پاورپوینت کروماتوگرافی تعویض یونی

1

دانشگاه آزاد اسلامی واحد امیدیه عنوان:
کروماتوگرافی تعویض یونی   استاد:
جناب آقای دکتر *** تهیه کننده:
***
  بهار 1395
2

عناوین مطالب
مقدمه
انواع کروماتوگرافی
هدف کروماتوگرافی
روشهای کروماتوگرافی
روشهای کروماتوگرافی
کروماتوگرافی تبادل یونی
کروماتوگرافی به روش تعویض یون
انواع کروماتوگرافی تعویض یونی با توجه به مکانیزم عمل
طبقه بندی رزین ها
رزین تبادل کاتیون با خاصیت جذب بالا
رزین تبادل کاتیون با خاصیت جذب پایین
برخی از کاربردهای رزین ها

3
ویژگی های روش تعویض یونی
خواص رزین ها
مزیت اساسی کروماتوگرافی تبادل یونی
تغلیظ نمونه در فرایند تخلیص توسط کروماتوگرافی تعویض یونی
جداسازی توسط کروماتوگرافی تعویض یونی
تقسیم بندی روش کروماتوگرافی تعویض یونی براساس استراتژی مرحله جذب
کروماتوگرافی مثبت
 کروماتوگرافی منفی
منابع

کروماتوگرافی روش جزء به جزء کردن یک مخلوط براساس قطبیت مولکول ها می باشد.کروماتوگرافی شامل یک فاز متحرک(مخلوط) می باشد که می خواهیم جداسازی نماییم واین مخلوط دریک مایع ویا گاز حل شده است و ازروی یک فاز ساکن عبور می نماید اجسام موجود در مخلوط به علت قطبیت متفاوت با سرعت های مختلف ازروی فازساکن می گذرند .
سرعت حرکت هر جزء درمخلوط به چند عامل قطبیت بستگی دارد که مهمترین آنها یک جسم قطبی هم به حلال وهم به فازساکن جاذبه دارد جسمی که کندتر حرکت می کند بیشترین جاذبه را نسبت به فاز ساکن دارد.

4

کروماتوگرافی انواع گوناگون دارد ازجمله :

کروماتوگرافی ستونی
کروماتوگرافی یونی
کروماتوگرافی کاغذی
کروماتوگرافی گازی
کروماتوگرافی لایه نازک
5

هدف کروماتوگرافی:
هدف تجزیه ای: اندازه گیری اجزای شیمیایی نمونه

هدف آماده سازی: خالص سازی وجمع آوری یکی از نمونه ها
6

روشهای کروماتوگرافی
دسته ای از روشهای جداسازی هستند که برای جداسازی اجزای نمونه بکار می روند.در این روشها نمونه بین دو فاز مختلف توزیع می شد و در اثر رقابتی که بین فازها برای نمونه وجود دارد عمل جداسازی صورت میگیرد. نمونه معمولا روی فاز ساکن قرار میگیرد و فاز متحرک از روی فاز ساکن حرکت کرده می خواهد نمونه را با خود ببرد اما فاز ساکن نمی گذارد. رقابت بوجود امده مبنای جداسازیست
فاز ساکن می تواند جامد یا مایع و فاز متحرک می تواند گاز یا مایع باشد فاز ساکن در حالت جامد باید دارای سطح وسیع باشد. در حالت مایع انرا بر سطح یک جامد بی اثر پوشش می دهند
مکانیسم کروماتوگرافی را فاز ساکن تعیین می کند.اگر فاز ساکن جامد باشد مکانیسم جذب سطحی است و اگر مایع باشد مکانیسم تفکیکی است
7

کروماتوگرافی تبادل یونی
کروماتوگرافی تبادل یونی ، روشی است که در آن ، یون ها بین یک محلول و یک فاز جامد ( رزین ) مبادله می شوند. این تبادل ، برگشت پذیر است. فاز جامد در آب ، غیر محلول بوده و دارای بنیان های اسیدی و بازی باشد. نوع معدنی این مواد جامد ، ممکن است شبیه زئولیت ها باشند و نوع جدید آنها از مشتقات هستند و برای جداسازی فلزات قلیایی خاکی بکار می روند. رزین های تبادل یونی ، منشا آلی دارند و از پلیمرهای با وزن مولکولی بالا ساخته می شوند.
تشکیل این رزین ها بر اساس پلیمریزاسیون پلی استیرن و وینیل بنزن استوار است. رزین ها به دو نوع تعویض کننده آنیونی و کاتیونی تقسیم می شوند. هر کدام از این تعویض کننده ها به نوع بازی ضعیف و قوی و اسیدی ضعیف و قوی تقسیم می شوند
8

