کنترل کیفی در میکروب شناسی
سه مرحله از فعالیت هایی که نتایج روشهای آزمایشگاهی را تحت تاثیر قرار می دهند
نکات مورد توجه در هنگام دریافت نمونه
آیا نمونه معرفی کننده شرایط عفونت میباشد
آیا در ظرف مناسبی جمع آوری شده است
آیا از ورود فلور نرمال جلوگیری شده است
آیا نمونه در زمان مناسبی گرفته شده و در محیط ترانسپورت قرار داده شد
یک نمونه غیر قابل قبول دارای خصوصیات زیر است
1-نمونه فاقد مشخصات است.
2-قسمت خارجی ظرف نمونه آلوده میباشد.
3- نمونه در ظرف نامناسبی قرار دارد.
4- فاصله زیادی بین زمان نمونه برداری و تحویل آن به آزمایشگاه وجود دارد.
5-میزان نمونه کافی نیست.
میزان قابل قبول در ارزیابی موارد ذکر شده بصورت زیر می باشد
1) 5 درصد ویا کمتر از کشتهای خون باید فقط شامل یک نمونه باشد.
2) 3 درصد ویا کمتر از کشت های خون می تواند حاوی فلور نرمال پوست باشد
3) 10 درصد ویاکمتراز نمونه های ادرار باید دارای کلنی کانت در رنج (2^10- 4^10) بعنوان اندیکاتور آلودگی داشته باشند.
4) بیشتر از 3 کشت خون در یک دوره 24 ساعته بیش از سه نمونه مدفوع برای آزمایش انگل ویا نمونه گیری مجدد از هر نوع نمونه برای کشت نباید شامل بیش از 2% همه موارد باشد .
5) حجم خون کمتر از میزان استاندارد در 5% بطری های کشت خون وجود داشته باشد .
امکانات و تسهیلات مورد توجه در آزمایشگاه
1- تهویه و درجه حرارت و رطوبت
2- روشنایی
3- فضای آزمایشگاه
4- وسایل :
ترازو
PH متر
انکوباتور CO2
دما سنج
فریزر
هود
وسایل شیشیه ای
پلاستیکی
کالیبراسیون میزان الحراره
Thermometer calibration
نحوه نگه داری: قرار دادن در گلیسرول
نحوه کنترل بر اساس دستور العمل NBS (NIST)
2 تا 8 درجه سانتی گراد، 20- درجه سانتی گراد، 37 درجه سانتی گراد، 56 درجه سانتی گراد
معیار غیرقابل قبول: اختلاف 1 درجه سانتی گراد ≤
نحوه کالیبر کردن:
1 – قرار دادن ترمومتر استاندارد و سایر ترمومترها در یخ
2 – مقایسه قرائت عدد صفر ترمومتر استاندارد با سایر ترمومترها
3 – انجام این روش برای درجه حرارت های 37 و 56 درجه سانتی گراد
4 – ثبت درجه حرارت بر روی کاغذ لگاریتمی
کنترل کیفی وسایل
ادامه جدول – کنترل کیفی وسایل
کنترل کیفی محیط کشت
الف – قبل از ساخت
تاریخ مصرف محیط کشت
ثبت زمان دریافت و کارخانه سازنده
تاریخ استفاده
بررسی ظاهر محیط
نگه داری محیط در حرارت مساوی یا کمتر از 25 درجه سانتی گراد
ب – هنگام ساخت
ترازوی دقیق
نکات نوشته شده بر روی قوطی
عدم مخلوط کردن محیط های جدید و قدیم
آب کشی ارلن و سایر ظروف با آب مقطر
استفاده از ارلن با ظرفیت بیشتر از نصف حجم محیط
عدم حرارت دهی زیاد
بررسی پلیت ها
کنترل کیفی محیط کشت
ج – بعد از ساخت و هنگام مصرف
