موضوع سیمینار:
کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا
(High Efficiency Liquid Chromatography)( (HPLC)
بسم الله الرحمن الرحیم:
1
تاریخچه کروماتوگرافی
توسعه کروماتوگرافی مایع با فشار بالا در اواسط دهه 1970 انجام شد و پیشرفت و تکامل آن مقارن شد با تکامل مواد پک شده درون ستون کروماتوگرافی و همچنین دتکتورهای اتوماتیکی که می توانستند بصورت آنلاین مقدار عبور مایع را محاسبه نمایند. کاربردهای کروماتوگرافی در اواخر دهه 1970 ، روشهای جدیدی شامل کروماتوگرافی مایع با فاز معکوس این امکان را فراهم کرد تا جداسازی ترکیبات بسیار مشابه ، عملی گردد. در دهه 1980 ، بطور رایجتری از HPLC برای جداسازی ترکیبات کیمیاوی استفاده می شده است. تکنیکهای جدید روشهای جداسازی ، شناسایی ، خالص سازی و محاسبه مقدار را متفاوت از گذشته توسعه داد. همچنین برای تسهیل در کار HPLC ، کامپیوتر و اتوماسیون به سایر روشها اضافه گردید. به مرور تکامل انواع ستونها ، تولید ستونهای بسیار باریک ، ستونهای پیوسته باعث سرعت در کار HPLC گردید. در دهه گذشته شاهد ظهور میکرو ستونها و ستونهای تخصصی شده برای HPLC بوده ایم. قطر معمول میکروستونها یا ستونهای مویی شکل ، حدود µm 3 تا µm 200 دارد. طول ستونهای HPLC سریع ، کمتر از ستونهای HPLC معمولی و برابر mm 3 است و در بخشهای بسیار کوچک در دستگاه HPLC جاسازی می گردند. هر چند که امروزه HPLC مورد توجه تحقیقات بیوتکنولوژیکی ، کیمیاوی و بیوکیمیاوی و همچنین صنایع داروسازی است اما این موارد فقط 50 درصد استفاده کنندگان HPLC را نشان میدهد
2
کروماتوگرافی مایع با فشار زیاد HPLC
می دانیم که کروماتوگرافی روشی است برای شناسائی و جدا سازی و اندازه گیری مواد. HPLC یعنی کروماتوگرافی مایع با فشار زیاد یا کروماتوگرافی مایع با کارکرد عالی است. HPLC از دو فاز ثابت و متحرک تشکیل شده است. که فاز ثابت ممکن است جامد و یا مایع باشد و فاز متحرک مایع است. HPLC بدون شک ، سریع ترین رشد را در بین تمام روش های جداسازی تجزیه ای با فروش سالیانه در گستره بیلیون دلار داشته است. دلایل این رشد انفجارآمیز عبارتند از حساسیت روش ، سازگاری سریع آن برای انجام اندازه گیری های کمی صحیح ، شایستگی آن برای جداسازی مواد گونه های غیرفرار یا ناپایدار در مقابل گرما و مهم تر از همه ، کاربرد گسترده آن برای موادی است که در صنعت ، زمینه های مختلف علوم و جامعه اهمیت درجه اول را دارند. مزیت کروماتوگرافی نسبت به ستون تقطیر این است که به آسانی می توان به آن دست یافت. با وجود اینکه ممکن است چندین روز طول بکشد تا یک ستون تقطیر به حداکثر بازده خود برسد، ولی یک جداسازی کروماتوگرافی می تواند در عرض چند دقیقه یا چند ساعت انجام گیرد.یکی دیگر از مزایای برجسته روشهای کروماتوگرافی این است که آنها آرام هستند. به این معنی که احتمال تجزیه مواد جداشونده به وسیله این روش ها در مقایسه با سایر روش ها کمتر است.مزیت دیگر روش های کروماتوگرافی این است که تنها مقدار بسیار کمی از مخلوط برای تجزیه لازم است. به این علت، روشهای تجزیه ای مربوط به جداسازی کروماتوگرافی می توانند در مقیاس میکرو و نیمه میکرو انجام گیرند.
3
انتخاب بهترین روش کروماتوگرافی
انتخاب نوع روش کروماتوگرافی بجز در موارد واضح (مانند کروماتوگرافی گازی در جداسازی گازها) عموماً تجربی است. زیرا هنوز هیچ راهی برای پیش بینی بهترین روش برای جداسازی اجسام، مگر در چند مورد ساده وجود ندارد.
