایی برای محیط زیست، سلامتی و ایمنی محصول داشته باشد. توانایی های ضدقارچی بعضی میکروب های مفید در دهه 1930 شناخته شد و تلاشهای بسیاری تا به امروز برای استفاده از آنها جهت کنترل بیماری گیاهان صورت گرفته است. با این وجود به تازگی مصرف تجاری آنها متداول گردیده است.
آفلاتوکسین را نمی توان به راحتی از غذاهای آلوده به وسیله روش های سم زدایی، جدا کرد. بنابراین توجه خاص به گسترش روش کنترل بیولوژیکی وجود دارد تا بدین طریق بتوان ایمنی محصول را با کاهش سم موجود در آن افزایش داد و این امر را می توان بر مبنای جایگزین کردن ایزوله های سم زا با ایزوله های غیر سم زای یک گونه قارچی انجام داده گزارشاتی مبنی بر بازداشته شدن تولید آفلاتوکسین توسط باکتری های اسیدلاکتیک، باسیلوس سوبتیلیس (Bacillus subtilis) و بسیاری از قارچها وجود دارد. این بازدارندگی می تواند در نتیجه عاملهای فراوانی از جمله رقابت برای موادغذایی و فضا باشد، که این رقابت برای موادغذایی برای تولید نیاز است نه برای رشد، و همچنین می تواند بر اثر تولید متابولیت های ضد تولید آفلاتوکسین به وسیله میکروارگانیسم های همزیست باشد.
کاربرد باکتری های اسیدلاکتیک
اثر محافظتی باکتری های اسیدلاکتیک (lactic acid bacteria = LAB) درمقابل آفلاتوکسین گزارش شده است. (Hosod. M, Hashimito, 1996; EL. Nezami. H, P.Mykkanen , 2000) بسیاری از این مطالعات شامل سویه های لاکتوباسیلوس بوده است که اتصال فیزیکی به عنوان مکانیسم برداشت آفلاتوکسین، مطرح شده است.
(2001) K. Pelton , H. EL. Nezami با تحقیقی که بر روی 20 سویه باکتری های اسیدلاکتیک و بیفیدیوباکتریوم ها انجام دادند، دریافتند که سویه های lactobacillus amylovorus, lactobacillus rhamnosus بیش از %50 از آفلاتوکسین B1 (AFB1) را از محیط مایع در مدت h72 گرماگذاری، برداشت می کنند.
در تحقیق دیگری پایداری کمپلکس های AFB1 شکل یافته با 12 سویه LAB هم در حالت زنده و غیرزنده با تکرار چندین شستشو توسط آب مورد بررسی قرار گرفت. در انتهای بار پنجم شستشو، تا %71 از AFB1 متصل باقی ماند و باکتری های غیرزنده (ATCC 53103) Lactobacillus rhamnocus , (DSM 7061) L. rhamnosus, بیشترین مقدار AFB1 را از محلول جدا کردند (ca Rolyn, A.Haskard , HaNi S.EL Nezami, 2001) تلقیح اسپورهای A. Flavus در کشت Strepto coccus lactis در محیط تریپتون براث در تجمع بسیار کم آفلاتوکسین یا عدم تجمع آن با وجود عدم جلوگیری از رشد قارچ، نتیجه شد (J. coallier- Ascah , ES Idziak 1985). کاهش در PH و مقادیر مواد مغذی در محیط بر اثر رشد S. Lactis دلیل این بازدارندگی آشکار نبود. بازدارندگی با اضافه کردن مقدار مساوی هیدارت کربن مصرف شده توسط باکتری قبل از تلقیح قارچ، کاهش نیافت. همچنین مقادیر آفلاتوکسین وقتی که S. lactis به کشت A. Flavus در حال رشد اضافه شد، به طور مشخصی کاهش یافت. بعلاوه جهت جلوگیری از سنتز آفلاتوکسین، S.lactis توکسین تشکیل یافته را نیز تجزیه می کرد. S.lactis بازدارنده ای در اواخر فاز رشد خود تولید و به محیط ترشح می کرد. این بازدارنده یک ترکیب با وزن مولکولی پایین بود که مقاوم به حرارت هم بود.
مقدمه ای بر باکتری های اسیدلاکتیکی
باکتری های اسیدلاکتیکی (lactic acid Bacteria, LAB) در بسیاری از محیط های غذایی غنی وجود دارند و به طور طبیعی در محصولات غذایی گسترده ای مثل محصولات لبنی و گوشتی و نیز سبزیجات یافت می شوند (1). آنها به طور سنتی به عنوان نگهدارنده طبیعی غذا و محصولات آن استفاده می شوند. عمل نگهدارندگی بر می گردد به عمر طولانی در قفسه و افزایش ایمنی مواد غذایی که بر اثر استفاده طبیعی یا افزوده شده میکروفلوراها و محصولات ضدمیکروبی آنها به دست می آید. استفاده از فرآیند های تخمیر در طی دهه های اخیر افزایش یافته است و امروزه انواع زیادی از غذاها و غذاهای دامی را شامل می شود (2).
باکتری های اسیدلاکتیک بسیار قبل از اینکه حتی وجود خود باکتری ثابت شود، به عنوان عامل تخمیری در فرآیند های تخمیر موادغذایی به کار برده می شدند. به طور سنتی به عنوان یک روش نگهداری طبیعی، کاربردی و مناسب محیط زیست مواد غذایی و غذای دامی، بنیان گذاری شده است. اثر نگهدارندگی بیشتر برمی گردد به کاهش PH در طی تولید اسیدلاکتیک. در کنار اسیدلاکتیک، ترکیبات مختلف ضدمیکروبی دیگری هم در طی رشد LAB تولید می شوند(3). تحقیقاتی که در ارتباط با اثر ضدقارچی باکتری های اسیدلاکتیکی و ترکیبات تولید شده توسط آنها می باشند، هنوز مورد توجه و تازه هستند. در حالیکه تعداد مقالات منتشر شده در مورد فعالیت ضدباکتریایی LABها متعدد و بسیارند، دانسته های ما در مورد فعالیت های ضدقارچی این باکتری ها هنوز محدود است.
افزایش مقاومت آنتی بیوتیکی و مقاومت به ترکبیات شیمیایی ازگانیسم پاتوژن و نیز فاسد کننده با توجه به افزایش آگاهی عمومی در بین مصرف کنندگان، معیارهای متفاوتی را جهت نگهداری غذاها می طلبد(4). به نظر می رسد که نیاز مبرم جهت دستیابی به راههای جدید گسترش عمر قفسه ای موادغذایی، سرکوب رشد قارچها و ایجاد غذایی ایمنی بدون مواد نگهدارنده وجود دارد. چنین نیازی سبب ترغیب جستجو برای باکتری های اسید لاکتیکی با چنین توانایی هایی می شود. سابقه طولانی استفاده از این باکتری ها در مراحل تخمیری مواد غذایی، در تلفیق با یافته های اخیر درباره اثرات مثبتی که توسط هضم پروبیوتیک LAB بر روی سلامتی افراد ایجاد می شود، سبب شده که این باکتری ها به عنوان یک انتخاب مناسب شناخته شوند (5).
"کنترل سنتی قارچهای فاسد کننده و جستجو جهت یافتن راههای طبیعی"
تکنیک های متعددی برای نگهدارنده موادغذایی و غذای دامی به کار می رود. خشک کردن، منجمد کردن، نگهداری در سرخانه، نگهداری در شرایط تغییر یافته و تیمار حرارتی، همگی روشهای فیزیکی نگهداری موادغذایی هستند (6). بسیاری از افزودنیهای شیمیایی هم به عنوان نگهدارنده ها استفاده می شوند. با این وجود مکانیسم های دقیق یا هدف آنها، اغلب شناخته شده نیست (7). بسیاری از اسیدهای آلی به عنوان افزودنیهای موادغذایی استفاده می شوند که فعال ترین آنها اسیدهای لاکتیک، استیک، پروپیوتیک، سوربیک و بنزویک هستند (Davi dson 2001). بنزویک اسید و سوربیک اسید دارای طیف فعالیت وسیعی هستند (Nielsen & Deboer, 2000). اسیدهای بنزویک و بنزوات سدیم به طور اولیه به عنوان عوامل ضدقارچی استفاده می شوند (Davidson 2001).
ناتامایسین یک عامل آنتی بیوتیکی تولید شده توسط Streptomuces natalensis است که بسیار در برابر مخمرها و قارچها موثر است و اغلب به عنوان یک نگهدارنده بر روی سطح پنیر سخت استفاده می شود. (Davidson, 2001).
