بسم الله الرحمن الرحیم
کنترل کیفی دیسکهای آنتی بیوتیک
هدف
در آزمایش تعیین حساسیت میکروبی ، کنترل کیفیت شامل روال هایی برای پایش کارایی تمام مراحل و اجزای آزمایش ، جهت اطمینان از نتایج قابل اعتماد است . این منظور با آزمایش سویه های کنترلی در مقابل عوامل ضد میکروبی با حساسیت شناخته شده به دست می آید ، اما به آن محدود نمی شود .
اهداف برنامه کنترل کیفیت ، پایش موارد ذیل است
دقت ( تکرار پذیری ) و صحت روش سنجش حساسیت
کارایی موادی که در آزمایش استفاده می شوند
کارایی افرادی که آزمایش را انجام داده و نتایج را می خوانند
– شیوه های کنترل کیفیت و تضمین کیفیت
تولید کنندگان (برای محصولات داخلی یا تجاری)
پایداری عوامل ضدمیکروبی
برچسب گذاری مواد ضدمیکروبی
توان محلول های مادر (stock)عوامل ضدمیکروبی
تطابق با اصول عملکرد مطلوب ساخت ( برای مثال استانداردهای سیستم کیفیت)
سالم و بی عیب بودن محصول
قابلیت ردیابی و پاسخگویی به گیرندگان محصول
مسئولیت و پاسخگویی را می توان بطور منطقی بشرح ذیل تقسیم نمود:
آزمایشگاه ها (کاربران) :
ذخیره سازی در شرایط محیطی توصیه شده توسط تولید کننده ( برای جلوگیری از تخریب دارو)
مهارت کارکنان انجام دهنده آزمایش
استفاده از استانداردهای جاری CLSI ( یا دستورالعمل های تولید کننده برای استفاده)
تبعیت از روشهای مصوب (بعنوان مثال تهیه مایه میکروبی، شرایط گرمخانه گذاری، تفسیر نتایجMIC)
هر سویه کنترلی باید از یک منبع شناخته شده (مثلاً
) تهیه شودATCC
،مناسب برایCLSIتمام سویه های کنترلی توصیه
عوامل ضدمیکروبی و روش مرجع باید ارزیابی
شود و نتایج مورد انتظار ثبت گردد
:انتخاب سویه های کنترل کیفی برای انجام کنترل و تضمین کیفیت
CLSIسویه های کنترل کیفی پیشنهادی توسط
Enterococcus faecalis ATCC® 29212
Escherichia coli ATCC 25922
Escherichia coli ATCC 35218
Haemophilus influenzae ATCC 49247
Haemophilus influenzae ATCC 49766
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603
Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Streptococcus pneumoniae ATCC 49619
Enterococcus faecalis ATCC 29212همچنین برای کنترل دیسکهای آمینو گلیکوزید با دوز بالا به کار می رود.
E.coli ATCC 35218فقط به عنوان یک میکروارگانیسم کنترلی برای ترکیبات ممانعت کننده بتالاکتاماز، مثل ترکیبات حاوی کلاولانیک اسید، سولباکتام یا تازوباکتام پیشنهاد می شود
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603به عنوان یک سویه کنترلی برای آزمایشاتESBL به کار برده میشود.
کنترل کیفیت قطر هاله عدم رشد سویه کنترلی/ دیسک آنتی بیوتیکی
سویه های کنترل کیفی را باید به روش استاندارد دیسک دیفیوژن و با استفاده از همان مواد و روشی که برای سویه های جدا شده از نمونه های کلینیکی استفاده می شود آزمایش و نتایج را با جداول CLSIمقایسه و بررسی نمود.محدوده قطر هاله عدم رشد قابل قبول برای هر سویه کنترلی نسبت به یک دیسک آنتی بیوتیکی در جداول فوق فهرست شده است.
کنترل کیفیت قطر هاله عدم رشد سویه کنترلی/ دیسک آنتی بیوتیکی
الف _ انجام آزمایش روزانه
برای هر سویه کنترلی با یک دیسک آنتی بیوتیکی باید ۲۰ یا30
روز متوالی آزمایش تعیین حساسیت انجام و نتایج با
مقادیر قابل قبول جداول تفسیرقطر هاله برای سویه های استاندارد مقایسه گردد .
بر اساس ضریب اطمینان ۹۵ % تنها یک مورد از ۲۰ نتیجه
قرائت شده یا3مورد از30نتیجه می تواند خارج از محدوده کنترل باشد.