در ابتدا روش های ساده تری مانند کروماتوگرافی کاغذی و لایه نازک امتحان می شوند. در صورتی که با این روشها مستقیماً قادر به جداسازی باشند، جداسازی را باید به وسیله آنها صورت داد. در غیر این صورت، از روش های پیچیده تر استفاده می شود.
کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)، وقتی که روش های ساده فاقد کارایی لازم هستند، می تواند جوابگو باشد. ولی دانشمندان دریافتند که بهترین نوع به خاطر دقیق تر بودن کروماتوگرافی ژلی است.
4
فاز ساکن و فاز متحرک
کار در مورد فاز های ساکن و متحرک یک قاعده کلی وجود دارد و آن ، این است که باید قطبیت حل شونده و فاز متحرک ، نزدیک به هم باشد، ولی با فاز ساکن اختلاف داشته باشد. ترتیب قطبیت گروه های عاملی در ترکیبات به صورت زیر است:
هیدروکربن< اترها < استرها < کتون ها < آلدئیدها < آمیدها < آمین ها < الکل ها
به عنوان مثال ، فاز ساکن با قطبیت بالا مثل سیلیکات یا آلومین یا مایعات قطبی مثل تری اتیلن گلیگول که روی ذرات سیلیکات قرار گرفته اند و فاز متحرک ، حلال نسبتا غیر قطبی مثل هگزان یا ایزو پروپیل اتر را می توان نام برد.
5
طریقه عمل ستون HPLC
کار این ستون نیز به اندازه ذرات داخل ستون بستگی دارد. هرچه اندازه ذرات کوچک تر باشد، کیفیت HPLC پیشتر می شود.
6
خصوصیات فاز متحرک ( HPLC )
خلوص بالا
نقطه جوش حدود 20 تا 50 بالاتر از دمای ستون
گرانروی پایین
واکنش پذیری کم
قابلیت تطابق با آشکارساز
سمیت و اشتعال پذیری کم
7
آشکارسازها
کار آشکارسازهای مورد استفاده در کروماتوگرافی مایع – مایع تمام خصوصیات آشکارسازهای کروماتوگرافی گازی را دارند، بجز اینکه در آشکارساز کروماتوگرافی مایع نیازی به محدوده دمایی بالا نیست. این شناساگرها کلاً دو دسته اند:
یک نوع کلی که به فاز متحرک عکس العمل نشان می دهند.
نوع خاصی که به حل شونده حساس هستند.
8
تصویری از دستگاه HPLC
9
اجزاء دستگاه:
مخازن حلال
موتور یا پمپ
اینجکتور
ستون
ردیابها
ثبات ( دتکتور )
10
مخازن حلال
که در آنها فاز متحرک و یا حلالهای شستشو دهنده ستون ریخته شده است.
11
موتور یا پمپ
. چون ستونها نسبتا طویل و اندازه ذرات کم است. به این جهت قابلیت نفوذ کم می شود و برای این که حلال جریان داشته باشد باید فشاروجود داشته باشد. برای ایجاد فشار از پمپ یا موتور استفاده می کنیم. پمپ فشاری حدود psi 4500 می تواند ایجاد کند. و باید بتواند فشار ثابت ایجاد کند. حلال توسط پمپ با فلوی ثابتی بر روی فاز ثابت حرکت داده می شود. حداکثر فلوئی که فاز متحرک می تواند داشته باشد ml/min 2.5 است. و بسته به نوع کاری که می خواهیم انجام دهیم فلو فرق می کند، هر چه فلو کمتر باشد، فاصله پیک ها بیشتر است. چهارمخزن داریم مخزنD, C, B, A میزان فشار بستگی به فلوی ما دارد وقتی فلو ml/min 0.8 است میزان فشار حدود psi 1500 می شود. میزان فشار بستگی به نوع ستون دارد حداکثر فشار مجاز Psi 3500 است. حداکثر تغییرات فشار Psi 100 است. حداکثر فلوریت Flow rate ، ml/min 2.5 است. پس پمپ، حلال را از مخزن می گیرد و با سرعت گذر ثابتی آن را بداخل دستگاه وارد می کند. در دمای آزمایشگاه به دو روش می توانیم کار کنیم:
12
الف- روش ایزوکراتیک isocratic:
اگر نسبت های مختلفی از فاز متحرک را در یک مخزن بریزیم و از همان مخزن فاز متحرک را برداشت کنیم از روش ایزوکراتیک استفاده کرده ایم. مثلا در کار عملی انجام شده درآزمایشگاه فاز متحرک( 80% بافر فسفات 12% متانول و 8% استونیتریل) است که پس از صاف کردن همه را در یک مخزن مثل D می ریزیم و از همان مخزن پمپ برداشت می کند.
