RNA های تنظیمی
جزئیات تنظیم ژن از هنگامی که فرانسیس ژاکوب و ژاک موناد در حدود 50 سال پیش مدل خود را ارائه داده اند ، مورد مطالعه قرار گرفته است . در آن زمان آن ها نمی توانستند که فاکتور های ترانس ( بازدارنده ) ، پروتئین هستند یا RNA . بعدها مشخص شد که در نمونه های مورد مطالعه آن ها ( و در واقع بسیاری از موارد دیگر)، تنظیم کننده ها پروتئین هایی هستند که با اتصال به جایگاه های اپراتور بر وی DNA عمل می کنند . آن ها در مقاله اصلی خود ، پیشنهاد نمودند تنظیم کننده ها می توانند مولکول های RNA باشند. آه ها در واقع امکان این امر را مطرح نمودند .
با کشف روز افزون تنظیم کننده های پروتئینی در پروکاریوت ها این ایده که مولکول های RNA ممکن است تنظیم کننده باشند به فراموشی سپرده شد.اما در سال های اخیر ،تحقیقات گسترده ای در مورد RNA های تنظیمی ( مخصوصاً در یوکاریوت ها ) که در سطح رونویسی و به ویژه ترجه عمل می کند ، انجام گرفته است این زمینه جدید از دو کشف مهم حاصل شد:کشف میکرو RNA ها که برای اولین بار در اوایل دهه 1990 گزارش شد.و سپس کشف پدیده ای به نامRNA مداخله گر در اواخر دهه 1990 قبل از توضیح درباره این شکل از تنظیم – چگونگی عملکرد آن ها و کاربرد هایی که برای محققان دارند – به تنظیم ژن به واسطهRNA در باکتری می پردازیم.
تنظیم به وسیله RNA ها در باکتری ها
RNA های کوچک سالیان زیادی است که در پروکاریوت ها شناسایی شده اند . بعضی از آن ها در تنظیم همانند سازی پلاسمید ها و بعضی دیگر در تنظیم بیان ژن شرکت می کنند . به عنوان مثال می توان به بعضی از RNA های شرکت کننده در تنظیم رو نویسی ، مانند 6S RNA از اشریشیا کلای اشاره کرد . این RNA به زیر واحد از پلیمراز متصل شده و رونویسی از اغلب پروموترهای را کاهش می دهد. 6S RNA به میزان زیادی در فاز توقف رشد ( فاز رشدی که باکتری ها به موازات کاهش مواد غذایی به آن وارد شده و تقسیم سلولی متوقف می شود .) تجمع می یابد .در فاز توقف رشد ، فاکتور دیگری یعنی S ساخته می شود .این با در اتصال به پلیمراز رقابت نموده و آنزیم را به طرف پروموتر ژن های بیان کننده پاسخ به استرس ها که برای زنده ماندن در فاز توقف ضروری است ، هدایت می کند . با کاهش رو نویسی از پروموترهای ، 6S RNA به این تغییر در جهت بیان پروموترهای S کمک می کند.
در سال های اخیر ، گروه دیگری از مولکول های کوچک RNA در باکتری ها مورد توجه قرار گرفته اند.این RNA ها ترجمه و تجزیه m RNA راتنظیم می کنند.موضوع جالب درباره این RNA های کوچک، شباهت شان به RNA هایی است که بیان ژن را در یوکاریوت ها تنظیم می کند ،یعنی میکرو RNA ها و RNA های کوچک مداخله گر که در نیمه دوم این فصل توضیح خواهیم داد . RNA های کوچک باکتریایی ( به نام s RNA ها ) بزرگ تر از RNA های تنظیمی در یوکاریوت ها هستند. آن ها همچون RNA های تنظیم کننده یوکاریوتی ، معمولاً از پردازش پیش سازهای دو رشته ایRNA های بزرگتر ایجاد نمی شوند ، بلکه در همان فرم نهایی خود به وسیله ژن های کوچکی رمز می شوند . بسیاری از این ژن ها با روش های بیوانفرماتک شناسایی شده و نزدیک 100 عدد از این s RNAها در E.coliموجود می باشد. در بین این s RNA ها،در حدود 12 عدد شناسایی شده و مورد بررسی قرار گرفته اند. اغلب s RNA از طریق تشکیل جفت باز با ترادف هایی در m RNA های هدف عمل نموده و تخریب m RNA را هدایت کرده یا باعث مهار ترجمه و یا حتی در بعضی موارد موجب تحریک ترجمه آنها می شوند.
اتصال s RNA به m RNA هدفش در اغلب موارد با کمک پروتوئین باکتریایی Hfq انجام می گیرد این چاپرون به دلیل کوتاه و ناقص بودن رابطه مکملی s RNA ها با m RNA ها هدف و در نتیجه میانکنش ضعیف بین آنها ، مورد نیاز می باشد .Hfq تشکیل جفت باز را تسهیل نموده و همچنین با اتصال به sRNA ها، پایداری این تنظیم کننده ها را قبل از تشکیل جفت باز با RNA هدف ، افزایش می دهد.
یک نمونه از s RNA ها که در E. coli به خوبی مطالعه شده ،RybB RNA با 81 نوکلئوتید می باشد .این s RNA بهm RNA های هدف متفاوتی متصل می شود و از آنجا که ساختارهای دو رشته ای ناجور تشکیل شده ، به عنوان سوبسترایRNase E شناخته می شوند، سبب تخریب m RNA ها می گردد.اغلب m RNA های مورد هدف RybB ، پروتئین های ذخیره کننده آهن را رمز می کنند. آمن آزاد تحت شرایط خاصی برای سلول مورد نیاز است .اما مقادیر بالای آهن سمی می باشد.RybB مقادیر آهن آزاد را با کنترل سطح پروتئین های ذخیره آهن ، کنترل می کند. RybB پروموتری که به وسیله فاکتور خاصی به نام E مشابه s ،فاکتور پاسخ به استرس ) شناسایی می شود ، بیان می گردد. بیان ژن رمز کننده E نیز به وسیله RybB تنظیم می شود،بنابراین ،این sRNA قسمتی از حلقه خود تنظیمی منفی برای E محسوب می کردد.