چنانچه بیشتر از یک مورد از 20 نتیجه یا بیش از 3مورد از 30نتیجه خارج از محدوده کنترل باشد نیاز به
اقدامات اصلاحی خواهد بود.
آزمایش کنترل کیفیت را باید درچه فواصل زمانی انجام داد ؟
ب _ انجام آزمایش هفتگی
– در صورتیکه تنها یک مورد از ۲۰ نتیجه قطر هاله عدم رشد برای هر سویه کنترلی / دیسک آنتی بیوتیکی خارج از محدوده قابل قبول قرار گیرد،کنترل کیفی روزانه را به هفتگی تغییر دهید.
– آزمایش کنترل کیفی هفتگی را یکبار در هفته و هم چنین زمانیکه یکی از عوامل آزمایش (مانند سری ساخت
آگار یا دیسکهای تهیه شده از یک سازنده) تغییر کند، انجام دهید .
اگر هر یک از نتایج کنترل کیفی هفتگی خارج از محدوده قابل قبول باشد ، انجام اقدامات اصلاحی مورد نیاز است.
الف _ نتایج خارج از محدوده قابل قبول به دلیل خطاهای مشهود و واضح شامل:
– استفاده از دیسک اشتباه
– استفاده از سویه کنترلی اشتباه
– آلودگی واضح سویه
– استفاده غیرعمدی از دما و شرایط اشتباه انکوباسیون
بوجود آمده است . دراین حال باید دلیل ایجاد خطا مکتوب و پس از اصلاح آزمایش دوباره تکرار شود .
اگر نتایج گزارش شده در محدوده مورد نظر قرار گرفت ، عملیات اصلاحی بیشتری مورد نیاز نمی باشد
اقدامات اصلاحی
ب _ عامل ایجاد نتایج خارج از محدوده کنترل نامشخص است. در این حال باید اقدامات اصلاحی فوری
– آزمایش را جهت یک سویه کنترلی / دیسک آنتی بیوتیکی برای ۵ روز متوالی تکرار و همه نتایج را ثبت کنید.
در محدوده قابل قبول باشد – اگر اندازه هر ۵ قطرهاله
اقدام اصلاحی بیشتری مورد نیاز نمی باشد .
– اگر اندازه هر یک از ۵ قطر هاله عدم رشد خارج از محدوده قابل قبول باشد ، به عملیات اصلاحی اضافی نیاز است.
– آزمایشهای کنترلی روزانه باید ادامه داده شود تا به دلیل نهایی مشکل پی برده شود
اقدام اصلاحی اضافی (Additional corrective Action)
اگر اقدام اصلاحی فوری مشکل را حل نکند در این حالت احتمال وجود خطای سیستماتیک نسبت به خطای اتفاقی بیشتر است لازم است بررسی بیشتر و اقدام اصلاحی انجام شود در صورت لزوم سویه کنترل کیفیت جدید ( از ذخیره فریز شده یا از سایر منابع قابل اطمینان) همراه با سری جدیدی از مواد (شامل استاندارد نیم مک فارلند)را در صورت امکان از تولید کننده ها متفاوت تهیه نمایید.
اگر مشکل از تولید کننده بود با تولید کننده تماس بگیرید و مشکل را مطرح کنید ..
سویه کنترلی :
استفاده از سویه کنترلی اشتباه
انبارش نامناسب
نگهداری نامناسب ( برای مثال استفاده از یک کشت کاری به مدت طولانی تر از یک ماه)
آلودگی
زنده نبودن باکتری ها
تغییر در ارگانیسم ( برای مثال جهش از دست رفتن پلاسمید)
پاره ای از علل نتایج خارج از کنترل شامل موارد ذیل است اما به این موارد محدود نمی شود:
چنانچه تغییر در میانگین قطر هاله عدم رشد ناشی از خطا در روش انجام آزمایش نباشد ، احتمالا " ناشی از تغییر در حساسیت ذاتی باکتری نسبت به آن آنتی بیوتیک می باشد. در این صورت لازم است کشت تازه از سوش کنترل تهیه شود .
مراحل آزمایش:
استفاده از شرایط یا دمای گرمخانه گذاری نادرست
مایه میکروبی بطور غیرصحیح تهیه یا تنظیم شده باشد.
تهیه مایه میکروبی از کلنی هایی که مدت گرمخانه گذاری آنها مناسب نبوده است.
مایه میکروبی از کلنی هایی تهیه شده باشد که روی محیط های افتراقی یا انتخابی حاوی عوامل ضدعفونی یا سایر ترکیبات مهارکننده رشد کرده اند.