کنترل pH
استریل بودن محیط
امکان رشد میکروارگانیسم مورد نظر
ایجاد ویژگی مورد نظر
عدم وجود شیار در محیط
ارتفاع مناسب محیط
عدم انجماد محیط
آلودگی
کنترل کیفی محیط از نظر رشد باکتری مورد نظر(مغذ ی بودن )
تهیه سوسپانسیون از رشد تازه باکتری در سرم فیزیولوژی استریل
مقایسه کدورت با استاندارد کدورت 5/0 مک فارلند
تهیه رقت 1/100از سوسپانسیون و برداشت 10میکرو لیتر و کشت بر روی پلیت و شمارش کلنی
نتایج مورد انتظار: رشد مناسب باکتری104× 2-1
کنترل کیفی محیط از نظر خصوصیات ممانعت کنندگی
تهیه سوسپانسیون باکتری در سرم فیزیولوژی
تهیه رقت 1/10 و کشت 0/01میلی لیتر بر روی پلیت
نتایج مورد انتظار: ممانعت از رشد باکتری مورد نظر 105× 2-1
کنترل کیفی محیط های ساخته شده در لوله آزمایش
0/01 میلی لیتر از سوسپانسیون باکتری در هر لوله کشت شود.
نتایج مورد انتظار: مشاهده واکنش منفی و یا مثبت با باکتری های مورد نظر
کنترل کیفی محیط های کشت با هر محیط جدید انجام می شود.
نحوه نگه داری محیط های کشت پس از ساخت
نگه داری در یخچال 8-2 درجه سانتی گراد
محیط تایوگلیکولات براث در دمای محیط
پلیت ها در صورت نگه داری در کیسه های پلاستیک تا 4 هفته قابل مصرف هستند.
لوله های در پنبه ای تا 3 هفته (قطر پنبه زیاد باشد)
لوله های در پیچ دار تا 3 ماه
رطوبت Moisture
در صورت خیس بودن سطح آگار در زمان مصرف، ظرف پتری را به مدت 30- 10 دقیقه در انکوباتورc °35 و یا با درپوش نیمه باز، زیر هود کلاس IIدر حرارت اتاق قرار دهید تا رطوبت اضافی آن تبخیر گردد. برای تلقیح باکتری، سطح محیط کشت باید مرطوب ولی فاقد قطرات آب بر روی آگار یا درپوش ظرف پتری باشد.
دیسک های ضدمیکروبی Antimicrobial Disks
ذخیره سازی دیسک های ضدمیکروبی (Storage of Antimicrobial Disks)
جهت نگهداری دیسک ها توجه به شرایط زیر ضروری است:
دیسک ها را تا زمان انقضاء باید در یخچال (دمای 8 درجه سانتی گراد یا کمتر) یا در فریزر (14- درجه سانتی گراد یا کمتر) نگهداری کنید. دیسک ها نباید در فریزرهایی با قابلیت ذوب یخ خود به خودی، نگهداری گردند. بسته های باز نشده دیسک های کلاس بتالاکتام باید در فریزر نگهداری شوند و به مقدار کم و مصرف حداکثر یک هفته، از فریزر درآورده شوند و در یخچال نگهداری گردند. بعضی آنتی بیوتیک های حساس (مانند ایمی پنم، سفاکلر (cefaclor) و ترکیبات حاوی کلاولانیک اسید) در صورت نگهداری در فریزر تا زمان مصرف، از پایداری بیشتری برخوردار خواهند بود.
بسته های باز نشده حاوی دیسک را 2-1 ساعت قبل از مصرف، از یخچال یا فریزر خارج کنید تا به دمای اتاق برسد. این کار تماس هوای گرم با دیسک یخ زده و متعاقبا" تغلیظ دارو در سطح دیسک را به حداقل می رساند.