Ion Exchange Chromatography

یکی از متداولترین روشهای کروماتوگرافی در فرایند تخلیص بیومولکولها به طور عام و پروتئینها بطور خاص روش کروماتوگرافی تعویض یونی است. باتوجه به اینکه در این روش از خاصیت عام پروتئین ها یعنی توانایی ایجاد جاذبه یونی با یک ماده جاذب باردار با بار مخالف برای جداسازی پروتئین مورد نظر از سایر  ناخالصی ها استفاده می شود.
کروماتوگرافی به روش تعویض یون
9

اغراق آمیز نیست اگر این روش را قابل اِعمال در مورد فرایند جداسازی تمامی پروتئین ها بدانیم  تنها مسئله ای که شاید باعث شود روش های دیگر بر این روش در یک فرایند تخلیص خاص ترجیح داده شوند، به مورد خاص آن فرایند و در مورد نیازهای آن از قبیل میزان خلوص مورد نیاز، زمان و بطور کلی مسئله  بهینه سازی اقتصادی فرایند مربوط می شود. به هرحال این روش به عنوان یک روش شناخته شده در مورد تخلیص پروتئین ها می باشد
10

انواع کروماتوگرافی تعویض یونی با توجه به مکانیزم عمل

در تمام روشهای کروماتوگرافی برای جداسازی یک پروتئین خاص، دو فاز ناهمگون وجود دارد: فاز جامد و فاز محلول. فاز جامد همان رزین کروماتوگرافی است و خواص ویژه خود را برای جداسازی ذره مورد نظر در فاز محلول دارد. در روش کروماتوگرافی تعویض یونی فاز جامد از دو قسمت تشکیل شده است: یکی شبکه جامد (عمدتا" پلیمری یا کوپلیمری) که به عنوان تثبیت کننده عمل می کند
11

و دیگری گروه عاملی است که وظیفه اصلی جذب یونی را بر روی ذرات باردار موجود در محلول انجام داده و خود بر روی شبکه جامد قبلا" تثبیت شده است. ساختار شبکه جامد خواصی از قبیل پایداری فیزیکی و شیمیایی رزین و میزان نفوذ پذیری ذرات برای دستیابی به گروههای عاملی را در سطح واقعی رزین تعیین می کند. از طرفی دیگر در تکنولوژی ساخت این شبکه های جامد, اندازه یا بزرگی قطعه های پلیمری وتخلخلهای آنها کنترل و تعیین می شود که در فاکتورهایی نظیر هزینه عملیاتی، میزان دبی جریان و فشار مقاوم تاثیر اصلی و اساسی دارند.
12

جداسازی اسید آمینه ها
دارای بار الکتریکی متفاوتندR اسید آمینه ها بسته به شاخه های جانبی، که این اساس جداسازی آنها در کروماتوگرافی تعویض یونی است. اسید آمین های نوع اول (شامل اسید آمینه های اسیدی، اسید آمینه های قلیائی و اسید آمینه های سنتتیک) که دارای آمین نوع اول هستند با نین هیدرین واکنش می دهند و رنگ ارغوانی تولیدمی کنند. اما ایمینو اسید ها شامل پرولین و هیدروکسی پرولین با داشتن حلقه پرولیدین آمین نوع دوم می باشند و با نین هیدرین واکنش رنگی متفاوت ایجاد و رنگ زرد تولید می کنند. در کروماتوگرافی تعویض یونی از سیستم تعویض کاتیون استفاه می شود

13

دونوع سیستم بافری در کروماتوگرافی تعویض یونی وجود دارد و استفاده می شود:
1.سدیم سیترات برای پروتئین های هیدرولیز شده (معمولا" دارای
20 اسید آمینه
2.لیتیم سیترات برای نمونه های فیزیولوژیکال مایع که معمولا" دارای (50-40) اسید آمینه هستند.
اسید آمینه های جداسازی شده با کروماتوگرافی تعویض یونی جهت ردیابی فلورسانس نیز مورد استفاده قرار می گیرد
14