استفاده از دیسک اشتباه
قراردهی ناصحیح دیسک( برای مثال تماس ناکافی با سطح آگار)
قرائت یا تفسیر نتایج آزمایش بطور نادرست
خطا در ثبت و انتقال اطلاعات
ملزومات آزمایش:
-شرایط حمل یا انبارش نامناسب
-آلودگی
-استفاده از ظروف پتری معیوب (برای مثال محیط خیلی ضخیم یا خیلی نازک)
-استفاده از ظروف پتری آسیب دیده (برای مثال ترک خورده)
-استفاده از مواد تاریخ مصرف گذشته
اگر مشکل شناسایی و اصلاح شد برای بازگشت به آزمایش کنترل کیفیت هفتگی لازم است برای 5 روز متوالی دیگر عملکرد مطلوب آزمایش ثبت شود اگر مشکل شناسایی نشود و نتایج بدون هر گونه اقدام اصلاحی خاص مجدداً در محدوده کنترل قرار گیرد برای بازگشت به آزمایش کنترل کیفیت هفتگی لازم است برای 20 یا 30 روز متوالی دیگر عملکرد مطلوب آزمایش ثبت شود.
جهت نگهداری دیسک ها توجه به شرایط ذیل ضروری است .
دیسک ها را تا زمان تاریخ انقضاء باید در یخچال ( دمای 8 درجه سانتی گراد یا کمتر ) یا در فریزر ( 14 – درجه سانتی گراد یا کمتر ) نگهداری کنید
دیسک ها نباید در فریزرهایی با قابلیت ذوب یخ خود به خودی ، نگهداری گردند .
بسته های باز نشده دیسک های کلاس بتالاکتام باید در فریزر نگهداری شوند و به مقدار کم و مصرف حداکثر یک هفته ، از فریزر خارج شوند و در یخچال نگهداری گردند .
بعضی آنتی بیوتیکهای حساس ( مانند ایمی پنم ، سفالکر ( cefaclor ) و ترکیبات حاوی کلاولانیک اسید ) در صورت نگهداری در فریزر تا زمان مصرف ، از پایداری بیشتری برخوردار خواهند بود .
ذخیره سازی دیسک های ضد میکروبی
بسته های باز نشده حاوی دیسک را 2 -1 ساعت قبل از مصرف ، از یخچال یا فریزر خارج کنید تا به دمای اتاق برسد . این کار تماس هوای گرم با دیسک یخ زده و متعاقباً تغلیظ دارو در سطح دیسک را به حداقل می رساند
دیسک ها توسط تولید کنندگان در بسته های غیر قابل نفود به رطوبت ارائه می گردند .
لازم است از بازکردن بسته حاوی دیسک ، به میزان بیش از مقدار مورد نیاز خودداری گردد .
در صورت باز کردن باید دیسک ها را در لوله های در پیج دار محتوی ماده جاذب رطوبت به مقدار کافی استفاده نمود
باید اجازه داده دستگاه توزیع کننده دیسک قبل از باز شدن به دمای اتاق برسد در صورت تغییر رنگ معرف ، ماده جاذب رطوبت را تعویض نمائید و به این وسیله از رطوبت اضافی جلوگیری کنید .
وقتی از دستگاه توزیع کننده حاوی دیسک استفاده نمی شود باید آن را در یخچال قرارداد .
فقط از دیسک هایی استفاده کنید که هنوز به تاریخ انقضاء قید شده روی بر چسب نرسیده اند دیسک ها را با اتمام تاریخ انقضاء دور بریزید .
. مواد مورد نیاز برای آزمایش تعیین حساسیت میکروبی
1 مولر هینتون آگار
به دلایل ذیل MHAرا به عنوان بهترین محیط جهت باکتری های کم نیاز در نظر گرفته است .
در سری ساخت های متفاوت ، تکرار پذیری قابل قبولی را نشان می دهد .
مهار کننده های آن به حدی اندک است که نمی تواند نتایج آزمایش حساسیت سولفونامید ، تری منوپریم و تتراسایکلین ها را تحت تاثیر قرار دهد .
رشد اکثر عوامل بیماری زای کم نیاز را به طور مطلوب تامین می کند
PH
PH محیط مولر هینتون آگار را برای هر نوبت ساخت باید کنترل نمود ، PH محیط
آگار پس از ژله شدن در دمای اتاق ، باید در حد7/4-7/2باشد
PH را از طریق یکی از موارد زیر کنترل نمائید .