13
ب – روش گرادیانت gradient :
اجزاء فاز متحرک در مخازن مختلف ریخته می شود. دستگاه قابلیت این را دارد که خودش نسبت های مختلف را از مخازن برداشت کند (طبق داده های ما)، مثلا می خواهیم ازمخزن A، 80% از مخزن B 8% و از مخزن C 12% بکشد. و بعد نسبت ها را مخلوط می کند. از این روش وقتی استفاده می کنیم که نسبت های موردنظر را نمی دانیم و بخواهیم روش کار پیدا کنیم. ولی وقتی درصد فاز متحرک برای ما روشن شد می توانیم از روش ایزوکراتیک استفاده کنیم. فاز متحرک با فلوی ثابتی بر روی ستون حرکت داده می شود حداکثر فلو در این آزمایش ml/min0.8 یا 1 است. بعد از فعال کردن هر پمپ flow rate را از کم به زیاد کم کم بالا می بریم تا حدود ml/min 0.8 یا 1 و می گذاریم حدود یک ربع ساعت یا نیم ساعت با فلوریت بالا کار کند و بعد فلوریت را به تدریج پایین می آوریم تا صفر و بعد پمپ را عوض می کنیم. یا دستگاه را خاموش می کنیم، فلوریت که بالا برود فشار هم بالا می رود. بعد از اتمام کار ستون را با حلالهای شستشو دهنده می شوئیم. حلالهای شستشو را در مخازن ریخته و پمپ ها را به ترتیب فعال می کنیم اول دستگاه را با آب و متانول شسته و سپس با متانول خالص می شوئیم. هر پمپ را که فعال کردیم باید ابتدا هوا گیری کنیم.
تهیه بافرفسفات: 13.6 گرم از Po4H2K را وزن کرده (0.1M) و به حجم یک لیتر می رسانیم pH ، 4.5 می شود که با اسید فسفریک غلیظ حدود یک دو قطره pH را به حدود 3.5 می رسانیم.
14
سیستم های پمپ کننده
15
3- injector:
از سرنگهای مختلف با ظرفیت های مختلف استفاده می کنیم. حجم تزریق 30 میکرولیتر است. نمونه ابتدا وارد قسمتی بنام گارد کالوم یا پری کالوم می شود که محافظ ستون است، طول کاردکالوم حدودم یک سانتی متر است. و جنس آن از فولاد ضد زنگ است، و ماده پرکننده آن از جنس ماده پرکننده ستون است. اگر ماده ما ناخالصی داشته باشد یا با ماده داخل ستون واکنش ایجاد کند درگاردکالوم انجام می شود و به ستون آسیبی نمی رسد.
16
4- ستون:
طول ستونهای دستگاه حدود 30-10 سانتی متر است. و جنس آن از فولاد ضدزنگ است. پرمصرف ترین ستون C18 ، ODS آکتا دسیل سیلان است، ستونها را پس از اتمام کار باید با محلولهای شستشو دهنده شست. اگر از بافرفسفات استفاده کردیم ستون را با آب و متانول و بعد با متانول خالص شستشو می دهیم. فاز ثابت بصورت ذرات ریزی در داخل ستون قرار گرفته است. که بر اثر چسبیدن و پخش شدن اجزاء نمونه و عبور فاز متحرک جداسازی انجام می شود. نمونه ابتدا وارد گاردکالوم و بعد وارد ستون می شود، گارد کالوم را پس از مدتی باید عوض کرد، ODS اکتا دسیل سیلان گروههای الکیل غیرقطبی زیادی دارد، فاز متحرکی که استفاده می کنیم قطبی است. فاز متحرک و ماده پرکننده ستون از نظر قطبیت باید عکس هم باشند. در HPLC امکان استفاده از فاز نرمال و معکوس هست. اگر فاز ثابت قطبی و فاز متحرک غیرقطبی باشد سیستم را فاز نرمال و در صورتی که ستون غیرقطبی و حلال قطبی باشد. سیستم را فاز معکوس می گویند. مشتقات آلکیل سیلان و فنیل سیلان ایجاد ستونهای غیر قطبی می کنند و معمولا ستون غیر قطبی و فاز متحرک قطبی است بنابراین از فاز معکوس استفاده می شود. جنس ستونها از فولاد ضدزنگ یا Stainless steel است
17
تصاویری از چند ستون
18
5-ردیابها:
ردیابها باید حساس باشند و اثر مخرب بر روی اجسام نداشته باشند. پاسخ آنها تا حدود وسیعی برای غلظت باید خطی باشد. انواع رد یاب ها:
a -مهمترین آنها ردیاب ماورا بنفش است که برای اجسامی که در ناحیه UV-VIS جذب داشته باشند مورد استفاده قرار می گیرد.در این دتکتور جذب انجام می شود و باعث کاسته شدن انرژی می شود که این کاسته شدن قابل اندازه گیری است.میزان کاسته شدن انرژی متناسب است با غلظت،باید طول موج را مشخص کنیم که در اینجاnm l=225 است. حلال نباید در طول موج انتخابی جذب داشته باشد.