افزایش تعداد میکروارگانیسم های مقاوم شده به آنتی بیوتیکها، یک حقیقت غیرقابل انکار است. قارچها هم مستثنی نیستند و بسیاری از گونه های پاتوژن انسانی و فاسد کننده مواد غذایی هم مقاوم شده اند. با این حال مخمرها و قارچها تنها به آنتی بیوتیکها مقاوم نشده اند بلکه به مواد نگهدارنده ای مثل اسید سوربیک و بنزویک، همانند تیمار شیمیایی با ترکیبات پاک کننده، هم مقاوم شده اند (viljoen 2001; sanglard, 2002). جمعیت قارچی اولیه بسیار زیاد می توانند اسید سوربیک در پنیر را تجزیه کند و تعدادی از گونه های Zygosaccharomyces, Saccharomyces, Penicillium در حضور سوربات پتاسیم رشد کنند و آن را تجزیه کنند (Davidsson, 2001). تعداد قارچهای تجزیه کننده رسوبات در حال افزایش است. (Nielson & Deboer, 2000)). به علاوه جدایی هایی از P. roqueforti پیدا شده است که به بنزوات مقاوم هستند
(Niclson & Deboer 2001) قارچ penicillium discolor اخیراً نسبت به مواد شیمیایی استفاده شده در فرآوری غذا مثل ناتامایسین، مقاومت کسب کرده است(Cabo, Braber & Koenraad,2002). Discolor P. می تواند بر روی غلظتهای بالای ناتامایسین رشد کند و بر روی پنیر سخت فساد ایجاد کند (Nilson & (Deboer, 2000. مخمرهایی مانند ,candida versatilis , Debaromyces hansenii Torulaspora delbrueckii ، هم مقاومت بالایی به گندزداهای شیمیایی و ترکیبات پاک کننده در محیط های لبنی نشان داده اند (Viljoen, 2001). ریسک بالایی است که پدیده مقاومت در آینده با توجه به استفاده آنتی بیوتیکها و نگهدارنده ها، افزایش پیدا کند. همچنین به نظر می رسد رسیدن به یک انتخاب و جایگزین خوب، ضروری باشد.
عموم مردم خواستار کاهش استفاده از نگهدارنده ها و افزودنیهای شیمیایی در مواد غذایی و محصولات آن هستند. در عین حال، مصرف کنندگان، خواستار مواد غذایی با کیفیت بالا، فاقد نگهدارنده، ایمن با فرآوری کم هستند که ماندگارتر هم باشد. البته این مساله به راحتی قابل حل نیست. به علاوه قوانین حاضر، مصرف یعنی نگهدارنده های تایید شده در مواد غذایی مختلف را محدود کرده است. مطالعه و تحقیق برای دست یابی به روش نگهداری جهت ممانعت از رشد قارچ های آلوده کننده یک امر ضروری به نظر می رسد.
باکتری های اسید لاکتیک به طور طبیعی در غذاها یافت می شوند و یا به شکل کشت های خالص در محصولات غذایی متعددی اضافه می شوند. آنها نه تنها تهدیدی برای سلامت انسان نیستند بلکه برای سلامتی انسانها هم به عنوان پروپیوتیک (probiotics) مناسب هم هستند. LAB دارای تاییدیه (generally recognized as safe) GRAS هستند و از قدیم به شکل یک مصرف کننده طبیعی و محافظ محیط زیست از مواد غذایی محافظت می کردند. تخمین زده شده است که 25% رژیم غذایی اروپایی ها و 60% رژیم غذایی بسیاری از کشورهای در حال توسعه شامل مواد غذایی تخمیری است (Stiles, 1996) . LAB به خاطر استفاده از آنها به عنوان استارت کالچر در تهیه محصولات لبنی مثل ماست، شیر اسیدوفیلوس، کره شیری، پنیرهای هلندی (Cottage cheese)، پنیرهای سخت (چدار و Edam) و پنیرهای نرم (Comembert , Brie) استفاده دارند (Carr, Chill & Maida, 2002). باکتری های اسید لاکتیک استفاده شده در تخمیر شیر، به خصوص، lactococcus lactis در بین سایرین بهتر شناخته شده اند. گونه های leuconostoc , lactobacillus نیز در ارتباط با محصولات لبنی می باشند
(Stiles, 1998).
وجود هم زمان باکتری های اسید لاکتیکی و قارچها برای بسیاری از کاربردهای بیوتکنولوژیکی ضروری می باشد مثل درست کردن خمیر ترش، که در آن نسبت باکتری های اسید لاکتیکی به مخمر معمولاً 1 : 100 است (Gobbette, 1998). علاوه بر این که LAB برای تولید بسیاری از محصولات غذایی و دامی ضروری است می توانند به عنوان ارگانیسم های فاسد کننده سبب ضرر اقتصاد می شوند. Kanjuola و Springham & Tymon (1992) دریافتند که lactobacillus plantatum سبب فلوکولاسیون مخمر تخمیر می شوند و در نتیجه تولید اتانول را در تخمیر ویسکی کاهش می دهد. گونه های pediococcus , lactobacillus گزارش شده است که به عنوان ارگانیسم های فاسد کننده آب جو عمل می کنند (Jespersen & Jakobsen , 1996)، و گونه های خاصی از لاکتو باسیلوس، شراب و شراب سیب را در حین تولید آکرولئین فاسد می کند (Claisse & lonvaud- Funel, 2000).
"باکتری های اسید لاکتیک چه نوع باکتری هایی هستند؟"
تاکسونومی
عبارت باکتری های اسید لاکتیک (LAB) به تدریج در آغاز قرن بیستم پذیرفته شد. عبارات دیگری مثل "باکتری های ترشی کننده شیر" و "باکتری های تولید کننده اسید لاکتیک" که قبل ها برای باکتری های مشابه به کار برده می شد سبب سردرگمی می شد. این امر با چاپ یک مونوگراف درباره باکتری های اسید لاکتیک که توسط Orla- Jensen در سال 1919 نوشته شده بود، خاتمه گرفت که این کار اثر قابل توجهی بر سیستماتیک LAB داشت. طبقه بندی جنس های LAB بر پایه مورفولوژی، حالت تخمیر گلوکز، رشد در دماهای خاص و محدوده مصرف قندها صورت می گیرد. با وجود تغییراتی که تا به امروز در مورد تاکسونومی صورت گرفته است، فاکتورهای به کار رفته توسط Orla- Jensen هنوز در طبقه بندی LAB اعمال می شود (Axelsson, 1998).
باکتری های اسید لاکتیک شامل یک گروه از باکتری ها هستند که دارای تشابهات فیزیولوژیکی، متابولیکی و مورفولوژیکی هستند و همچنین از نظر فیلوژنتیکی هم بسیار به هم نزدیک می باشند. توصیف کلی باکتری ها در یک گروه شامل گرم مثبت بودن، بدون اسپور بودن، باسیل یا کوکوسی های غیرهوازی است که در طی تخمیر کربوهیدرات ها، لاکتیک اسید را به عنوان محصول نهایی خود تولید می کنند. توافق به عمل آمده این است که یک گروه اصلی شامل چهار جنس وجود دارد:
Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc , Lactobacillus
اصلاحات تاکسونومیک اخیر چندین جنس جدید را مطرح کرده است و گروه باقی مانده امروزه شامل موارد زیر می باشد:
Aerococcus, Alloiococcus, Cornobacterium , Dolosigranulum , Enterococcus , Globicatella, Lactococcus, Oenococcus, Vagococcus Tetragenococcus, Weissella.
Carnobacteria , Lactobacilli و بعضی از Weissella ها میله ای هستند، در حالیکه باقی مانده جنسها کوکسی هستند (Axelsson, 1998).
برای شناسایی باکتری های اسید لاکتیکی، روش های فنوتیپیکی امروزه به طور متداول استفاده می شوند. اخیراً، تکنیکهای ژنتیکی، مثل تعیین ترادف 16S rDNA گسترش یافته است که شناسایی دقیق و مطمئن هرسوش را سبب می شود. تعیین ترادف های کوتاه 16S rDNA امروزه به عنوان یک روش ساده برای تعیین گونه های جدایی های باکتری های اسید لاکتیکی، استفاده می شود.