فاکتور فاز توقف یعنی s که در بالا به آن اشاره شد به وسیله زن rpoS در E. coli رمز می شود . ترجمه m RNA ی rpoS به وسیله دو s RNA یعنی DsrA و RprA ، تحریک می شود . این فعال سازی در اثر تغییر در محل ایجاد جفت بازهای RNA حاصل می شود. RNA های کوچک به ناحیه ای از m RNA متصل می شوند که قادر است با جایگاه اتصال ریبروم رابطه مکملی ایجاد کرده و ترجمه را مهار کند. ژن rpoS به وسیله RNA کوچک دیگری به نام OxyS نیز مهار می شود .
ما به RNA های تنظیمی عمل کننده از دور ( ترانس ) در نیمه دوم این فصل که نقش این عوامل را در تنظیم بیان ژن های یوکاریوتی مورد مطالعه قرار داده ایم ،خواهیم پرداخت . در ایمجه به ذکر مثال های دیگری از تنظیم بیان ژن های باکتریایی که در اثر تغییر محل ایجاد ناحیه مکمل در m RNA رخ می دهد اکتفا می کنیم.در این مثال ها مولکول های RNA تنظیم گر که بیان یک ژن را کنترل می کنند ، در داخل m RNA همان ژن قرار دارند و اصطلاحاً تنظیم نزدیک (cis ) را انجام می دهند. از مثال های جالب که ریبوسوییچ نیز نامیده می شود می توان به کنترل اپرون های متابولیک و تضعیف در اپرون های بیوسنتزی اشاره کرد . ژن های trpدر E. coli مثالی کلاسیک از مکانیسم تضعیف است که در آن تمظیم توسط RNA ثابت شده است .
ریبوسوئیچ ها در درون رونوشت ژن ها وجود داشته و با تغییر در ساختار دوم ، بیان آن ها را تغییر می دهند.
ریبولوئیچ ها بیان ژن را در پاسخ به تغییر در غلظت مولکول های کوچک ، کنترل می کنند . این عوامل تنظیمی به طور شاخص در ناحیه غیر قابل ترجمه 5' ژن هایی که کنترل می کنند یافت شده و می توانند بیان را در سطح رونویسی یا ترجمه تنظیم کنند . همان طور که خواهیم دید، آن ها این عمل را با تغییر در ساختار دوم RNA انجام می دهند . هر ریبوسوئیچ از دو قسمت ، آپتامر و سکوی بیان تشکیل شده است . آپتامر به لیگاندهای کوچک مولکول متصل شده و تحت تغییرات کنفرماسیونی قرار می گیرند، که به نوبه خود باعث ایجاد تغییر در ساختار دوم تغییر بیان می شود . این تغیرات ساختاری ، بیان ژن را با خاتمه دادن رونویسی و یا مهار آغاز ترجمه ،تغییر می دهند.
ریبوسوئیچ ها معمولاًدر بالا دست ژن های دخیل در سنتز متابولیت ها یافت می شود به عنوان مثال در باسیلوس سوبتیلیس ، بسیاری از ژن های درگیر در استفاده از آمینو اسید متیونین ، یک قسمت 200 موکلئوتیدی غیر قابل ترجمه در قسمت ابتدایی RNA ی خود دارند که به عنوان ریبوسوئیچ حساس به SAM ( -S آدنوزیل متیونین)،عمل می کند . RNA پلیمراز رونویسی را در پروموتر شروع کرده و این قسمت از RNA (ریبوسوئیچ حساس به SAM ) را قبل از رسیدن به توالی رمز گردان در قسمت پایین دست ژن ها ، رونویسی می کند.
هنگامی که این قسمت از RNA ساخته شد ، می تواند از طریق الگوهای متفاوت تشکیل جفت باز های درون مولکولی ، ساختارهای متفاوتی ایجاد نماید . یک آرایش حاوی یک ساقه – حلقه خاتمه دهنده رونویسی است . SAM (لیگاند مربوط ب این ریبوسوئیچ ) به آپتامر متصل شده و ساختار دومی را که این خاتمه دهنده رونویسی می سازد ، پایدار می کند تحت این شرایط رونویسی قبل از این که پلیمراز بتواند قسمت رمز کننده پروتئین از ژن را رونویسی نماید،خاتمه می یابد.این نوع تنظیم رونویسی ، تضعیف نیز نامیده می شود .در مثالی دیگر( در ژنی دیگر )، ریبوسوئیچ حساس به SAM می تواند با تنظیم ترجمه عمل نماید. در این مورد ساختار دومی که به وسیله اتصال SAM به آپتامر پایدار می شود ، حاوی ساقه حلقه ای است که خاتمه دهنده رونویسی نبوده بلکه دارای جایگاه اتصال ریبوزوم ( RBS درون ناحیه 4 ) می باشد. این تغییر ساختاری باعث پوشیده شدن RBS شده و آغاز ترجمه توسط ریبوزوم را مهار می کند. این نوع از مهار ترجمه ، شبیه به هماری است که برای RBS های عمل کننده از دور در بالا به ان اشاره شد.
بسیاری از ریبوسوئیچ ها شناخته شده اند و این ریبوسوئیچ ها به متابولیت های متفاوتی پاسخ می دهند . لیگاند ها شامل لیزین و آمینو اسیدهای دیگر، ویتامین B12 ، کونزیم تیامین پیروفسفات ( TPP ) ، فلاوین مونونوکلئوتید ( FMN ) و گوانین می باشد.
نوع دیگری از ریبوسوئیچ ها به جای پاسخ به لیگاندهای کوچک مولکول ، به tRNA های بدون بار ( بدون آمینو اسید ) پاسخ می دهند بنابراین بعضی ژن ها ، مخصوصاً ژن های آمینو آسیل – tRNA سنتتاز ها ضمن پدیده تضعیف توسط نواحی ابتدایی RNA ( RNA رهبر ) تنظیم می شوند.این ناحیه که غیر قابل ترجمه است ،طولی معادل 200 تا 300 نوکلئوتید داشته و به طور مستقیم و اختصاصی با tRNA بدون آمینواسید برای سنتتاز میانکنش می دهد.شکل باردار( دارای آمینو اسید ) این tRNA ، در پاکت اتصال حاصل از ساختار دوم RNA قرار نمی گیرد . اتصال tRNA بدون بار ، RNA رهبر دارای ساختار ضد خاتمه را پایدار می نماید ، به طوری که رونویسی می تواند تا ژن مجاور سنتتاز پیشروی کند . اختصایت به وسیله میانکنش کدون – آنتی کدون بین tRNA و RNA رهبر حاصل می شود . به دلیل توانایی tRNA بدون بار ( نه بار دار ) در اتصال به RNA رهبر،رونویسی فقط زمانی تحریک می شود که آمینو اسید مرتبط به مقذار کمی در دسترس باشد و سطح Trna بدون بار در سلول افزایش یابد .