پلیت را بر روی درپوش آن برگردانده، ظرف مدت 15 دقیقه از دیسک گذاری به انکوباتور co 2 ± 35 منتقل نمایید. دمای انکوباسیون بالاتر ازc o 35 ممکن است مانع از رشد استافیلوکک های مقاوم به متی سیلین گردد. به استثنای گونه هموفیلوس، نیسریا مننژیتیدیس و استرپتوکک ها از قرار دادن پلیت حاوی دیسک در انکوباتور CO2 دار خودداری نمایید، چون CO2 قطر هاله عدم رشد برخی دارو ها را به طور مشخصی تغییر می دهد
کنترل کیفی محیط های کشت معمول با باکتری مورد نظر و نتایج مورد انتظار
کنترل کیفی محیط های کشت معمول با باکتری مورد نظر و نتایج مورد انتظار
کنترل کیفی محیط های کشت معمول با باکتری مورد نظر و نتایج مورد انتظار
کنترل کیفی محیط های کشت معمول با باکتری مورد نظر و نتایج مورد انتظار
1. کهنه بودن لوگل
علتهای 2. داغ بودن لوپ
خطا در 3. کشت کهنه
لام گرم 4. اثر آنتی بیوتیک
5. ضخیم بودن لام
6. افزایش زمان فیکساسیون و نقش الکل در منافذ پپتیدوگلیکان
7. کافی نبودن زمان رنگ بر
کنترل کیفی رنگ ها و معرف ها
کنترل کیفی رنگ ها و معرف ها
نحوه نگهداری باکتری ها
الف – طولانی مدت
1 – استفاده از گلیسرول در 20- درجه سانتی گراد
از کشت خالص باکتری سوسپانسیونی در گلیسرول استریل تهیه شده و به میزان 2-1 میلی لیتر در لوله های کوچک در پیچ دار تقسیم می شود و در 20- درجه سانتی گراد نگه داری می گردد. تجدید کشت بعد از 18-12 ماه صورت می گیرد.
2 – استفاده از روغن معدنی و نگهداری در دمای آزمایشگاه
محیط تریپتیک سوی آگار (TSA) به صورت سطح شیب دار کم در لوله تقسیم می شود. در مورد باکتری های سخت رشد، خون و یا خون حرارت داده شده اضافه می شود. پس از کشت بر روی سطح محیط و رشد باکتری، روغن معدنی و یا پارافین که در170 درجه سانتی گراد به مدت یک ساعت استریل شده به ارتفاع یک سانتی متر به سطح محیط اضافه می شود. تجدید کشت بعد از 12-6 ماه انجام می گیرد. (کشت در دمای آزمایشگاه نگهداری می شود).
3 – کشت عمقی و نگه داری در دمای آزمایشگاه
جهت استافیلوکک و انتروباکتریاسه
نوع محیط TSA
نحوه کشت عمقی بدون سطح شیب دار (کشت مجدد بعد از یک سال)
4 – کشت عمقی در محیط CTA
نگهداری نایسریا و استروپتوکک
محیط به صورت عمقی در لوله در پیچ دار
نگهداری نایسریا در 35 درجه سانتی گراد
تجدید کشت هر دو هفته یک بار
استرپتوکک در دمای اتاق هر ماه تجدید کشت شود
محیط Cooked meat broth
برای بی هوازی ها
نگهداری در دمای آزمایشگاه
تجدید کشت هر دو ماه یک بار
ب – روش نگهداری کوتاه مدت
1 – کاربرد جهت باکتریهای روتین آزمایشگاه (باکتری های سریع الرشد)
نوع محیط TSA با سطح شیبدار
نگهداری در یخچال
تجدید کشت هر دو هفته یک بار
2 – استرپتکوکک ها
نوع محیط بلادآگار در لوله با سطح شیب دار
پس از رشد باکتری نگهداری در یخچال
تجدید کشت هر دو هفته یک بار
3 – نایسریا مینجاتیدیس و هموفیلوس
نوع محیط شکلات آگار
تجدید کشت کمتر از یک هفته
نگهداری در دمای آزمایشگاه
4 – نایسریا گونوره
نوع محیط شکلات آگار
نگهداری در دمای 35 درجه سانتی گراد
زمان تجدید کشت هر دو روز یک بار
Rapid Catalase Test for Enterobacteriaceae
1-Touch the center of well-isolated young colony (18-24 hrs.) on SBA or MacConkey with a wooden stick to transfer to a clean ,dry glass slide.