متابولیسم
باکتریهای اسید لاکتیک دو راه متابولیکی متفاوت برای تخمیر هگزوزها دارند، راههای هومو فرمنتیو و هتروفرمنتیو. راه هوموفرمنتیو به دنبال گلیکولیز (راه امبدن میرهوف) صورت می گیرد و درگونه های لاکتوباسیلوس هوموفرمنتیو و لاکتوکوکوس، استرپتوکوکوس و پدیوکوکوس وجود دارد. ازمشخصات آن، شکستن فروکتوز. او 6 دی فسفات (FDP) به دو بخش تریوز فسفات، گلیسرول آلوئید-3- فسفات (GAP) و دی هیدروکسی استن فسفات (DHAP) به طور مساوی، توسط یک FDP آلدولاز است . GAP بعداً به پیرووات تبدیل می شود که درنهایت به لاکتیک اسید احیاء می شود(Axelsson,1998;kandler,1983). هتروفرمنتیو یا روش 6 فسفوگولونات/ فسفوکتولاز به طور مشخص با اکسیداسیون گلوکز 6-فسفات به گلوکونات -6-فسفات ازطریق دکربو کسیلاسیون صورت می گیرد. پنتوز باقی مانده شکسته می شود به یک جز C-2 (استیل فسفات) که به وسیله یک فسفوکتولاز صورت می گیرد. درنتیجه، مقادیر اکی مولار، CO2 و لاکتات و اتانول ازهگزوز تشکیل می شوند. باکتری های اسید لاکتیک هتروفرمنتیو، عموماً پنتوز را تخمیر می کنند، با وجود این بعضی سویه های پنتوز منفی هم وجود دارد (kanadler.1983) همچنین LAB های هتروفرمنیتو دارای توانایی استفاده از پذیرنده های الکترون خارجی جهت تولید مجدد NADP، و درنتیجه گرفتن انرژی بیشتر هستند. به دلیل این راه جایگزین، استات به جای اتانول تشکیل می شود(Ax elsson,1998) یک گروه ازباکتری های اسید لاکتیک قادرند هر دو روش را به کار گیرند اما در حضور هگزوزها روش هوموفرمنتیو را ترجیح می دهند (Axelsson,1998)
Homofermentation
1 Hexos+2ADP+2PI2 lactate+2ATP
Heterofermentation
1 Hexose + 1 ADP+pilactate+Ethanol+co2 +2ATP
درحضور گیرنده الکترون خارجی) یا (
1 Hexsoe +2ATP +pilactate + Acetate +co2 +2ATP
زیستگاه:
باکتری های اسید لاکتیکی به طور متداول وجود دارند و وجود کثیرشان درفرآیند های تخمیری شناخته شده است و یا به عنوان ساکنین سطوح مخاطی موجودات عالی شناخته شده اند. آنها نیازمند محیط های غنی غذایی جهت ساکن شدن هستند. درکنار هیدرات کربن ها، نیاز آنها به اسیدهای آمینه، پپتیدها، نمک ها و ویتامین ها، نیز تامین باید گردد. (carr,chill& maida,2002)
LAB به عنوان نگهدارنده های بیولوژیکی (biopreservatives)
LBA ها به طور معمول درمواد غذایی وجود دارند و عنوان کشتهای خالص به طیف وسیعی از محصولات غذایی اضافه می شوند. آنها را به عنوان میکروگانیسم هایی بی خطر می دانند و حتی در برخی موارد منافع آنها در سلامتی انسان و حیوان به اثبات رسیده است(probiotics). LAB طیف وسیعی از ترکیبات ضد میکروبی تولید می کنند مثل محصولات تخمیری کاهش دهنده PH، اسید استیک و اسید لاکتیک و نیز پراکسید هیدروژن، اسید فرمیک، اسید پروپیونیک و دی استیل (Lind
gren&Dobrogosz,1990)مکانیسم دقیق عمل ضد میکروبی با توجه به پیچیدگی و همکاری ای که ترکیبات مختلف بایکدیگر دارند، مشخص نشده است. عمده تحقیقات برمبنای شناسایی و تشخیص مواد مختلف ضد میکروبی، و به خصوص ضد باکتریایی، درسیستم های ساده In vitro بوده است و اطلاعات کمی درباره مکانیسم های کلی سیستم های نگهدارنده پیچیده درمحیط های غذایی و غذای دامی وجود دارد (Earnshaw,1992). مطالعات درباره اثر LAB برروی قارچها پیچیده و دشوار است که به دلیل حساسیت اکثر قارچها به محصولات عادی تخمیر مثل اسیدهای لاکتیک واستیک است (Bonestroo et al ,1993;lindren &dobrogosez,1990 ) مقالات چاپ شده درباره LAB های ضد قارچ هنوز کم هستند و اکثر آنها به فعالیت بازدارندگی LAB اشاره دارند. تا به امروز مطالعات کمی درمورد شناسائی ترکیبات و معایب گزارش شده است(جدول 1)

متابولیت های ضد قارچی
اسیدهای آلی :
اسید لاکتیک متابولیت اصلی LAB است که سبب کاهش PH می شود وبرای بسیاری از ارگانیسم ها بازدارنده است (Eklund.1989). هیدروفوبیک ترین شکل اسید که غیر قابل تجزیه است به دیواره سلول نفوذ می کند و درداخل سلول تجزیه شده، H+ ایجاد می کند که سبب اسیدی شدن پلاسما می شود (Axelsson,1990). علاوه بر اثر PH، اسید تجزیه نشده، شیب الکتروشیمیای پروتون را به هم می زند و سبب باکتریواستاتیک و درنهایت مرگ باکتری های حساس می شود (Eklund,1989).
LBA های هتروفرمنتیو، استیک اسید درحضور گیرنده های خارجی الکترون درمقادیر نسبتاً زیاد، تولید می کنند و در این حالت اسید پروپیونیک تنها درمقادیر ناچیزی تولید می شود. هردو اسید دارای pka بالایی نسبت به اسید لاکتیک هستند و بنابراین دریک PH مشخص نسبت بالاتر اسید غیرقابل تجزیه را دارا هستند. مشابه اسید لاکتیک، اسید های استیک و پروپیوتیک با دیواره های سلول واکنش داده و شیب الکتروشیمیایی پروتون راخنثی کننده اما اثر اسید استیک و پروپیوتیک اغلب به PH کاهش یافته توسط اسید لاکتیک وابسته است (Eklund,1989). اسید پروپیونیک رشد قارچ راکاهش می دهد، به خصوص درPH پایین، و بردیواره قارچی د رPH های زیر 5/4 اثر می گذارد. همچنین اسید استیک و اسید پروپیونیک مانع جذب اسید های آمینه می شوند(Eklund,1989). نمکهای اسید پروپیونیک مثل پروپیونات سدیم و پروپیونات آمونیوم اثر مشابهی برروی مخمرها و قارچهای رشته ای در PH پایین می گذارند. Moon(1989) دریافت که ترکیبی از اسیدهای لاکتیک واستیک و پروپیوتیک مانع رشد گونه های مخمری می شود که به طور طبیعی درغلظتهای بالای (100mm) هرکدام از اسیدها به تنهایی، به جز پروپیونیک اسید، به خوبی رشد می کند. اسید لاکتیک تولید شده توسطLAB و استات سدیم موجود در MRS (de man Rgosa, &sharpe)، محیط استاندارد رشد برای LAB، می توانند اثرات ضد قارچی توامی ایجاد کنند (cabo et al,2002;Bullerman 2002). استات سدیم موجود در MRS همچنین می تواند به عنوان یک عامل کمک کننده باسایر ترکیبات ضد قارچی تولیدشده توسط LAB عمل کند(stiles et al,2002). همچنین مشاهده شد است که LAB های غیر بازدارنده می توانند ازسوشهای دارای فعالیت ضد قارچی بالا، اسید لاکتیک بیشتری تولید کنند (Magnusson, strom,roos,sjogren& schnurrer,2003). به هرحال اثرات بازدارندگی اسیدهای آلی مثل اسید لاکتیک، اسید استیک و اسید پروپیونیک ادامه پیدا می کند تا مطالعات اثرات ضد میکروبی LAB پیچیده شود، تا زمانیکه خالص سازی بیشتر و دقیق تر و شناسایی بهتر مواد دخیل در آن صورت بگیرد(Magnusson,et al 2003).
سایر محصولات نهایی تولید شده :
اکثر LAB ها دارای فلاوو پروتئین اکسیداز ها هستند که به آنها توانایی تولید پراکسید هیدروژن (H2o2) درحضور اکسیژن را می دهد. پراکسید هیدروژن به دلیل اینکه LAB کاتالاز تولید نمی کند، درمحیط جمع می شوند (condon,1987) . اثر ضد میکروبی پراکسید هیدروژن به خوبی شناخته شده است و مربوط به اثر اکسید کنندگی قوی است که بروی دیواره باکتریایی دارد، واثرتخریبی ای که بروی ساختار مولکولی پایه پروتئین های سلولی دارد. اثر ضد میکروبی پراکسید هیدروژن درغلظتهای غیر بازدارنده به وسیله لاکتوپراکسیداز و تیوسیانات حاضر در شیرو بزاق حمایت می شود – سیستم پراکسید – تیوسیانات – لاکتوپراکسیداز شامل واکنش پراکسید هیدورژن و تیوسانات درحین عمل کاتالیزور لاکتو پراکسیداز می باشد. هیپوتیوسیانات و سایر محصولات واسطه ای دیگر سایر میکروارگانیسم ها را بازمی دارد. لاکتوپراکسیداز و تیوسیانات درشیر وجود دارد و وقتیکه بعضی LAB ها درشیر و محصولات لبنی رشد می کنند، سومین ترکیب مورد نیاز، پراکسید هیدروژن، اضافه می شود. Berry , Fitzsmmons (1994) اثر بازدارندگی این سیستم درمقابل مخمر Candida albicas راگزارش کردند. Hernandes,suarez , martinez,Rodriguez (1997) بیان کردند که MRS به عنوان سوبسترا باید استفاده شود تا ترکیبات ضد میکروبی به غیر از پراکسید هیدروژن جداسازی شوند. این یافته که پراکسید هیدورژن به سرعت در MRS تجزیه می شود، احتمالاً مربوط به فعالیت کاتالازی عصاره مخمر است.