با اینکه ریبوسوئیچ ها اغلب در باکتری ها وجود دارند ، اما در سایر موجودات همچون آرکی باکتری ها ، قارچ ها و گیاهان نیز یافت شده اند . در این موجودات عالی ، در برخی موارد ، ریبوسوئیچ ها حتی در کنترل پیرایش متناوب نیز دخیل هستند به عنوان مثال اخیراً در قارچ نوروسپورا کراسا ، 3 آپتامر TPP شناخته شده است که دو تا از آنها مهار کننده و سومی تحریک کننده بیان ژن ها از طریق تنظیم پردازش RNA می باشد.
تضعیف به وسیله حالت های مختلف ساختار دوم RNA ، برای اولین بار در مطالعه اپرون تریپتوفان از اشریشیا کلای کشف شد. همان طوری که در کادر توضیح داده شده است، اپرون های بیوسنتزی آمینواسیدها توسط پدیده تضعیف کنترل می شوند اپرون trp حاوی ژن های مسئول بیوسنتز تریپتوفان است. بیان این ژن ها در پاسخ به سطح تریپتوفان در سلول کنترل می شود . سطح تریپتوفان از مقدار در دسترس بودن آمینواسید ، مکانیسم کنترل عمومی برای اپرون های بیوسنتزی آمینو اسید ، می باشد . درک چگونگی کنترول اپرون trp برای اولین بار نشان داده که چگونگی حالت های مختلف ساختار دوم RNA می تواند در تنظیم بیان ژن در موجودات نقش داشته باشد.
کادر 1-18 اپرون های بیوسنتزی آمینواسیدها توسط مکانیسم تضعیف کنترل می شوند
در E. coli 5 ژن متوالی trp ، آنزیم های سنتز آمینواسید تریپتوفان را رمز می کنند. این ژن ها فقط وقتی که مقدار تریپتوفان کم شود با راندمان بالا بیان می شود این ژن ها توسط یک مهار مننده مثل ژن های lac مهار در غیاب لیگاند ( تریپتوفان ) از روی آن ها برداشته می شود.
حتی بعد از اینکه RNA پلیمراز سنتز مولکول m RNA مربوط به trp را شروع می کند، همیشه به طور کامل رونویسی صورت نمی گیرد. تصمیم برای ساخت یک نسخه کامل ، مانند حالت ریسوئیچ ، توسط مکهنیسم تضعیف کنترل می شود در این مورد اکثر نسخه ها به صورت نابالغ خاتمه می یابند، قبل از اینکه حتی اولین ژن مسیر سنتز trp یعنی trp E کامل شود اما وقتی که سطح تریپتوفان سنتز کم باشد پلیمراز خاتمه نمی یابد ، و همه ژن ها را رونویسی می کند .
اینکه تضعیف انجام شود یا نه به توانایی RNA ها به شکل گیری ساختارهای ثانویه بستگی دارد . مانند آنچه که در مورد ریبوسوئیچ ها رخ می دهد. با این تفاوت که در ایم مورد ف انتخاب بین ساختارهای بینابینی شکل گرفته توسط RNA پیشرو ، از طریق اتصال مستقیم لیگاند به آن RNA کنترل نمی شود ، در عوض، انتخاب حد واسطه در اثر وقوع همزمان رونویسی و ترجمه در باکتری ها صورت می گیرد.
توالی انتهای m RNA 5' اپران trp ، حاوی 161 نوکلئوتید توالی پیشرو در بالا دست اولین کدون trp E است . نزدیک به انتهای این توالی پیشرو و قبل از شروع trp E یک خاتمه دهنده رونویسی قرار دارد کخ از یک لپ سنجاق سری ویژه RNA تشکیل شده است و بعد از آن 8 باقی مانده یوراسیل قرار دارد . رونویسی معمولاً بعد از این خاتمه دهنده متوقف می شود ( ما فکر می کنیم که باید متوقف شود ) و منجر به تولید یک RNA پیشرو با 139 نوکلئوتید RNA می گردد . این محصول RNA در حضور غلظت های بالای تریپتوفان دیده می شود.
سه ویژگی توالی پیشرو اجازه می دهد که وقتی غلظت سلولی تریپتوفان کم باشد ،خاتمه گر توسط RNA پلیمراز پشت سر گذاشته شود .اول وجود یک سنجاق سر ثانویه ( علاوه بر سنجاق سر خاتمه گر ) که می تواند بین نواحی 1 و 2 پیشرو تشکیل شود . دوم ناحیه2 نیز مکمل ناحیه 3 است،بنابراین یک سنجاق سر دیگری متشکل از ناحیه 2 و 3 می تواند شکل بگیرد که با ایجاد آن از تشکیل سنجاق سر خاتمه دهنده ( 3و 4 ) جلوگیری می شود . سوم ، RNA پیشرو شامل یک قالب باز خواندن است که یک پپتید کوتاه 14 آمینو اسیدی را رمز می کند و قبل از این قالب باز ، جایگاه اتصال به ریبوزوم قوی وجود دارد توالی رمز کننده پپتید پیشرو ویژگی برجسته ای دارد : 2 تریپتوفان در یک ردیف قرار دارند . وقتی که تریپتوفان کم بوده و t RNA های دارای تریپتوفان خیلی کمی موجود باشد ، ریبوزوم در هنگام عبور از این 2 کدون ، از حرکت باز می ماند . تحت این شرایط ، RNA اطراف رمزهای تریپتوفان درون ریبوزوم قرار دارد و نمی تومند بخشی از ساختار سنجاق سری باشد .
ریبوزوم در محل رمزهای تریپتوفان مکث می کند ( بخش b )، ناحیه 1 پوشانده می شود و ناحیه 2 که به صورت آزاد رها شده است می تواند با ناحیه 3 جفت باز ایجاد نماید ،بنابراین،سنجاق سر خاتمه دهنده ( متشکل از ناحیه 3 و 4 ) نمی تواند شکل بگیرد از طرف دیگر ، اگر تریپتوفان کافی وجود داشته باشد ( و در نتیجه RNA های حاوی trp به مقدار کافی باشند ) ریبوزوم از رمزهای تریپتوفان پیشروی می کند و توالی 2 توسط ریبوزوم پوشانده می شود . در این حالت RNA شامل نواحی 3 و 4 ساخته می شود و با تشکیل خاتمه دهنده رونویسی تضعیف می شود و ژن های trp رونویسی نمی شوند .