روش اول روش خیساندن
تمام مولر هینتون آگار یک پتری را ظرف کوچک کاملاً له کنید آب مقطر ( 3 -2 )
میلی لیتر اضافه گردد و به مدت ده دقیقه بخسیانید سپس نوک الکترود ph متر را در این مخلوط غوطه ور کنید .
روش دوم : نوک الکترود ph متر را در داخل ارلن کوچکی قرار دهید مقدار
اندکی از آگار مذاب را به داخل ارلن ریخته پس از سفت شدن آگار ph را اندازه گیری نمائید .
روش سوم : از الکترودهای سطحی استفاده نمائید .
2 رطوبت
در صورت خیس بودن سطح آگار در زمان مصرف ، ظرف پتری را با روپوش نیمه باز به مدت 30 -10 دقیقه درگرمخانه 35درجه
و یا زیر هود کلاس دو دردمای اتاق قرار دهید
تا رطوبت اضافی آن تبخیر گردد تلقیح باکتری ، سطح محیط کشت باید مرطوب ولی فاقد قطرات آب روی آگار یا درپوش ظرف پتری باشد .
3 اثرات تایمیدین یا تایمین
وجود مقادیر زیاد تایمین و تایمیدین در محیط مولر هینتون آگار می تواند اثرات مهار کنندگی سولفونامیدها و تری متوپریم را معکوس نماید ، منجر به کاهش ، عدم وضوح یا از بین رفتن هاله عدم رشد و گزارش مقاومت به صورت کاذب گردد . برای ارزیابی کیفیت هر بسته از محیط مولر هینتون آگار باید از انتروکوکوس فکالیس ATCC33186 , Atcc29212 و دیسک های تری متوپریم – سولفامتوکسازول استفاده نمود هاله عدم رشد 20mm با حاشیه واضح ، نشانگر کیفیت مناسب محیط است قطر هاله عدم رشد 20mm عدم وجود هاله و یا رشد کلنی ها در داخل هاله عدم رشد ، بر کیفیت نامناسب محیط مورد نظر دلالت دارد .
محیط های جامد
مولر ، هینتون آگار
تهیه محیط مولر هینتون آگار شامل مراحل زیر است
محیط مولر هینتون آگار از محیط پایه تجاری و بر اساس دستورالعمل تولید کننده تهیه نمائید .
بلافاصله بعداز اتو کلاو محیط را در بن ماری 50 – 45 درجه سانتیگراد خنک نمائید .
محیط تازه تهیه شده خنک رادر ظروف پتری ، با کف صاف و جنس شیشه
ای یا پلاستیکی بر یک سطح صاف ( تراز ) قرار دهید تا عمق یک نواخت به
میزان 4 میلیمتر ایجاد گردد .
این میزان معادل 70 – 60 میلی لیتر محیط برای ظروف پتری با قطر 150 میلی متر و 30 – 25 میلی لیتر برای ظروف پتری با قطر100 میلی متر می باشد
تهیه محیط های کشت و محلول ها
ظروف پتری حاوی محیط جامد در دمای اتاق خنک تر شود و جز مواردی که در همان روز مصرف خواهند شد بقیه را در یخچال ( 8 – 2 ) سانتیگراد نگهداری کنید .
ظروف پتری را طی 7 روز بعداز تهیه استفاده کنید در غیر اینصورت برای آن که خشک شدن آگار به حداقل برسد ، اقدامات پیشگیرانه کافی ، تاثیر قراردادن ظروف پتری در کیسه های پلاستیکی را انجام دهید .
برای ارزیابی عدم آلودگی لازم است یک نمونه از هر سری ساخت ظروف پتری در دمای 2 ± 35 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت یا بیشتر گرم خانه گذاری شود .
PH محیط تهیه شده از هر سری ساخت جدید را ارزیابی کنید روش مناسب مورد استفاده عمدتاً به نوع PH متر موجود در آزمایشگاه بستگی دارد . PH محیط آگار باید در دمای اتاق بین 7/4 – 7/2 باشد . بنابر این باید بعداز بسته شدن آگار اندازه گیری شود اگر PH محیط کمتر از 7/2 باشد برخی داروها توان خود را از دست خواهند داد ( مانند آمینو گلیکوزید ها و ماکرولیدها ) در حالی که برخی دیگر فعالیت زیادتری نشان خواهند داد . ( مانند تتراسایکلین ها ) اگر PH بیشتر از 7/4 باشد ممکن است تاثیرات معکوس ظاهر شود.
شرایط انجام آزمایش تعیین حساسیت ضد میکروبی به روش انتشار از دیسک برای ارگانیسم های پرنیاز
با تشکر و خسته نباشید