دی استیل (2و3-بوتان دیون)، که همان ترکیب به وجود آورنده بوی خاص کره است، دارای اثر ضد میکروبی در ‍PH پایین است (Jay,1982) توسط سویه های بعضی چشمهای LAB درطول تخمیر سیترات تولید می شود. با این حال، مقادیر مورد نیاز دی استیل جهت نمایان کردن فعالیت ضد میکروبی (نزدیک به 200mm) به طور مشخصی مزه و بوی محصول را دست خوش تغییر میکند.
(piard &Desmazeaud.1992)
مروری بر فعالیت ضد قارچی باکتری های اسید لاکتیکی
درحالیکه بسیاری از تحقیقات متمرکز بر اثرات ضد باکتریایی باکتریهای اسید لاکتیکی است، گزارشات کمی درباره ترکیبات ضد قارچی ویژه ا زLAB،وجود دارد.این مساله با وجود حساسیت ذاتی اکثر قارچها به محصولات نهایی این باکتری ها ازجمله اسید های استیک و لاکتیک پیچیدگی های خاصی پیدا کرده است. درتحقیقات انجام شده توسط Magakgan و Chuprina این حقیقت آشکار شد که Lactobacillus planitarum بازدارنده ترین گونه دربین انواع مختلف گونه های LAB می باشد، که این مساله با انجام آزمایش بازدارنگی برروی قارچهایی مثل:
cladosporium herbarum, penicillium glaucum, Aspergillus gloucus به اثبات رسید. دریک تحقیق متفاوت، Hardt وcollins ، توانستند نشان دهند که محلول صاف شده از کشت L.acidophilus درمحیط Casitone broth و PH7/7 قادر است که رشد Candida albicans را به تعویق بیاندازد، با وجودیکه کشت قارچی درنوترینت براث حاوی گلوکز د رPH 4/6 قادر به رشد بود. با این وجود هیچ تلاشی برای جداسازی ترکیبات ضد قارچی درمحیط های مغذی متفاوت صورت نگرفت. درتحقیق دیگر به وسیله Batishetal، 19 کشت استاندارد LAB برای فعالیت ضد قارچی برعلیه تعداد زیادی از قارچها مورد بررسی قرار گرفتند. از بین این ها، تنها 5 نوع توانسته اند علیه قارچهای Rhizopus stolonifer 41، گونه های وحشی Rhizopus، A.parasiticus وfumigtus فعالیت بازدارندگی بارزی نشان دهند. گزارشات کمی مبنی بر پپتید های ضد قارچی تولید شد توسط باکتریهای اسید لاکتیک وجود دارد. Strom et al یک (Milab393) lactobacillum plantarum از سوله علوفه جدا کرد که ترکیبات ضد قارچی وسیعی تولید می کرد که برعلیه قارچها رشته ای موجود در مواد غذایی و غذای دامی و نیز مخمرها موثر بودند. Fusarium sporotrichioides و Aspergillus Fumigatus حساس ترین قارچهای آزمایش شده بودند.
Lai, Batish,Grover (1989) پیشنهاد داده اند که ترکیبات ضد قارچی تولید شده توسط ایزوله های LAB دارای طبیعت پروتئینی اند زیرا فعالیت آنها با تیمار آنها به وسیله پروتئیناز از بین می رود.
Bullerman (1997) و Gourama نشان دادند که تلقیح سوله ها با ترکیبی از لاکتوبا سیلوس ها Lb.delbruekii,Lb.plantarum زیرگونه (Lb.acidophilus, Bulgaricus اثر ضد قارچی و فعالیت بازدارندگی تولید آفلاتوکسین درمقابل A.flavus داشته است. وقتی کشت مخلوط را مورد بررسی قرار دادند، دریافتند که L. casei زیرگونه Pseudoplantarum (نه به عنوان یک ترکیب آغازگر) میکروارگانیسم فعال بود. فعالیت بازدارندگی به تمیار با ترپیسین و -کیمو تریپسین حساس بود و به این نتیجه رسیدند که فعالیت مربوط به پپتید کوچکی (1kDa>) است. فعالیت بازدارندگی LAB برای تولید آفلاتوکسین مربوط به اتصال سم های قارچی به سلولهای LAB (Haskard,EL.Nezami,kankaanpaa&Ahokas,2001) می باشد.
یک ترکیب پروتئینی از Lactobacillus Coryniformis زیرگونه coryniformiss سوش si3 دارای اثر ضد قارچی درمقابل چندین مخمر و قارچ است (agnusson&schniurer.2001) پپتید کوچکی بود(درحدود 3KD) که مقاوم به حرارت و تعالی درمحدوده 3.6 PH بودکه توسط پروتئیناز K غیر فعال می شود(Magnusso & Schnurer,2001) تولید پپتید های ضد قارچ که کینتیک مشابهی را دنبال میکنند. درموارد دیگری هم مشاهده شده است مثل، باکتریوسین های آمیلوفوری L471 (Amylovorin) از (Allewaert.1999 ) lactobacillus amylovorus ،لاکتوسین S از (Mortvedt – Abildgaard et al,1995) lactobacillus sakei پپتید بازدارنده قارچی (Magnusson & Schnurer,2001) L.pentosus TV35b Atanassova et al.(2003) یک ترکیب پروتئینی از Lactobacillus paracasei از زیرگونه M3 Para casei شناسایی کرد که دارای فعالیت ضد باکتریایی وسیع و اثرات ضد قارچی درمقابل 4 تا 26 گونه مخمری بود.
اضافه کردن گلیسرول به همه سوشهای L.coryniformis مطالعه شده، به طور قابل ملاحظه ای فعالیت ضد قارچی آنها را افزایش می دهد(Magnusson,2003) درطی جداساز متابولیتها گلیسرول از L.coryniformis مقادیر مساوی از 3-هیدروکسی پروپیونیک اسید و 1 و 3-پروپاندیول و مقدار بسیار اندکی 3-HPA (3-هیدروکسی پروپیون آلدنید) جدا سازی شد که مشابه یافته های sobolov(1960)و Smiley درمورد سوش 208 -A از لاکتوباسیلوس بوده است.
روش کار
سوشهای باکتریایی و شرایط کشت
سه نوع لاکتوباسیلوسی برای بررسی کاهش آفلاتوکسین درمحیط مورد استفاده قرار گرفتند. این لاکتوباسیل ها که ازمرکز پژوهشهای علمی صنعتی ایران خریدار شدند، عبارت بودنداز:
lactobacillus acidophillus (PTCC 1643)
lactobacillus plantarum (PTCC 1058)
lactobacillus rhamnosus (PTCC 1637)
نمونه ها به شکل لیوفیلیزه بودند و برای احیاء آنها، بعد از شکستن آمپول لیوفیلیز، آنها درمحیط کشت مایع deman-Rogosa-sharpe (MRS; Hi-Media) تلقیح کردیم. به مدت 24h تحت شرایط بی هوازی (نمونه ها در جارگذاشته شدند ودرهر جا یک شمع روشن می شد تا مقدار Co2 مورد نیاز برای این باکتری ها که 5% بود را فراهم کند) دردمای Cْ37 گرماگذاری شدند (katrin strom, jorgen sjogren,anders broberg,2002). برای بررسی شکل کلی آنها ونیز رنگ آمیزی میکروسکوپی از نمونه های براث برای کشت خطی و رنگ آمیزی استفاده کردیم. کشت بر روی محیط MRS جامد صورت گرفت. جهت نگهداری طولانی مدت این سویه ها، ازگلیسرول استفاده شد. بدین ترتیب که 2eml گلیسرول را با 8ml آب مقطر مخلوط کردیم (جهت فراهم آوردن گلیسرول 20%) و سپس آن را استریل کردیم. درهرلوله اپندرف حدود ml 5/0 ازکشت 24h باکتری درMRS مایع را می ریزیم وسپس 1ml از گلیسرول 20% تهیه شده را برای آن ها اضافه می کنیم. ابتدا آنها را به مدت 24h درفریز -20 درجه سانتیگراد وسپس به مدت طولانی درCْ70- نگهداری می کنیم.

تخمین غلظت باکتریایی.