اپران trp توسط مکانیسم های تضعیف و مهار کنترل می شود ، که یک پاسخ دو مرحله ای برای کنترل فقدان تریپتوفان است . اما تضعیف به تنهایی می توتند تنظیم سخت تری انجام دهد ، اپران آمینو اسید هایی مثل leu و his به طور کامل توسط مکانیسم تضعیف کنترل می شوند.در مورد اپران لوسین پپتید پیشرو آن دارای 4 رمز لوسین و پپتید پیشرو اپران هیستیدین 7 رمز هیستیدین پشت سر هم دارد .
RNA مداخله گر یکی از مکانیسم های اصلی تنظیم در یوکاریوت ها است.
قبلاً دیدیم که چگونه مولکول های RNA می توانند بیان زن ها در پروکاریوت ها را تنظیم کنند. 17 نیز مثال هایی از عناصر RNA تنظیمی در رونوشت هایی از بعضی از ژن های یوکاریوتی را دیده ایم ، اما این نقش ها از طریق اتصال پروتئن های تنظیمی ( پپتید HIV TAT یک مثال از آنهاست ) انجام می شد به هر حال به نظر می آید کهRNA نقش گسترده و مهمتری را در تنظیم بیان ژن در یو کاریوت ها ایفا می کند . . این مدل های جدید در این بخش توصیف می شوند .
انواعی از RNA های خیلی کوتاه قادرند بیان ژن هایی را که با RNA های آنها همولوژی دارند ، سرکوب – یا خاموش کنند این خاموش شدن که RNA مداخله گر (RNA i ) نامیده می شود . گاهی اوقات با مهار ترجمه m RNA در موارد دیگر با تخریب m RNA و حتی گاه با خاموش کردن پرو موترها یی که بیان آنها m RNA ها را کنترل می کنند ، نقش خاموش سازی خود را انجام می دهند . همان طوری که در زیر توصیف خواهیم کرد، این RNA های کوتاه توسط آنزیم های ویژه ای ازRNA های دو رشته ای طویل از منابع مختلف ساخته می شوند .
این هنوز نامشخص است که چگونه عمل گسترده RNA های تنظیمی شروع می شود و مکانیسم دقیق خاموش کردن ژن های هدف هنوز نامشخص است .اما نقش این RNA ها از محدوده تنظیم تکوین ( در کرم C. elegans و گیاه آرابیدوپسیس ) تا مکانیسم های حمایتی موجودات زنده علیه عفونت های ویروسی مشخص شده است . علاوه بر این ، RNA i به عنوان یک ابزار قوی ازمایشگاهی در موجودات زنده مختلف ساز کار شده است تا وسیله ای آسان جهت خاموش نمودن بیان هر ژن به خصوص را فراهم کنند .
RNA های کوتاهی که ژن ها را خاموش می کنند از منابع متعددی تولید شده و ژن ها را به طرق متفاوت خاموش می سازند.
قبل از توصیف نحول تولید و عملکرد دقیق این RNA های خاموش کننده کوتاه، مرور کلی بر چگونگی عمل این نوع خاموش مننده خواهیم داشت.
RNA های کوچک بر اساس منشا خود نام های متفاوتی دارند. آن هایی راکه به صورت مصنوعی یا در in vivo ، از پیش ساز های RNA دو رشته ای ساخته می شوند، RNA های کوچک مداخله گر (si RNA s ) نامیده می شوند. گروه دیگری ازRNA ها ی تنظیمی ، micro RNA (mi RNA ) نامیده می شوند.این گروه از RNA های پیش سازی مشتق می شوند که توسط ژن هایی رمز شوند ، این ژن ها در سلول هایی بیان می شوند که mi RNA هایشان عملکردهای تنظیمی ویژه ای دارند.
هر دوی این si RNA ها و mi RNA ها از مولکول های RNA طویل تر ساخته می شوند که توسط آنزیم دایسر که یک آنزیم شبیه RN aseIII است، شناسای می شوند.این آنزیم RNA های دو رشته ای طویل یا ساختارهای ساقه – حلقه تشکیل شده توسط پیش ساز mi RNA را شناسایی و هضم می کند. Si RNA و mi RNA به طور شاخص21-23 نوکلئوتید طول دارند .
اینRNA های کوچک بیان ژن های هدف هومولوگ را به سه طریق مهار می کنند: آن ها سبب تخریب m RNA رمز شده توسط ژن هدف می شوند، ترجمه m RNA را مهار کرده یا سبب القای تغییرات کروماتینی در ناحیه ژن هدف و بنابراین خاموشی رونویسی آن می شوند. قابل ملاظه است که هر کداه از این مسیرها که انتخاب شوند، مکثر همان اجزای ماشینی مورد نیاز است . این ماشین شامل یک کمپلکس به نام کمپلکس خاموش کننده القا شونده توسط RNA (RISC ) است. یک RISC علاوه بر si RNA یا mi RNA شامل پگروتئین های عضو خانواده آرگونات نیز می باشند.
si RNA یا mi RNA باید دناتوره شوند تا یک RNA راهنما – رشته ای که به عمل RISC اختصاصات می دهد- و یک RNA گذرا که معمولاً تخریب می شوند ، تولید شود . کمپلکس حاصله RISC بالغ به های هدف که حاوی توالی مکمل با RNA راهنما هستند.هدایت می شود. این RNA های هدف تجزیه شده یا ترجمه آنها همار می شود.به طور شاخص انتخاب به این بستگی دارد که چگونه RNA راهنما با m RNA هدف جفت می شود. اگر توالی ها به طور قابل توجهی مکمل باشند RNA هدف تجزیه می شود ، آرگونات زیر واحد کاتالیتیکی است که شکست اولیه m RNA را ایجاد می کند ، به همین دلیل به آرگونات ، خاموشگر و به عمل برش RNA ، خاموش سازی می گویند .
یک RISC همچنین می تواند به درون هسته راه یابد و دیگر پروتئین ها را به خدت بگیرد تا کروماتین اطراف پروموتر ژن مکمل RNA راهنما را تغییر دهد این تغییر در کروماتین سبب خاموش سازی رونویسی خواهد شد . برای مثال برای ایجاد خاموشی در نواحی سانترومری در Schizosaccharomyces Pombe به دستگاه RNA i نیاز است. در این مورد اعتقاد بر این است که نواحی سانترومری برای تولید RNA هایی رونویسی می شود که با RNA های دیگر از همان ناحیه هیبرید می شوند.