طبقه بندی رزین ها
رزین ها بر حسب گروه عامل تعویض متصل به پایه پلیمریرزین به چهار :دسته تقسیم می شوند
رزین های کاتیونی قوی SAC ( Strong acidic Cation )
رزین های کاتیونی ضعیف WAC ( Weak acidic Cation)
رزین های آنیونی قوی SBA ( Strong basic anion )
رزین های آنیونی ضعیف( WBA ( Weak basic anion)
15

رزین تبادل کاتیون با خاصیت جذب بالا
Strong Cation Exchanger Resin))
در این نوع رزین یون تثبیت شده بر روی پایه جامد دارای بار منفی و یون متحرک دارای بار مثبت است. لذا در شرایطی که پروتئین در داخل محلول دارای بار مثبت باشد (یعنی pH محلول کمتر از نقطه ایزوالکتریک پروتئین باشد)، پروتئین  می تواند  براساس  میزان اختلاف نقطه pI و pH  محلول باشدت های متفاوتی جذب رزین شود. بدیهی است هرچه این اختلاف بیشتر باشد، میزان جذب پروتئین به یون تثبیت شده نیز بیشتر خواهد بود
16

رزین تبادل کاتیون با خاصیت جذب پائین
Weak Cation Exchanger Resin) )
مکانیزم تبادل در این نوع رزین عینا" شبیه رزین تبادل کاتیون با خاصیت جذب بالا است، تنها با این تفاوت که به دلیل ساختار شیمیایی یون تثبیت شده بر روی پایه جامد, دارای بار منفی ضعیف تری بوده و متعاقبا" قدرت جذب آن نسبت به یون متحرک یا پروتئین دارای بار مثبت ضعیف تر است.
17

رزین تبادل آنیون با خاصیت جذب بالا
Strong Anion Exchanger Resin))
همانطور که از نام این نوع رزین پیداست، در این رزین یون تثبیت شده بر روی شبکه جامد دارای بار مثبت و یون متحرک پروتئین باید دارای بار منفی باشد.
18

رزین تبادل آینون با خاصیت جذب پائینی
)weak Anion Exchanger Resm)
تفاوت این رزین با رزین تبادل آینون با خاصیت جذب بالا بازهم در قدرت جذب گروه عاملی نسبت به یون متحرک یا پروتئین دارای بار منفی است.
19

مزیت رزین های کاتیونی ضعیف بازدهی بالای آنها در مقایسه با رزینهای کاتیونی قوی می باشد، در نتیجه باعث تولیدپساب کمتر در احیا مکرر می گردد. اصولا زمانی که هدف جداسازی کلیه کاتیونهای آب است بکارگیری توام رزین کاتیونی قوی و ضعیف اقتصادی تر از بکارگیری رزینهای کاتیونی قوی می باشد.
20

رزین های آنیونی ضعیف مقاومتر از رزینهای آنیونی قوی بوده و به همین جهت در سیستم های تصفیه آب ،رزین های آنیونی قوی در پایین دست رزینهای آنیونی ضعیف قرار می گیرند
رزین های آنیونی قوی قادر به جذب کلیه آنیونهای موجود در آب بوده ولی رزین های آنیونی قادر به جذب آنیون اسیدهای قوی نظیراسیدسولفوریک،کلریدریک ونیتریک می باشد.
21

برخی از کاربردهای رزین ها
رزین های کاتیونی سدیمی نه تنها کاتیون های سختی آور آب بلکه همه یون های فلزی را باسدیم تعویض می کنند. برای احیا این نوع رزین های کافی است که رزین را با آب نمک شست و شودهیم تا رزین به فرم اولیه خود برگردد.
با رزین های کاتیونی چه نوع هیدروژنی و چه نوع سدیمی می توان آهن ومنگنز را چون بقیه کاتیونها حذف کرد اما به علت امکان آلوده شدن رزین ها معمولا مشکلاتی داشته و باید نکاتی را رعایت کرد. اولا باید دقت کرد که قبل از حذف یون آهن توسط رزین هیچ هوایی با آب در تماس قرار نگیرد چون در اثر مجاورت با هوا ، آهن و منگنزمحلول در اب اکسیده شده غیر محلول در می آیند و در نتیجه روی ذرات رزین رسوب کرده وباعث آلوده شدن رزین می گردد
22