جهت تعیین مقدار مشخصی از باکتری مورد نظر، ازمقایسه نمونه ها با شاهد مک فارلند استفاده کردیم. برای به دست آوردن تعداد تقریبی 109*9 باکتری درهر میلی لیتر، درهرلوله 3ml ازمحیط کشت مایع MRS را ریختیم تا کدورتی مشابه کدورت مک فارلند 10 پیدا کند(جذب نمونه ها در 600nm خوانده شده) بعد از تطبیق OD نمونه ها با شاهد مک فارلند، نمونه ها سانتریفوژ شده ، محیط کشت MRS دورریخته شد و حدود 3ml محلول فسفات با فرسالین (PBS) با PH 7/23 ریخته شد و بعد از یکنواخت کردن سوسپانسیون باکتری در PBS مجدداً عمل سانتریفوژ (به مدت 12min بادور 2500-3000 rpm) صورت گرفت و مایع رویی دورریخته شد. این مرحله رادوبار تکرار کردیم و بدین ترتیب هیچ محیط کشتی درسوسپانسیون باکتریایی باقی نماند و رسوب باکتریایی که درانتها به دست آمد را برای اضافه کردن محلول آفلاتوکسین کنار میگذاریم (k.peltonen,w.El.nezami,2001).
تعیین منحنی رشد باکتری
دراین مرحله به دلیل مقایسه جذب آفلاتوکسین توسط لاکتوباسیلوس درفازهای رشد و سکون و مرگ، منحنی رشد باکتری را تعیین کردیم. بدین منظور، ازسوسپانسیون باکتریایی را به محیط کشت MRS مایع تلقیح کردیم و درفواصل زمانی 2h مقدارOO را درطول موج 600 nm خواندیم . درنهایت منحنی رشد باکتری را براساس مقدار جذب به زمان رسم کردیم و مراحل فاز رشد و سکون تعیین شد.
برای بررسی مقدار کاهش آفلاتوکسین درحالت مرگ باکتری، سوسپانسیون باکتری مقایسه شده با 10 مک فارلند را اتوکلاو کردیم، تا باکتری ها کاملاً ازبین بروند، سپس سانتریوفوژ کرده و به رسوب باکتریایی محلول آفلاتوکسین اضافه کردیم.
همچنین جهت بررسی میزان رشد یا عدم رشد سویه باکتری بهینه درمحلول آفلاتوکسین مورد آزمایش و نیز PBS به تنهایی، درطول مدت 120h مقدار جذب محلول رادرطول موج 600 nm خواندیم و روند رشد باکتری رادراین محلول ها بررسی کردیم.

تعیین میزان کاهش آفلاتوکسین
(Sigma,st.louis,Mo.)AFB1 درمتانول حل شد و غلظت آن را با خواندن جذب آن به وسیله اسپکتروفوتومتری (unicam 5625 uv/vis) درطول موج 365 nm (4 = 21500 M-1cm-1) و نیز معادله lamber-beer به دست آوردیم وبرای تهیه 25ml محلول آفلاتوکسین 5ppm، 11/3 ml ازمحلول را در evaporator گذاشتیم و متانول آن را تبخیر کردیم و سپس به وسیله PBS به حجم رساندیم و بدین ترتیب، محلول آفلاتوکسین باغلظت (gr/ml) 5ppmبه دست آوردیم. از این محلول 5ppm ، محلولهای دیگری با غلظت های 1000ppb (ngr/ml)و500و400و200و100و50 جهت مقایسه اثر کاهش درغلظتهای مختلف ونیز کالبراسیون دستگاه HPLC تهیه کردیم.
؟
به رسوبات باکتری تهیه شده درمرحله قبل، 1/5 ml ازمحلول آفلاتوکسppm)B1 5/0)اضافه کردیم و درمدت زمانهای مختلف دردمای Cْ37 گرماگذاری کردیم. برای هر سویه باکتریایی، یک شاهد باکتریایی (باکتری تلقیح شده در PBS) و یک شاهد AFB1 (5/0 آفلاتوکسین B1 در PBS) گذاشتیم (k.peltanen,H.EL.Nezamie,2001)
درهر مرحله زمانی، جهت بررسی مقدار AFB1 کاهش نیافته، بعد از سانتریوفوژ کردن محلول ها و رسوب دادن باکتریها 100 ,(2500-3000 rpm,12min) از فاز مایع راجهت بررسی برمی داریم. زمان گرماگذاری تا 90 h ادامه یافت و درمقاطع زمانی 1,24,48,90 h ازمایع رویی محلول باکتری و AFB1 برداشت شد. کلیه بررسی ها سه تکرار داشتند.
اثر شستشو بربازگشت آفلاتوکسین کاهش یافته
بعد از اتمام دوره گرماگذاری و برداشتن 100 مایع رویی محلول درمقاطع زمانی مختلف، درانتهای 90h، مایع رویی دور ریخته شده و رسوب باکتریایی به وسیله 2ml محلول PBS شسته می شود. بدین صورت که بعد از اضافه کردن PBS و یکنواخت کردن سوسپانسیون، آن را به مدت 10min دردمای Cْ37 گرماگذاری کردیم و سپس مجدداً سوسپانسیون را سانتریوفوژ کردیم و 100 ازمایع رویی را برای سنجش میزان آفلاتوکسین آزاد شده بررسی کردیم. این عمل را سه بار تکرار کردیم و بعد از هر بار شستشو مقدار آفلاتوکسین آزاد شده را بررسی کردیم.
(Carolyn A.Haskard et al,2001;K.Peltonen,W.EI.Nezami,2001)
تعیین مقدار AEB1 باقی مانده درمایع رویی نمونه ها
مایع رویی نمونه ها به وسیله دستگاه HPLC برای تعیین میزان AFB1 کاهش یافته توسط باکتری مورد نظر با استفاده از این فرمول محاسبه شد(K.Peltonen et al,2001)
؟
ازاین شاهد AFB1 برای تعیین میزان AFB1 آزاد شده پس از شستشو هم استفاده شد.
HPLC
جهت تعیین میزان آفلاتوکسین از روش HPLC فاز معکوس بدون روش استخراج، استفاده شد (EL-Nezami et al,1998a). سیستم HPL3 (Cat No.CTS-03525) (Serial.No.880-06, Lot.No.26/275 شامل یک سیستم انتقال دهنده فاز سیال دو پمپی ، دتکتور UV و یک ستون ODS spheri-5 C18 با ابعاد 2504/6mm بود. حجم نمونه تزریقی معادل 70 بودوفاز سیال عبارت بود از :آب مقطر/متانول/استونیتریل ;vol/vol/vol) 58/21/21)که دارای Flow rate یاسرعت جریان 1/25ml/min بود. طول موج دتکتور UV برروی 365nm تنظیم شده بود.
ابتدا به وسیله هفت محلول استاندارد آفلاتوکسین B1 تهیه شده درمراحل قبل ، منحنی کالیبراسیون دستگاه تهیه شد .
(Kalantri, H, zandamoghadam A,Ahvaz-Iran;A.manda,B.P.Naidu,Nageswara Rao C.2004)
سویه های قارچی و شرایط کشت
جدایی آسپرژیلوس فلاووس توکسین زا (MAS 915 ;473.5 ppb) ازموسسه دفع آفات و بیماریهای گیاهی، بخش مایکوتوکسین، تهیه شد. یک کشت Slant ازآن تهیه شد(برروی Potato Dextrose Agav,PDA) به مدت یک هفته دردمای Cْ30 نگهداری شد. برای شمارش تعداد اسپورها، PBS 5ml به درون لوله ریخته شد و بعد ازشستشوی کامل، سوسپانسیون حاوی اسپورهای قارچی به لوله استریلی که حاوی 50 توئین 80 استریل شده بود، انتقال داده شد. سپس 50 از سوسپانسیون حاصل را برروی لام نئو بارگذاشتیم و تعداد اسپورها راشمارش کردیم. کل تعداد اسپورها را به 400تقسیم کردیم تا دراین صورت مقدار اسپور موجود درهر مربع کوچک را بیابیم، سپس از آنجاییکه این تعداد درحجم 1/4000,000ml هر مربع می باشد باید رقم حاصل رادر 4000,000 ضرب بکنیم و بدین گونه، تعداد اسپورها را هرمیلی لیتر محاسبه کردیم. جهت تهیه 103 و 106اسپور، رقتهای متوالی تهیه کردیم، تا به تعداد مورد نظر برسیم.