RNA های دو رشته ای حاصل به وسیله دایسر شناسایی و بهرای تولید si RNA های مسئول هدایت دستگاه RNA i به سوی سانترومرها ، برش می خورند.
ویژگی جالب توجه دیگر در خاموش سازی به وسیله RNAi کارایی فوق العاده آن است . بر این اساس اغلب مقادیر بسیار کمی از RNA دو رشته ای برای القای خاموشی تقریباً کامل بیان ژن هدف کافی است . یکی از عوامل افزاینده کارایی می تواند عملکرد یک RNA پلیمراز وابسته به RNA یا RdRP باشد. این یک آنزیم اضافی است که در بسیاری از مواردRNAi از جمله خاموشی سانترومری در مخمرهایتقسیم شونده مورد نیاز است.این پلیمراز می تواند سیگنال مهاری را تقویت کند بدین معنا که RdRP پس از ملحق شدن siRNA اولیه به Mrna هدف RNA دو رشته ای تولید می کند این فرآیند سبب تولید مقادیر زیادی از siRNA می شود. تا کنون RdRP در سلول های پستانداران شناسایی نشدهاست، اما کارایی بالای siRNA در این سیستم ها احتمالاً هنوز از این واقعیت ناشی می شود که فرایند خاموش سازی فرایندی کاتالیتیکی است،یعنی هر RISC می تواند چندینm RNA را برش دهد. بنابراین هر چند در ابتدای این فصل نمونه هایی از تنظیم از راه دور بیان ژن به وسیله RNA های کوچک در باکتری ها را مشاهده کردیم مکانیسم تولید و علکرد چنین RNA هایی در یوکاریوت ها بسیار متفاوت است.
ساخت و عملکرد مولکول های mi RNA
mi RNA ها دارای خصوصیتی ساختاری هستند که در شناسایی آن های و ژن های هدف شان کمک می کند.
همان گونه که دیدیم mi RNA ها دسته ای از RNA های تنظیمی هستند که بیان ژن را از طریق مسیرRNAi خاموش می کنند .در واقع شاید mi RNA ها از نظر تولید و عملکرد ، شناخته شده ترین دسته از RNA های تنظیمی باشند. همان گونه که در بالا اشاره شد mi RNA ها در ژنوم به صوررت قطعاتی از رونوشت های بلندتر رمز می شوند ساختار ویزه انها به شناسایی آن ها و پیشگویی ژن های هدفی که احتمالاً تنظیم می کنند کمک می کند.
شکل عملکردی هر mi RNA معمولاً دارای حدود 21 یا 22 نوکلئوتید است ( این اندازه می تواند بین 19 تا 25 نوکلئوتید متغیر باشد). این RNA های کوتاه به وسیله دو واکنش برش RNA از یک رونوشت بزرگتر RNA تولید می شوند این رونوشت بزرگ ترPri – mi RNA ( Pri ار واژه Primary اقتباس شده است ) نامیده می شود که ساختار دوم سنجاق سری دارد. نخستین برش ، ساقه – حلقه ای را آزاد می کند که پیش mi RNA نام دارد.دومین برش از پیش mi RNA مولکول mi RNA بالغ را تولید می کند.یکی از نخستین mi RNAهای شناسایی شده let – 7 است که خصوصیات آن نیز به خوبی تعیین شده است . این miRNA فرآیند تکوین کرم C. الگانس را در انتقال از حالت رالو به بالغ تنظیم میکند .
در ابتدا گمان می رفت که یک بازوی ساختار ساقه- حلقه پیش miRNA تبدیل به mi RNA تنظیمی می شود.اما اخیراً نمونه های زیادی شناسایی شده اند که در انها هردو بازوی ساختار به mi RNA تنظیمی تبدیل می شوند که هر یک مجموعه ژن های تنظیمی خود را کنترل می نماید. اکنون مشخص شده است که تولید mi RNA ها از هر دو بازو امری متداول است . پیش mi RNA ها می توانند به وسیله هر بخشی از یک رونوشت رمز شوند یعنی ممکن است در نواحی ترجمه شونده در نواحی راهبر یا درون اینترون ها قرار داشته باشند.
ساختارهای دوم متمایز در رونوشت اولیه که حامل یک mi RNA (Pri – mi RNA ) است ، پیش گویی حضور آنها را از طریق محاسبات در مورد تاخوردگی ایجاد ساختار دوم متمایز ترادف RNA امکان پذیر می سازد . علاوه بر این در بسیاری از موارد ژن های نامزد هدف که مورد تنظیم یک mi RNA هستند نیز قابل پیشگویی است.زیرا خاموش سازی مبتنی بر مکمل بودن ترادف بین هدف و mi RNA بالغ است. تشکیل جفت باز بین mi RNA و RNA هدف به وسیله میانکنش بین نوکلئوتیهایی انجام می شود که اصطلاحاً باقی مانده های هسته ای نامیده می شوند.این نوکلئوتیدها معمولاً ترادف بین بازهای 2و9 از ترادف 22 نوکلئوتیدی mi RNA هستند. این ناحیه دارای بیشترین میزان مکمل بودن است و بنابراین ناحیه مذکور مفیدتزین ناحیه برای شناسایی ژن های نامزد هدف است البته اثبات اینکه یک mi RNA به ئور واقعی وجود دارد نیازمند ان است که نه تنها حضور آن در سلول ( برای مثال به وسیله نورتون بلات ) مشخص شود بلکه بیان ژن مولد mRNA هدف باید در حضور آن mi RNA نیز تحت تاثیر قرار گیرد.
دو واکنش برشی که برای ساخت mi RNA از این رونوشت های اولیه لازم است به وسیله دوRNase مجزا کاتالیز می شود. یکی از آنها دایسر است که قبلاً آن را معرفی نمودیم و تقریبا برای تمامی مواردRNA i لازم است.انزیم دیگری که به طور ویژه برای پردازش mi RNA ضروری است دروشا نام دارد یک ویژگی در هردی این آنزیم ها آن است که آنها RNA ها را بر اساس ساختارشان و نه بر اساس ترادف ویزه انها شناسایی می کنند و برش می دهند حال توجه خود را به چگونگی عملکرد این انزیم ها معطوف می کنیم.
هر mi RNA فعال از طریق یک پردازش نوکلئوتیدی دو مرحله ای ساخته می شود.