با استفاده از رزین های تبادل یونی می توان لیزین را که جز اسیدآمینه ضروری مورد نیاز رژیم غذایی خوکها ، ماکیان و سایر گونه های حیوانی می باشد ، را تخلیص کرد. دلیل اهمیت تخلیص این اسید آمینه ، نزدیکتر شدن رژیم غذایی حیوانات به نیازمندیهای آنها در مصرف مواد خام و … است با توجه به اینکه مقدار لیزین در دانه ها ، بخصوص غلات ناچیز می باشد
23

ویژگی های روش تعویض یونی:
کروماتوگرافی به روش تعویض یونی یکی از کاربردی ترین تکنیکهایی است که به دلیل عدم محدودیت در برابر حجم نمونه اولیه جهت انجام کروماتوگرافی و بالابودن ظرفیت کاری رزین برای جذب بصورت وسیع استفاده شده و در مقیاسهای تولیدی و Large scale  بسیار کارآیی دارد. از طرف دیگر زمان انجام کروماتوگرافی در این روش آنچنان محدود کننده نیست و می توان درصورت رعایت پایداری رزین و میزان فشار مقاوم در حین کروماتوگرافی با استفاده از دبی بالا مقدار زیادی از نمونه را در زمانی کم تخلیص کرد.
24

علاوه بر ویژگی های فوق امکان استفاده از روش کروماتوگرافی تعویض یونی برای جداسازی و حذف یکسری از ناخالصی های عمده به ویژه اسیدهای نوکلئیک Nucleic Acids) و اندوتوکسین Endotoxin)، از شناخته ترین خصوصیات این روش می باشد که استفاده از آن را در اکثر فرایندهای تخلیص امکان پذیر کرده است
25

خواص رزین ها

1.باید دارای گروه های مبادله کننده تک عاملی باشد. برای رزین های جدید هیچ مشکلی در این مورد وجود ندارد ولی محصولات اولیه که از فنل ساخته می شدند چند عاملی بودند و خواص تبادل آنها بستگی به PH محلولی که در آن قرار می گرفتند، داشت. از این نقطه نظر این رزین ها برای کروماتوگرافی مناسب نبودند.
* 2.باید درجه اتصالات عرضی کنترل شده داشته باشد. 4 – 8 % بهترین درجه برای کروماتوگرافی است.
* گستره اندازه ذرات باید تا آنجایی که ممکن است کوچک باشد.3
* اندازه ذرات باید، تا آنجایی که عملی است کوچک باشد.4
26

مزیت اساسی کروماتوگرافی تبادل یونی

در کروماتوگرافی ، محلول های بکار رفته اکثرا رقیق هستند و در نتیجه روش شستشو بیشتر به کار می رود و اغلب جداسازی های بسیار رضایت بخشی به دست می آید. در مورد رزین ها تجزیه جانشینی و تجزیه مرحله ای و شستشوی تدریجی همگی به کار می روند. ولی از تجزیه جبهه ای استفاده نمی شود. روش دیگر شستشو ، تحت عنوان گزینش پذیری ، نیز کارآیی مفیدی دارد. این روش به تغییر فعالیت یون هایی بستگی دارد که باید بوسیله عامل شوینده ای که با یون ها تشکیل کمپلکس می دهد جدا شوند
27

تشکیل کمپکس بدون شک عامل مهمی در سایر روش های کروماتوگرافی ، مخصوصا در جداسازی های معدنی روی کاغذ است، ولی در هیچ یک از سایر روش ها این موضوع به همان وسعت که در کروماتوگرافی تبادل یونی استفاده شده، مطالعه نشده است. یکی از قدیمیترین و جالب ترین موفقیت ها در کروماتوگرافی تبادل یونی جداسازی مواد لانتایندها در یک رزین اسید قوی و با استفاده از یک محلول سیترات تامپونی برای شستشو است
28

هدف و انگیزه استفاده از کروماتوگرافی
تعویض یونی در فرایند تخلیص

استفاده از کروماتوگرافی به روش تعویض یونی عمدتا" در دو جهت صورت می گیرد:
تغلیظ نمونه
جداسازی
29

تغلیظ نمونه در فرایند تخلیص توسط کروماتوگرافی تعویض یونی:

برای این منظورمعمولا" از کروماتوگرافی تعویض یونی در ابتدای پروسه تخلیص استفاده شده و نقش بسیار موثری را در کاهش حجم نمونه بیولوژیک ایفا می کند. این مرحله به عنوان یک  مرحله مقدماتی و آماده سازی عمل کرده و در اینجا رسیدن به خلوص بالا موردنظر نیست و هدف کاهش حجم نمونه و جداسازی نسبی نمونه  موردنظر  از   ناخالصی های دیگر است. به همین دلیل در این حالت معمولا" کروماتوگرافی به روش  تعویض یونی در واقع مرحله Capturing را انجام می دهد. آنچه که مهم است استفاده از رزین های کروماتوگرافی تعویض یونی با اندازه و پایداری مناسب برای انجام چنین هدفی است
30

جداسازی توسط کروماتوگرافی تعویض یونی:
باتوجه به قدرت بالای روش کروماتوگرافی تعویض یونی برای جداسازی محصول موردنظر از ناخالصی های دیگر، می توان از این روش استفاده نمود و با اعمال یک برنامه جداسازی براساس افزایش میزان نمک و افزایش قدرت یونی، محصول مورد نظر را براحتی جداسازی و تخلیص نمود.از این روش می توان به عنوان مرحله نهایی یا مرحله ای بینابینی در کنار روشهای دیگر کروماتوگرافی عمل جداسازی و تخلیص را با هدف رسیدن درجه خلوص بالا استفاده کرد. در مواردی قدرت تفکیک  این روش  آنچنان   بالاست که می تواند به عنوان یک فرایند تخلیص با بکارگیری تنها یک روش کروماتوگرافی انجام پذیرد.  آنچه که در این حالت حایز اهمیت است ، از میان پارامترهای اساسی کروماتوگرافی در اینجا پارامتر درجه خلوص Purity و میزان انتخابگری Selectivity اهمیت اصلی و اساسی را دارند.
31

تقسیم بندی روش کروماتوگرافی تعویض یونی براساس استراتژی مرحله جذب

هر روش کروماتوگرافی به  استثنای  روش  فیلتراسیون  ژلی  (Gel Filtration  که یک تکنیک  کروماتوگرافی  ایزوکراتیکIsocratic بوده  و  بر اساس  پدیده های نفوذ و پارامترهای انتقال جرم انجام می گیرد)  دارای  مراحل  اساسی تعادل سازی،  اعمال نمونه یا مرحله جذب و مرحله جداسازی می باشد
32

در مرحله جذب هدف جذب نمونه موردنظر به رزین کروماتوگرافی (باتوجه به لیگاند ویژه آن) است. در مرحله جداسازی سعی می شود که نمونه موردنظر جدای از ناخالصی های دیگر از رزین یا لیگاند ویژه جدا شود

33

کروماتوگرافی به دو نوع تقیسم می شود:

کرماتوگرافی مثبت

کروماتوگرافی منفی
34

کروماتوگرافی مثبت

در این روش هدف جذب پروتئین موردنظر به رزین کروماتوگرافی در مرحله وارد کردن نمونه است که در نهایت پس از شستشوی ناخالصی ها، پروتئین مذکور با اعمال یک برنامه خارج سازی از طریق افزایش غلظت نمک یا قدرت یونی تاحد امکان خالص میشود
35

 کروماتوگرافی منفی

در این تکنیک، شرایط بافر و رزین کروماتوگرافی به نحوی انتخاب می شود که پروتئین موردنظر به رزین (لیگاند) جذب نشده و در همان مرحله اعمال نمونه و شستشوی اولیه ستون کروماتوگرافی توسط بافر متعادل کننده از ستون کروماتوگرافی خارج گردد. در این تکنیک ناخالصی ها عمدتا" به ستون چسبیده و سپس توسط یک مرحله جداسازی شدید با استفاده از غلظت بالای نمک یا قدرت یونی از ستون خارج می گردند
36

منابع

شیمی تجزیه دستگاهی اسکوگ

جزوه شیمی تجزیه پیشرفته آقای دکتر توللی

جزوه جداسازی آقای دکتری توللی

اینترنت
37

پـایـان

با تشکر از استاد ارجمند:

جناب آقای دکتر توللی

38