(jesper magnusson, Johan schnurer, 2000, katrin strom, Jorgen sjogren, 2002)
بررسی اثر بازدارندگی باکتری اسید لاکتیک برروی رشد قارچ
باکتری اسید لاکتیکی که درمراحل کاهش توکسین، بالاترین بازدهی را داشت، تعیین کردیم و دراین مرحله بررسی اثر بازدارندگی آن بر روی قارچ مولد آفلاتوکسین، از آن استفاده کردیم. بدین منظور، سه روش را به کار بردیم، روش دوفازی، روش نقطه ای ، روش چاهک
روش دوفازی: دراین روش ابتدا بر روی MRS آگار، باکتری مورد نظر را به شکل دو خط دوسانتی متری که فاصله کمی باهم داشتند، کشت دادیم (cْ37 ،24h ودرشرایط بی هوازی) سپس برروی پلیت و کشت انجام شده یک لایه ازمحیط کشت PDA حاوی 103 اسپور(دمای حدود cْ40 ) ریختیم و اجازه دادیم تا محیط ببندد. مجدداً پلیت ها را دردمای 370c برای مدت 72h نگاه داشتیم. این عمل را بر روی پلیت دیگری که حاوی MRS آگار فاقد کشت باکتری بود، هم انجام دادیم. درنهایت این دو پلیت راباهم مقایسه کرده و مقدار هاله مشاهده شده را بررسی کردیم (Jesper Magnussen & Johan Schnurer,2000)
روش نقطه ای : دراین روش ابتدا یک کشت 24 ساعته از لاکتوباسیل مورد نظر برروی MRS آگار تهیه کردیم(به طور یکنواخت برروی پلیت کشت داده شده بود) سپس یک قطره (10) از سوسپانسیون اسپور های قارچی حاوی 106 اسپور درهر میلی لیتر را درمرکز پلیت گذاشتیم و به مدت 72 ساعت دردمای cْ37 گرماگذاری کردیم. یک نمونه MRS آگار فاقد کشت باکتری که عمل مشابه برروی آن انجام شده بود به عنوان شاهد قرار دادیم. رشد و عدم رشد اسپورهای قارچی بررسی شد.
روش چاهک : درپلیت، محیط MRS اگار حاوی 103 اسپور ریختیم و اجازه دادیم تامحیط خوب ببنند. سپس دروسط آن یک چاهک حفر کردیم. ابتدا یک قطره ازمحیط کشت MRS آگار ریختیم و چند دقیقه صبر کردیم وسپس 70 از سوسپانسیون 24h لاکتوباسیل که در دمای cْ37 و شرایط بی هوازی قرارداشت رادرون چاهک ریختیم. یک پلیت MRS حاوی اسپورهای قارچی بدون حفر چاهک هم به عنوان شاهد تهیه کردیم و بعد از 72h گرماگذاری د ر cْ37 و شرایط هوازی، رشد وعدم رشد قارچ درمقایسه بانمونه شاهد، مورد بررسی قرار گرفت. (Jesper magnusson,Johun Schnurer,2000)
تهیه ذرت آلوده به اسپور قارچ آفلاتوکسین از:
ابتدا 25 گرم پودر ذرت (ذرت بدون آلودگی آفلاتوکسین (0/4ppb>) ازمرکز تحقیقاتی مرجعان خاتم تهیه شد) را با 10ml آب مخلوط کرده و درون ارلن مایر250ml ریخته و اتوکلاو می کنیم. این اتوکلاو را به فاصله 24h دوبار تکرار میکنیم . چهارنمونه بدین صورت تهیه میشود. سپس درنهایت 100ml آب مقطر استریل شده به نمونه ها اضافه شد و سپس برای آلوده کردن ذرت ها به قارچ،1ml ازسوسپانسیون قارچی راکه قبلاً تهیه کرده بودیم را به آن اضافه کردیم و 24h دردمای 370c گرماگذاری کردیم (zsuzsanna mayer , poul farber ,rolf geisen,2002)
بعداز 24h به مقدارهای 5% و 20% جمع کل سوسپانسیون ذرت تهیه شده، ازسوسپانسیون درحال رشد باکتری که حاوی CFu/mlاست، اضافه می کنیم. سوسپانسیون باکتریایی قبل از اضافه شدن به ذرت، جهت زدودن محیط کشت MRS دوبار با PBS شستشو شدند و درنهایت به ذرت اضافه شدند. نمونه های ذرت تهیه شده به شرح ذیل است:
1. نمونه ذرت فاقد اسپور قارچ و لاکتوباسیل
2. نمونه ذرت آلوده به اسپور قارچ و دارای لاکتوباسیل
3. نمونه ذرت آلوده به اسپور قارچ ودارای لاکتوباسیل
4. نمونه ذرت فاقد آلودگی بااسپور قارچ ولی دارای لاکتوباسیل
ازهر کدام از این شرایط دوتا تهیه شد که یک دسته برای حجم 5% باکتری و دیگری برای حجم 25% باکتری بود. کلیه نمونه ها دردمایی که قبلاً بیشترین اثر بازدارندگی رشد قارچ مشاهده شده بود، به مدت 20-14 روز گرماگذاری شدند و رشد قارچ درمقایسه با یکدیگر و شاهد بررسی شد.
تهیه نمونه های ذرت آلوده شده به سم و AFB (تهیه اسپایک)
15 گرم ازذرت تهیه شده فاقد آلودگی را در درون پلیت های شیشه ای می ریزیم و با 2ml آب می گذاریم تا اتوکلاو شود. بعد از اتمام عمل اتوکلاو، مقدار 303l از محلول AFB1 با غلظت 10 ppm را همراه 5ml متانول برروی ذرت می باشیم و اجازه می دهیم تا متانول برای چند ساعت تبخیر شود و ازذرت جدا شود. به این ترتیب ذرتی با آلودگی 300 3mr/kg به دست می آید. دونمونه ذرت را به ترتیب تهیه می کنیم. یک نمونه را به عنوان شاهد و نگاه می داریم و بعد از تبخیر شدن متانول 6ml از PBS استریل شده را برروی آن می پاشیم. برروی نمونه اسپایک دیگر، 6ml ازسوسپانسیون لاکتوباسیل بهینه درفاز رشد که دارای 9*109cfu/ml باکتری است را اسپری می کنیم. بدون تکان دادن نمونه های ذرت، هردو پلیت رادردمای 370c که دمای بهینه رشد لاکتوباسیل است، قرار می دهیم. مدت گرماگذاری 90 h می باشد. بعد ازانتهای 90 h عمل استخراج AFB1 ازنمونه ها صورت گرفته ومیزان AFB1 دردو نمونه اسپایک تهیه شده لازم به ذکر است که سوسپانسیون باکتریایی را قبل از اضافه کردن به اسپایک، جهت زدودن محیط کشت MRS ازآنها، دو بار با PBS شستشو می دهیم و درنهایت سوسپانسیون باکتریایی موجود د رPBS,6ml را به اسپایک اضافه می کنیم.
روش استخراج AFB ازذرت
روش استخراج مطابق روش مندرج درADAC سال 1999 انجام گرفت، با این تفاوت که چون نمونه های تیمار داده شده بالاتکوباسیل، حاوی باکتری هایی هستند که به احتمال زیاد AFB1 به جدارآنها متصل شده است، برای جلوگیری از استخراج AFB1 اتصال یافته به باکتری ، باکتریها را جدا سازی کردیم(نسبت ها به دلیل تفاوت مقدار ذرت ها در روش ADAC، تغییر پیدا کرد).
به منظور جداسازی لاکتوباسیل ها ازنمونه های ذرت، ابتدا کلیه نمونه های ذرت را با آب مقطر استریل شده شستشو دادیم و ازصافی عبور دادیم، بدین ترتیب احتمال وجودلاکتوباسیل ها رادرنمونه ذرت به حداقل رساندیم. مایع حاصل از شستشو را ابتدا از صافی فایبرگلاس (wattman no.9) عبور دادیم و سپس از صافی میلی پور (0/45 3m) عبور دادیم تا به این ترتیب لاکتوباسیل ها از مایع جداسازی کنیم.
درنمونه های ذرتی که با اسپورقارچ آلوده شده بودند، مایع حاصل را جهت استخراج کنار گذاشتیم (به دلیل غوطه ور بودن نمونه های ذرت درآب ونیز محلول بودن AFB1 درآب، دراین مدت 20-14 روز گرماگذاری به احتمال زیاد، آفلاتوکسین درآب محلول شده و نیاز به استخراج خود ذرت نبود.) ولی درنمونه های اسپایک آب حاصل ازفیلتر شدن را به ذرت ها اضافه کردیم و سپس توسط Rotory evaporator ذرت ها را خشک کردیم و درنهایت استخراج رابروی آنها انجام دادیم .
استخراج ازنمونه ذرت آلوده به اسپورقارچ:
همانطور که گفته شد به دلیل تماس ذرت با آب به نظر که AFB1 درآب حل شده باشد. درنتیجه بعد از روش های صاف کردن گفته شده مایع حاصل را به نسبت 2:8 با متانول، مخلوط کردیم و به مدت 0/5h برروی شکیر گذاشتیم (دردمای محیط) و سپس 10 ml از مایع حاصل را با PBG60ml به حجم رسانده و ازستون Imunoaffinity (R-Biopharm,Aflatest;Germany) گذراندیم و مایع حاصل را جهت اندازه گیری مقدار AFB1 به دستگاه HPLC تزریق کردیم.

استخراج ازنمونه اسپایک:
همان طور که گفته شدمایع حاصل ازشستشوی ذرت ها جهت زدودن لاکتوباسیل ها، مجدداً به ذرت اضافه شد و ذرت ها خشک شدند.