دو انزیم تخصص برش دهنده RNA برای پردازش رونوشت اولیه Pri – miRNA که دارای ساختار ساقه – حلقه هستند به mi RNA بالغ نیاز است. نخستین آنزیم دروشا است که یکی ار اعضای خانواده آنزیمی RN ase III است.دروشا دو برش ایجاد میکند که ناحیه ساقه – حلقه از RNA (پیش mi RNA ) را از RNA رونوشت اولیه ( Pri – mi RNA) جدا می کند. این آنزیم به همراه یک زیر واحد پروتئینی ضروری برای عملکرد اختصاصی خود ( که در برخی موجودات پاشا و در برخی موجودات DGCR8 نامیده می شود ) عمل می کند و این دو پروتئین با یکدیگر یک کمپلکس میکروپروسسور فعال را تشکیل می دهند.پیش mi RNA که به وسیله دروشا تولید شده است معمولاًحدود 70 – 65 نوکلئوتید طول دارد. دروشا در هسته سلول جای دارد و رویداد برش که توسط دروشا کاتالیز می شود درون این اندامک سلولی رخ می دهد.
ساقه در Pri – mi RNA که دارای بازهای جفت شده می باشد معمولاً حدود 33bp طول دارد ( اغلب حلقه نسبتاً بزرگ و حدود 10 نوکلئوتید است ) ترادف این ناحیه حلقوی برای برای واکنش های فراوری مهم نیست. وجود RNA تک رشته ای (ssRNA ) فاقد ساختار دوم در دو سمت ( 5' و 3' ) ساختار ساقه و حلقه برای فراوری به وسیله دروشا لازم می باشد در واقع اتصالات RNA دو رشته ای – RNA تک رشته ای مسئول عمده تعیین ویژگی برش توسط دروشا هستند .
ناحیه ساقه می تواند به دو بخش عملکردی شامل ساقه پایینی با طول تقریباً 11 bp و ساقه بالایی با طول تقریبی 22 bp تقسیم شود . دروشا 11 bp را از محل اتصال RNA دو رشته ای RNA- تک رشته ای یعنی مابین ساقه پایینی و بالایی در pri _ mi RNA جدا می کند . بنابراین دو برش مذکور پیش mi RNA ای را تولید می کنند که حدود 65 نوکلئوتید طول دارد و متشکل از 22bp ( دو مارپیچ ) از RNA دو رشته ای و حلقه بالایی می باشد . آنزیم های خانواده RNase III به طور اختصاصی روی RNA دو رشته ای عمل می کنند و آن را به گونه ای برش می دهند که دو نوکلئوتید بیرون زده ( دو نوکلئوتید فاقد نوکلئوتید مکمل ) در انتهای 3' محصول RNA دو رشته ای باقی می ماند این بیرون زدگی در 3' برای شناسایی مولکول های RNA به وسیله آنزیم بعدی این مسیر یعنی دایسر مهم است .
دایسر دومین آنزیم برش دهنده RNA است که در تولید mi RNA نقش دارد.
پیش mi RNA که به وسیله دروشا آزاد شده است به سیتوپلاسم انتقال می یابد تا در آنجا دومین واکنش برش RNA به وسیله دایسر انجام شود . دایسر نیز همانند دروشا جایگاه های برش خود را به جای مکانیسم برش در ترادف های ویژه با مکانیسم اندازه گیری انتخاب می کند. ساختار دقیق دایسر توانسته است دیدگاهی را برای چگونگی احتمالی انجام این رویداد فراهم کند .دایسر از سه بخش عملکردی تشکیل شده است این بخش ها شامل دو دمینRNase III و یک دمین متصل شونده به RNA دو رشته ای به نام دمینPAZ می باشد .
کل ساختار پروتئین دایسر شبیه یک تبر کوچک است . دُمین PAZ در پایین دسته این تبر جای دارد که یک جایگاه اتصال را برای انتهای RNA 3' دو رشته ای سوبسترا تشکیل می دهد. دسته این تبر از یک دمین ارتباط دهنده ایجاد شده که حاوی بارهای سطحی مثبت برای بر هم کنش بر مولکول RNA است بخش فوقانی تیغه شامل دو دمین RNase است که به صورت یک دیمر متقارن قرار میگیرند. هر دمین RNase شامل یک دهانه فعال بوده و مسئول برش یکی از دو رشته RNA سوبسترا است بنابراین دایسر تنها قادر است روی RNA دو رشته ای عمل نماید. بدون توجه به اینکه توالی چیست دایسر تقریباً 22 نوکلئوتید از انتهای 3' مولکول RNA سوبسترا را برش می دهد . در حقیقت دلیل وجود mi RNA ها با اندازه های متفاوت در موجودات مختلف وجود دمین های PAZ با اندازه های متفاوت.
تلفیق RNA راهنما به RISC موجب ایجاد کمپلکسی بالغ می گردد که آماده خاموش کردن بیان ژن است.
عملکرد دروشا و به دنبال آن دایسر منجر به ایجاد مولکول RNA به طول 25-21 نوکلئوتید میگردد که در تنظیم بیان زن نقش دارد . فرم فعال mi RNA تنظیمی به شکل تک رشته ای است( که در این حالت RNA راهنما خوانده می شود) که با کمپلکس پروتئینی RISC تلفیق می گردد . در این کمپلکس RNA راهنما به عنوان عضو جدید RISC آنرا به طرف RNA هدف راهنمایی می کند گفته می شود که قطعه 22 نوکلئوتیدی به اندازه کافی طویل است تا بتواند به طور اختصاصی ژن هدف را از میان انبوه ژنوم های یوکاریوتی از طریق ایجاد جفت باز به صورت RNA – RNA شناسایی کند . RISC یک کمپلکس چند عضوی است که شامل mi RNA نیز می شود . RNA راهنما با m RNA هدف ایجاد جفت باز می کند که در نهایت باعث خاموشی بیان ژن می گردد. عضو مر کزی این کمپلکس تنظیمی ، پروتئینی است که آرگونات نامیده می شود که از خانواده آنزیم های برش دهنده RNA است.بهترین مکانیسم شناخته شده در خاموش کردن ژن برش mRNA توسطRISC می باشد. ارگانیسم های مختلف اعضای مختلفی از خانواده پروتئین آرگونات را دارند به عنوان مثال در انسان 8 نوع مشخص این آرگونات ها شناسایی شده است ولی همه این آرگونات ها به هنگام اتصال به کمپلکس RISC فعالیت برش mRNA را نشان نمی دهند. بعضی RISC های دارای آرگونات دیگر خاموشی بیان ژن را از طریق مکانیسم غیر وابسته به برش یعنی از طریق مهار ترجمه پیش می برند.ایجاد RISC فعال و برش پیش به ترتیب زیر اتفاق می افتد مولکول RNA دو رشته ای کوچک که توسط دایسر ایجاد شده است به کمپلکس RISC ملحق می شود . این dsRNA واسرشته می شود (تک رشته می شود ) تا رشته RNA راهنما و RNA گذار را ایجاد کند.