Dose not test from Muller-Hinton Agar (MHA)
Place 1 drop of 3% H2O2 and observe immediately bubbles
Citrate Utilization Test Simmons
Streak slant back & forth with light inoculum picked from the center of a well-isolated colony
Place cap loosely on tube , aerobic environment
Incubation at 35°C to 37°C for up to 4-7 days
Positive : growth + blue
Negative : No growth + green
Citrate Utilization Test Simmons
Streak slant back & forth with light inoculum picked from the center of a well-isolated colony
Place cap loosely on tube , aerobic environment
Incubation at 35°C to 37°C for up to 4-7 days
Positive : growth + blue
Negative : No growth + green
Citrate Utilization Test Simmons
Agar Slant
Bromthymol blue
pH 6.8 green (negative) to blue pH > 7.6 (positive)
Inspect agar for evidance of freezing ,cracks , dehydration , bubbles ,before use and discard any tube that Blue
Citrate Utilization Test Simmons
Do not inoculate from broth cultures , due to carryover of media
To avoid false-positive reactions , use a light inoculum to prevent carry over of substance from previous media
Luxuriant growth without color change may indicated a positive test. if agar dose not turn blue on further incubation ,test should be repeated with less inoculum
روش کار :
باکتری را در روی سطح شیب دار محیط کشت دهید ودرب لوله را محکم نبندید.
لوله را در 35 درجه سانتی گراد بمدت
24 ساعت تا 4 روز انکوبه کنید.
سیترات مثبت
سیترات منفی
Spot Indol Test
Colonies from SBA & rub on filter paper
Tryptophanase breaks down tryptophan to realease indole
1% paradimethylaminocinnamaldehyde
Blue color within 30 sec
IMViC MR VP
Incubate for minimum 48 hrs
If results are equivocal at 48 hrs repeat test for 4 to 5 days
MR : 5 to 6 drop of MR reagent per 5 ml broth
VP : 6 drop alpha naphtol & 2 drop KOH
روش کار
الف) در 5 میلی لیتر محیط MR-VP کشت دهید وبمدت 48 ساعت در 35 درجه سانتی گراد انکوبه کنید.
ب) 5/2 میلی لیتر آن را به لوله باریک منتقل کنید.
ج) 5 قطره از معرف متیل رد را به آن اضافه کنید
.واکنش مثبت با رنگ قرمز
واکنش منفی با رنگ زرد مایل به نارنجی
Lysine Iron Agar (LIA)
Presumptive report: Gram-Positive Cocci resembling Staphylococci
Serotyping / Serogrouping
Typing Should be performed from a non-sugar containing medium ,such as 5% sheep blood agar (BAP) or LIA
Use of sugar containing media , such as MacConkey or TSI agars , can cause the organism to autoagglutinate
روش کار: – با استفاده از یک آنس از مرکز یک کلنی ایزوله برداشت کنید.
نوک آنس را درداخل قسمت پائین لوله وارد کنید
و بعد در سطح شیب دار کشت دهید.
درب لوله را محکم نبندید.
در35 درجه بمدت 18تا 24ساعت انکوبه کنید.
نکات قابل توجه در مورد ساخت محیط
محیط XLD باید قرمز روشن باشد. اگر محیط موقع ساختن زیاد حرارت ببیند، سبب رسوب سدیم دزاکسی کولات می گردد که باعث می شود کلنی ها کوچکتر، تیره تر ظاهر شوند.