سپس نمونه های ذرت با 60ml حلال آب و متانول به نسبت 8/2 (70./vol) مخلوط شد و به مدت نیم ساعت دردمای اتاق برروی شیکر گذاشته شد. سپس سوسپانسیون حاصل با کاغذ صافی معمولی صاف شد و 10ml ازمایع حاصل را با 60ml از PBS مخلوط کرده و مجدداً جهت جلوگیری از رسوب رنگدانه های ذرت برروی ستون، توسط صافی فایبر گلاس صاف شد. سپس مایع حاصل از ستون ایمیونوافینیتی گذرانده شد و مایع حاصل را جهت بررسی میزان AFB1 تولید شد به HPLC تزریق کردیم .
نحوه استفاده از ستون های ایمونوافینیتی (Immunoaffinity):
ابتدا ستون ها را بروی Manifold قرار دادیم و به کمک یک سرنگ 50ml به عنوان مخزن (Reserver)، 70ml مخلوط مایع صاف شده (10ml) بعلاوه PBS (60ml) را از آن عبور دادیم، در این حالت AFB1 موجود درمحلول به Ab های موجود درستون متصل شده و ازآن عبور نمی کند و مواد مزاحم دیگر ازآن جدا می شد. به ستون، بعد ازاتمام مایع صاف شده، 15ml آب دیونیزه اضافه می کنیم، تا کاملاً مواد مزاحم خارج شوند. اجازه می دهیم تا ستون برای مدتی خشک شود. سپس صفحه نگهدارنده ویال (ظرف های ؟ مخصوص دردار) را درزیر ستون قرار می دهیم، به طوریکه دهانه ویال درزیر رابط ستون باشد. مقدار 1/5 ml متانول درون ستون می ریزیم تا بدین ترتیب تا بدین ترتیب پیوند بین AFB1-Ab شکسته شده و AFB1 درمتانول حل شود و شسته شده به درون ویال ریخته شود(روش AoAc,1999)
نحوه استخراج AFB1 ازرسوب باکتریایی
جهت بررسی پایداری اتصال AFB1 – لاکتولاسیل، رسوب باکتریایی را بعد از 90h درمعرض قرارگرفتن بامحلول 0/5 ppm آفلاتوکسین، با سانتریوفوژ جدا می کنیم و با PBS استریل ، دوبار رسوب ها را شتشو می دهیم. با توجه به روش ارائه شده توسط Carolgn.A.Haskard et al(2001) که کلروفرم را بهترین حلال استزاجی معرفی کرده است، رسوب باکتریایی را در 5ml کلروفروم غوطه ور می کنیم و اجازه می دهیم تایک ساعت دردمای 370c به همان حالت بماند. بعد از گرماگذاری ساتریوفوژ کرده و 2ml ازمایع رویی را تا مرحله خشک شدن کامل، تبخیر می کنیم و درنهایت رسوب باقی مانده را در 1ml متانول حل می کنیم و برای بررسی میزان AFB1، آن را به HPLC تزریق می کنیم.
نتایج
نتایج حاصل از کشت باکتری ها و تیمار محلول های AFB1 :
سویه های لاکتوباسیل راکه عبارت بودند از Lactobacillus plantarum(ptcc 1058)، Lb.rhamnosus (ppcc1637) و Lb.acidophillus(ptcc 1643) درشرایط قید شده کشت داده شدند. درمحیط MRS مایع، رشد آنها درزمانی 24h بسیار خوب بود و رشد آنها درمحیط MRS جامد درمدت 72h کلنی های واضحی راتشکیل دادند. شکل کلنی ها درهر سه سویه بسیار شبیه به هم بودند. کلنی ها کرم رنگ و مدور و مجرب با کناره های صاف بودند که دارای قوام کرده ای بودند با وجود این کلنی های لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس شفات تر و کوچک تر از دو سویه دیگر بود. شکل میکروسکوپی آنها حاکی از باسیل های کوتاه و یا بلند گرم مثبتی بود که به شکل زنجیره درکنار هم قرار گرفته بودند.
بعد از فراهم کردن سوسپانسیون باکتریایی و تیمار محلول AFB1 با غلظت 0/5 3gr/ml به مدت 1h باکتری ها، مقدار AFB1 موجود در محلول اندازه گیری شد(جدول 1). درصدهای محاسبه شده بیان گر این مطلب بود که سویه Lb.plantarum(ptcc 1058) مقدار بیشتری از AFB1 موجود در محلول راکاهش داده بود و آن را به عنوان سویه بهینه جداسازی کرد و کلیه مراحل بعدی، صرفاً برروی این سویه که دارای بازدهی بیشتری بود، انجام شد. این سویه کاهش در حدود 45% را درمدت 1h ازخود نشان داد. درحالیکه دوسویه دیگر یعنی Lb.rhamnosus, Lb.acidophillus به ترتیب 30-33% و 10-7% از AFB1 موجود درمحلول راکاهش دادند. نتایج به دست آمده قابلیت تکرارپذیری داشت. درمرحله بعد منحنی رشد لاکتوباسیلیوس پلانتاروم راجهت بررسی میزان کاهش AFB1 توسط آن در فازهای مختلف رشد، به دست آوردیم. منحنی به دست آمده نمایانگر این بود که باکتری بعد از 10h وارد فاز رشد می شود و این فاز رشته تا 72h ادامه دارد ولی بعد از آن وارد فاز سکون می شودکه این فاز سکون تا 168h ادامه دارد و درنهایت سلول ها وارد فاز مرگ می شوند.
ابتدا جهت بررسی زمان گرماگذاری مناسب جهت افزایش بازدهی کاهش AFB1 ازمحلول، درمدت زمانهای 90h,48h , 24h عمل گرماگذاری صورت گرفت. مشاهده شد که لاکتوباسیلوس پلانتاروم با افزایش زمان گذاری، مقدار بیشتری از AFB1 محلول را می کاهد. به طوریکه این مقدار به حدود 100% بعد از 90h گرماگذاری می رسد (جدول 2)
جهت بررسی مقدار کاهش AFB1 درفازهای سکون و مرگ بلااستفاده از باکتری اتوکلاو شد. باکتری های موجود درفاز سکون زمان 96h و od,1/68 و نیز باکتری های اتوکلاو شد. را درمدت زمان 90h یا محلول AFB1(0/5 3gv/ml) تیمار دادیم. نتایج حاصل نمایاند و کاهش بازدهی درباکتری اتوکلاو شده بود (جدول 3).
باکتری های اتوکلاو شده در طول 48h اول به مقدار AFB1 30-32% از AFB1 را ازمحیط کاهش دادند و این مقدار با افزایش زمان نه تنها افزایش نیافت بلکه کاهش پیدا کرد، به طوریکه به مقدار 14/5-15% کاهش رسید. این خود نمایانگر کاهش راندمان آفلاتوکسین زدایی بامرگ باکتری است و نیز اینکه باکتری فعالیت متابولیکی برروی AFB1 انجام نمی دهد زیرا در این صورت درحالت کشته شده، هیچ AFB1 ای را حتی با درصد پایین 30-32% نباید کاهش می داد.
بررسی کاهش AFB1 توسط باکتری درفاز سکون نمایانگر کاهش بالای AFB1 در حدود 76% بعداز 48 ساعت ونیز 90% بعداز 90h بود. با این وجود درمقایسه با باکتری درفار رشد این کاهش کمتر بود. این امر خود می تواند بیان گر عدم دخالت متابولیتهای ثانوی تولید شده درفاز سکون 1 درکاهش AFB1 باشد.
این نتایج خود می توانند نشان دهنده تاثیر رشد باکتری درکاهش مقدار آفلاتوکسین باشد، که البته درمقالات قبلی این کاهش یا باکتری ها کشته شده به مراتب بیشتراز باکتری های موجود در فاز رشد بود Carolyn A. Haskard,Hani S.El-Nezami,2001.
جهت بررسی اثر محلول 0/5 ppm AFB1 برروی رشد باکتری، مقدار رشد باکتری با خواند جذب آن در طول موج 600nm درمدت زمان 120h بررسی شد. مشاهدات نشان داد که بعداز 24h مقدار جذب کاهش یافت ولی مجدداً این مقدار به مقداراولیه برگشت و حتی کمی هم افزایش نشان داد. که این نتایج خود می تواند بیان گر زنده بودن باکتری در محلول AFB1 و انجام عمل متابولیکی باشد، با این تفاوت که مقدار od باکتری درمحلول PBS فاقد AFB1 به مرور کاهش پیدا کرد و باکتریها به تدریج از بین می رفتند (جدول 4).