بر طبق یک مدل رشته گذرا توسط آرگونات بریده شده و از کمپلکس آزاد می گردد. بر اساس مدلی دیگر رشته گذرا بدون ایجاد برش در آن و در اثر عمل یک هلیگاز حذف می شود . در این حالت RISC ایجاد شده را RISC بالغ می نامند که حاوی تک رشته RNA راهنماست و آماده سناسایی و برش m RNA هدف می باشد.
همانطوری که در مورد دایسر دیدیم ساختار پروتئین آرگونات باعث فهم مگانیسم چگونگی شناسایی RNA هدف و برش آن توسط RISC شده است . نظیر دایسر آرگونات نیز دارای هر دو دمین PAZ و RNase است . دمین PAZ به طور اختصاصی انتهای 3' از RNA هدف را شناسایی می کند . RNA راهنما از طریق ایجاد جفت باز به RNA هدف جهت انجام برش قرار می گیرد . برش تقریباً در نقطه وسط ناحیه دو رشته ای RNA هدف -RNA راهنما حد واسط نوکلئوتید 10 و 11 از انتهای 5' مولکول RNA هدف ایجاد می گردد.
همانطوری که تا به حال مرتباً ذکر کردیم در بعضی موارد RISC بالغ قادر به مهار ترجمه علاوه بر برش و قطعه قطعه کردن m RNA نیز است.چگونگی این مهار ترجمه به خوبی مشخص نیست اما به نظر می رسد. که mi RNA ها در برخی موارد جهت خاموش سازی mi RNA ها به سمت اجزایی که اجسام پردازش کننده (P – body ) نامیده می شوند و در سیتوپلاسم قرار دارند هدایت می شوند . در داخل این اجسام ، مهار ترجمه صورت می گیرد . اتصال mi RNA همچنین می تواند سبب ناپایداری دم پلی A در m RNA هدف شده و آغاز ترجمه آن را ناکارآمد کند.
Si RNA ها نوعی RNA های تنظیمی هستند که از RNA های دو رشته ای بلند ایجاد می شوند.
همان طور که دیدیم مراحل اصلی در سنتز mi RNA فعال به صورت ، مرحله برش دهی دروشا ، به دنبال آن برش دایسر سپس ورود RNA راهنما به کمپلکس RISC ، صورت می پذیرفت . اما فقط miRNA است که از ساختارهای سنجاق سری بزرگی تشکیل می شود . برخلاف این RNA مورد نیاز در si RNA یک RNA دو رشته ای طویل است . بنابراین می توان از این تفاوت در پیش سازهای آغاز گر های اولیه نتیجه گرفت که دروشا در ایجاد si RNA نباید نقشی داشته باشد. اما برشی که دایسر ایجاد می کند در اینجا نیز ایجاد قطعات 22-21 نوکلئوتیدی می کند که به کمپلکس RISC متصل می شود. در گیاهان حتی mi RNA توسط دایسر به تنهایی ایجاد می شود اما این مشخص نیست که چرا آنها به تنهایی قبل از برش توسط دروشا می تانند شکل بگیرند؟
مشاهدات و آزمایشها منجر به اطلاعات کنونی ما در مورد RNA های تنظیمی کوچک در یوکاریوت ها شده است . این شواهد در اواخر دهه 1980 از نتایج مشکوکی که در مطالعات بیان ژن مولد رنگدانه در گونهpetunias انجام گرفت ، به دست آمد. در این مطالعه محققان معی در ایجاد هر چه بیشتر رنگ بنفش داشتند ولی در نهایت گل هایی بدست آمدند که رنگ سفید داشتند نتیجه شگفت اور دیگر در مطالعات تنظیم ژن دیگری در کرم ها بود که مشاهده شد محصولات آنها به mi RNA تبدیل می شود و سپس آزمای شها نشان داد که از طریق وارد سازی یک RNA دو رشته ای به کرم ها می توان سبب خاموشی بیان ژن های مکمل شد.
RNA های کوچک با ایجاد تغییر در ساختار کروماتین قادر به خاموش کردن ژن ها در مرحله رونویسی هستند.