با توجه به مقالات PH,Haskard C.Binnion C,Ahokas J,2000 قدرت یونی تغییرات دمایی دردصد کاهش AFB1 ازمحلول تاثیر ندارند. به نظر می رسد که کاهش میزان آفلاتوکسین با توجه به اتصال سطحی و پیوندی باشد که بین AFB1 و دیواره سطحی باکتری روی می دهد؛ با این فرض و جهت بررسی استحکام این اتصال، رسوب باکتریایی درمحلولی که بعد از 90h که کاهش AFB1 آن درحدود 100 درصد برآورده شده بود، طی روش گفته شده سه بار شستشو داده شد و هربار مایع حاصل ازشستشو راجهت بررسی میزان AFB1 آزاد شده از رسوب باکتریایی مورد بررسی قراردادیم و مشاهده شد که مقدار AFB1 آزاد شده در طی شستشوی اول دربیشترین حالت ممکن به مقدار 9/12% بود که این خود می تواند ناشی از تجمع AFB1 محلول دررسوب باشد ولی درطی دوبار شستشوی دیگر، مقدار AFB1 آزاد شده حداکثر به میزان 2/8% بود (جدول 5). ازطرف دیگر به منظور بررسی پایداری این پیوند (پیوند AFB1 با دیواره سلولی لاکتوباسیل) درمقابل حلال آلی و اثبات وجود AFB1 دررسوب باکتریایی، رسوب باکتریایی طبق روش گفته شد. درحلال کلروفرم تعلیق گردید تا بدین وسیله مقدار AFB1 استخراج شده از باکتریها بررسی شود. دراین حالت هیچ گونه AFB1 ی مشاهده نشد و کروماتوگرام ها فاقد پیک AFB1 بودند. این نتایج یا می تواند دلیل برپایداری پیوند AFB1 به دیواره سلولی باشد و یادلیل برمتابولیزه شدن آن توسط باکتری باشد، درحالیکه درمنابع، باهمین روش، تا 98% از AFB1 کاهش یافته راتوانسته بودند از رسوب باکتریای استخراج کنند (carolin A.Haskard etal ,2001)
با رنگ آمیزی ازسلولهای باکتریایی درمعرض قرار گرفته با AFB1 به مدت 90h باکتریهایی با شکل میله ای ظریف تر و کوتاه تر از حالت استاندارد، مشاهده شد که این باکتریهایی با شکل میله ای ظریف تر و کوتاه تر ازحالت استاندارد، مشاهده شد که این باکتری ها دیوار نازک تری پیدا کرده بودند به طوریکه دررنگ آمیزی گرم به رنگ قرمز (همانند گرم منفی ها) تمایل داشتند.
بررسی میزان بازدارندگی رشد قارچ توسط lactobacillus phantarum:
همانطور که گفته شد سوش بهینه درکاهش میزان AFB1 برای بررسی عمل در عدم رشد قارچ برسد روش مورد بررسی قرار گرفت. هرسه روش نشانگر بازدارندگی بالا در رشد قارچ Aspergillus Flavus توسط Lb.plantarum بود.
درروش دی فاز یک هیچ رشد قارچی مشاهده نشد و درحالت چاهک قطر هاله ای درحدود 4cm مشاهده شد و درحالت کشت نقطه ای، اسپورهای قارچ بعداز 72h درمقایسه با رشد سریع نمونه مشاهده، هیچ رشدی نداشتند
درنتیجه به نظرمی رسد که رشد قارچ آسپیرژیلوس فلاووسی درمحیط کشت دارای لاکتوپاسیل پلانتاروم کاملاً بازداشته می شود.
بررسی میزان آفلاتوکسین درنمونه های ذرت تیمارشده با لاکتوباسیلوس:
همان طور که شرح داده شد، دو نمونه ذرت تهیه شده (آلودگی بااسپور قارچ مولد آفلاتوکسین و آلودگی مصنوعی با سم آفلاتوکسین) با با کتری های اسید لاکتیک تمیار داده شدند.
برای تهیه نمونه ذرت آلوده به اسپور قارچ، مقدار 106 اسپور لازم بود. بعد از تهیه slant و شمارش اسپورها، درمجموع مقدار 6/4 102 اسپور شمارش کردیم و چون 400 مربع کوچک وجود داشت، 400 تقسیم کردیم و چون این مقدار در 1/4/000/000 وجود داشت با ضرب کردن درمقدار حجم در هر مربع (4/000/00ml) مقدار اسپورها رادرهرمیلی لیتر محاسبه کردیم که رقمی معادل 6/4106 شد و با تهیه دورقت متوالی مقدار اسپورها را به 1/6*106 رساندیم . بدین ترتیب که 1ml از سوسپانسیون اولیه را با PBS lme رقیق کردیم و مجدداً رقت تهیه شده را با 1me از PBS استریل رقیق کردیم تا به مقدار دلخواه رسیدیم.
بعداز یک هفته گرماگذاری، با وجود شروع رشد قارچ A.Flavus ازهمان 48h اولیه درنمونه شاهد، رشد قارچ درنمونه تیمار یافته دیده شد.
جدول 1: نتایج حاصل از تیمار محلول AFB1 (0/5 gr/ml) با سه سویه لاکتوباسیل درمدت زمانی 1h در دمای 370c .
Lb.rhamnosus
(ptcc 1637)
Lb.acidophillus
(ptcc 1643)
Lb.plantarum
(ptcc 1053)
تعداد تکرارهای آزمایش
33%
9%
44/5%
1
30%
7%
45%
2
31%
11/5%
44%
3

جدول 2: نتایج حاصل از تاثیر زمان گرماگذاری (370c) برمقدار کاهش AFB1 توسط lantarum
90 h
48 h
24 h
تعداد تکرارهای آزمایش
100%
99/2%
80%
1
99/2%
90%
79%
2
99/6%
97%
79/5%
3

جدول 5: نتایج حاصل از تاثیر دفعات شستشو بربازگشت AFB1 توسط plantarum
% آزاد شدن AFB1 کاهش یافته توسط planarum
شستشوی سوم
شستشوی دوم
شستشوی اول
تعداد تکرارهای آزمایش
0%
2/8%
12/9%
1
0%
0/11%
3/1%
2
0%
0/14%
8/7%
3

جدول 3: نتایج حاصل از تاثیر باکتریهای اتوکلاو شده و موجود درفاز ساکن برکاهش AFB1 بعد از 24h,90h گرماگذاری در 370c
% کاهش AFB1 توسط باکتوباسیل ها
Lb.plantarumموجود در فازساکن
Lb.plantarum اتوکلاو شده
تعداد تکرارهای آزمایش
90h
48h
90h
48h

82/5%
76/4%
14/8%
31%
1
89/7%
76/8%
15%
32%
2
89/7%
76/8%
14/5%
32%
3

جدول 4 : نتایج حاصل از بررسی روند رشد LB.Plantarum درمحلول AFB1 (0/5gr/ml)وPBS
مقدار جذب (OD) درطول موج 600nm
AFB1(0/5ppm)
PBS
زمان
1/64
1/66
0h
1/44
1/46
24h
1/66
1/58
48h
1/66
1/58
72h
1/66
1/58
96h
1/56
1/56
120h

فهرست مطالب
مقدمه 1
آفلاتوکسین در ذرت 2
خصوصیات بیولوژیکی و مورفولوژیکی Aspergillus Flavus 5
تولید آفلاتوکسین 6
بررسی آفلاتوکسین 9
روشهای سم زدایی 10
کنترل بیولوژیکی قارچهای مولدآفلاتو کسین و تولید آفلاتوکسین 11
کاربرد باکتری های اسیدلاکتیک 12
مقدمه ای بر باکتری های اسیدلاکتیکی 13
تاکسونومی 17
متابولیسم 19
زیستگاه: 20
متابولیت های ضد قارچی 21
اسیدهای آلی : 21
سایر محصولات نهایی تولید شده : 22
مروری بر فعالیت ضد قارچی باکتری های اسید لاکتیکی 23
روش کار 25
سوشهای باکتریایی و شرایط کشت 25
تخمین غلظت باکتریایی. 26
تعیین منحنی رشد باکتری 26
تعیین میزان کاهش آفلاتوکسین 27
اثر شستشو بربازگشت آفلاتوکسین کاهش یافته 27
تعیین مقدار AEB1 باقی مانده درمایع رویی نمونه ها 28
HPLC 28
سویه های قارچی و شرایط کشت 28
بررسی اثر بازدارندگی باکتری اسید لاکتیک برروی رشد قارچ 29
تهیه ذرت آلوده به اسپور قارچ آفلاتوکسین از: 30
تهیه نمونه های ذرت آلوده شده به سم و AFB (تهیه اسپایک) 31
روش استخراج AFB ازذرت 31
استخراج ازنمونه ذرت آلوده به اسپورقارچ: 32
استخراج ازنمونه اسپایک: 33
نحوه استفاده از ستون های ایمونوافینیتی (Immunoaffinity): 33
نحوه استخراج AFB1 ازرسوب باکتریایی 33
نتایج حاصل از کشت باکتری ها و تیمار محلول های AFB1 : 34
بررسی میزان بازدارندگی رشد قارچ توسط lactobacillus phantarum: 37
بررسی میزان آفلاتوکسین درنمونه های ذرت تیمارشده با لاکتوباسیلوس: 37

1

41