تا به حال دیدیم که چه طور mi RNA و si RNA با مهار رونویسی m RNA هدف و یا تخریب مستقیم آن باعث خاموشی ژن می شوند RNA های تنطیمی در سطح بیان ژن نیز عمل می کنند . به طوری که بیان ژن های هدف را با ایجاد تغییراتی مستقیم در هیستون ها ی ناحیه پروموتری خاموش می کنند . این مکانیسم در سطح بیان ژن های زن نیز عمل می کنن به طور ی که بیان ژن ها ی هدف را با ایجاد تغیراتی مستقیم در هیستون های ناحیه پرو موتری خاموش میکند. این مکانیسم به طور وسیع در مورد خاموشی ناحیه سانترومری مخمر Spombe مورد بررسی قرار گرفته است .در مخمر شیزو ساکارو میسس پمبه ژن هایی که در نقاط خاصی از ژنوم قرار دارند به طور ویژه خاموش می شوند . در این مورد همان طور ی که توضیح داده شد ژن هایی که در ساکارومیسس سروزیه در مجاور تلومر قرار دارند ، خاموش می شوند . در هر دو مخمر ژن هایی که در لقاح نقش دارند نیز خاموش می شود . در مخمر pombe. S نواحی سانترومری ، از دیگر نواحی خاموش شونده است در هر دو ارگانیزم خاموشی پیام بیان ژن همراه با ایجاد تغییراتی در هیستون هاست . ولی برخلاف خاموشی بیان زن در ساکارومیسس سرویزیه که فاقد مکانیزم RNA i ، در S. pombeخاموشی سانترو مری به علت این پدیده است . سانترو مرها در S.pombe نسبت به ساکارو میسس سرویزیه از لحاظ سازمان یابی توالی ها به یوکاریوت های عالی ( مثلاً مگس سرکه و انسان ) بیشتر شبیه هستند . هر سانترومر دارای یک قسمت مرکزی با توالی بلند و منحصر به فردی است که توسط توالی تکراری که در تمامی سانترومر ها وجود دارد . در هر دو سمت احاطه می شوند. این توالی ها تکراری برای عملکرد سانترومرها ،تشکیل هترو کرو ماتین ها و توقف رونویسی در نواحی مربوط به این توالی ها مهم است هیستون هخایی که در ناحیه هترو کروماتین قرار دارند، حانل مارکر های سرکوب کننده هستند که عبارتند از : میزان کم استیلاسیون و میتیلاسیون لیزین شماره 9 بر روی دم هیستون شماره3(H 3 k9 ) S. pombe صرفاً دارای یک ژن برای هر کدام از اجزا هم مسیر RNA i یعنی دایسر و آرگونات است. ارگانیسم های عالیتر حاوی چندین ژن برای آرگونات و دایسر هستند که کم و بیش عملکردی متفاوت دارند ؛بنا بر این دست ورزی های ژنتیکی این مسیر را مشکل می شازد بز رخلاف کرم ها و حشرات در S . pombe فقدان مسیر رانی کشنده نیست . هرچند که باعث کند شدن رشد سلولی به عنوان مثال از طریق اختلال در جدا سازی کروموزومی می شود . این نتیجه بسیار جالب توجه بود زیرا حذف هر یک از اجزای مسیر RNA i می توانست منجر به حذف میتیلاسیون هیستون H3k9 و عدم مهار بیان ژن ها در ناحیه سانترو مر شود . به ویژه اینکه تا قبل از این تصور می شد RNA i تنها در مرحله بعد از رونویسی نقش خاموش ساز ی دارد در حالی که در تجربه فوق مشخص شد خاموشی در سطح خود رونویسی صورت گرفته است نه پس از آن . علت اصلی این خاموشی رونویسی خود توالی های تکراری سانترومر است این توالی ها بر روی هر دو رشته توسط RNA پلی مرازII به طورکامل رونویسی می شوند که قادر به جفت شدن و ایجاد RNA دو رشته ای هستند . سپس مولکول های RNA ، به وسیله ماشین مولکولیRNA i موفق به ایجاد siRNA می گردد siRNA حاصل کمپلکسی حاوی آرگونات که شبیه کمپلکس RISC می باشد ( کمپلکس القا کننده خاموشی در رو نویسی یا RITS نامیده می شود ) را به سمت سانترومر ها هدایت می کند از لحاظ تئوری siRNA با توالی خاصی از DNA در محل سانترومر جفت باز تشکیل می دهد اما مدل مطلوب تر مدلی است که در آن siRNA به کمپلکس RITS ملحق شده و آن را به سمت منطقه سانترومری که رونوشت های تازه سنتز شده توسط RNA پلیمراز II از آن خارج شده اند ، هدایت می کند . این الحاق منجر به خاموشی رو نوشت های ناحیه سانترومری می شود که برای ایجاد و گسترش تغییرات هیستونی در ناحیه سانترومری لازم است . بنابر ان رو نویسی خود منجر به ایجاد خاموشی نواحی خود می شود همان طوری که قبلاً اشاره کردیم جایگاه matang – type در S. pombe نیز از نظر رونویسی خاموش هستند اما نکته جالب این است که این مکانیزم مهاری در انواع جهش یافته ای که دارای نقص در مسیر RNA i هستند متوقف نمی شود. بنابر این می توان گفت که RNA i تنها در مراحل ابتدایی مهار دخالت دارد و وقتی که اثر خود را ایجاد کرد این پروتئین ها هستند که باعث می شوند منطقه مهار شده ، تثبیت گردد . مشابه این عمل در ساکارومیسس هم رخ می دهد .
به نظر می رسد که در سایر ارگانیسم ها نیز RNA i در خاموش کردن هترو کروماتین نقش داشته باشد همچنین مهار ناخاسته رونویسی از طریق ترانسپوزون ها نیز به واسطه RNA صورت می پذیرد .
کادر 2-18 تاریخچه ای از mi RNA s و RNA i
در سال 1989 ریچارد جور جنسن که در شرکت زیست فن آوری علوم پیشرفته ژنتیکی اوکلند کالیفرنیا کار می کرد سعی در ایجاد گونه ای از گیاه petunia داشت که نسبت به گونه های موجود رنگ ارغوانی بیشتری ایجاد می کند استراتژی او بدین ترتیب بود: او یک کپی اضافی از ژن رنگیزه را که رمز کننده آنزیم Chalcon synthase بود تحت کنترل دقیق یک پروموتر قوی به گیاه وارد کرد . انتظار می رفت که گیاهان جدید گل های پر رنگ ایجاد کنند ولی آنچه بدست آمد گیاهانی بودند که به لحاظ شدت رنگ محدوده کمرنگ تری از رنگ ارغوانی داشتند برخی دارای لک های سفید و ارغوانی و برخی دیگرکاملاً سفید بودند .
نتایج دلگرم کننده نبود ولی به هر حال جالب به نظر می رسیدند جورجنسن برای توجیه وقایعی که مشاهده کرده بود ، فرضیه مهار ( هم زمان ) را بیان کرد ( چرا که بیان ژن ورودی و نوع طبیعی با هم مهار شده بود ) افزایشس بیان زن وارد شده با کاهش چالکون سنتاز همراه است . افزایش در بیان زن یا به علت افزایش تعداد نسخه های زن ورودی و یا به دلیل استفاده از پروموتر قوی تر به دست می آید . باید یاداوری کرد که گیاهان مختلف و حتی گل های مختلف یک گیاه الگو های متفاوتی در ساخت رنگیزه داشتند گاهی اوقات این الگو ها به صورت ارثی و حفظ می شدند اما در سایر حالت ها به وضوح تغییر در نحوه توارث آنها قابل مشاهده بود این مشاهدات به جورجنسن و سایرین نشان داد که با یک فر آیند اپی ژنتیک سرو کار دارند . محققین دیگری سعی داشتند تا گیاهانی مقاوم به عفونت های ویروسی تولید کنند یک روش در مورد تولید این نوع از گیاهان، افزایش بیان نسخه جهش یافته ای از یک فاکتور همانند سازی ویروسی با اثر غالب منفی بود . انتظار می رفت این فاکتورها همانند سازی هر ویروسی را که از این مکانیسم تکثیری استفاده می کند بلوکه می کنند.
21