.bردیاب ضریب شکست، این ردیاب خیلی حساس به حرارت است.از تغییرات یا تفاوتی که بین ضریب شکست سیستم حلال به تنهایی و سیستم حلال همراه نمونه ایجاد می شود استفاده می کنیم.
c. دتکتور فلورسانس حساس تر از UV است ولی کم مصرف می باشد چون موادی که خاصیت فلورسانس داشته باشند کم هستند.
. dردیاب الکتروشیمیایی که عملکرد آن بر مبنای واکنش های اکسید و احیا می باشد.
19
تصویر آشکارساز
20
6-ثبات (رکوردر): :
در اثر حرکات قلم پیک هایی رسم می شود که به مجموعه آنها کروماتوگرام می گویند. به طریق کیفی پیک ها را براساس زمان باز داری یا نگهداری یا Retention time می شناسند. زمان بازداری فاصله زمانی از لحظه تزریق تا رسیدن به نقطه اوج یک پیک است. برای محاسبه کمی سطح هر نوار جذبی را حساب می کنیم، سطح هر نوار جذبی متناسب با مقدار جسم است که بوسیله انتگراتور یا سطح سنج با دستگاه ثبات بدست می آید سطح هر نوار جذبی یعنی حاصلضرب قاعده × نصف ارتفاع است. روش بریدن نوار و وزن کردن آنها روش قدیمی است. ولی امروزه توسط سطح سنج یا انتگراتور بدست می آید خود دستگاه AUC را مشخص می کند. می توان از ارتفاع هم استفاده کرد و نسبت ارتفاع ها را مشخص کنیم AUC و ارتفاع با یک دستور ساده قابل تبدیل بهم هستند. روش رسم منحنی را انجام می دهیم. در محور افقی غلظت ها و در محور عمودی AUC . بعد از رسم منحنی استاندارد، غلظت مجهول را از روی رسم منحنی بدست می آوریم.
21
انواع کروماتوگرافی
کروماتوگرافی تقسیمی
کروماتوگرافی تبادل یونی
کروماتوگرافی جذب سطحی
کروماتوگرافی طردی
22
کروماتوگرافی تقسیمی
کروماتوگرافی تقسیمی در بین چهار نوع روش کروماتوگرافی مایع بیشتر
از همه به کار برده شده است. در گذشته اکثر کاربردها به ترکیبات
نایونی, قطبی با وزن مولکولی کم و یا متوسط معمولا کمتر از 3000
مربوط بوده است. ولی اخیرا روشهایی ابداع شده اند ( مشتق سازی و زوج
یونی ) که جداسازیهای تقسیمی را به ترکیبات یونی نیز بسط داده اند.
به علت اینکه جداسازی در LLC به میزان تقسیم اجزای مخلوط بین دو
فاز مایع بستگی دارد این نوع کروماتوگرافی را کروماتوگرافی تقسیمی
می نامند.
23
کروماتوگرافی تبادل یونی
در کروماتوگرافی تبادل یون از رزین های تبادل کننده ی یون به عنوان فاز ساکن
استفاده می شود. رزین ها, پلیمرهای سنتزی با اتصالات جانبی هستند که پیوندهای
کوالانسی و گروههای عاملی یونی شونده می باشند. در رزین های تبادل کننده کاتیون
گروههای آنیونی و در رزین های تبادل کننده آنیون گروههای کاتیونی وجود دارند.
یون مخالف یعنی یون متصل به رزین تقریبا آزاد است و می تواند در فاز متحرک آبی
حل شود و درون ستون جریان یابد
24
کروماتوگرافی جذب سطحی
در روش hplc از سیلیکای اصلاح نشده استفاده می شود. مکانهای جذب روی سطح
سلیکا , سیلانول می باشند. در کروماتوگرافی با سیلیکا تعداد نسبی هر نوع از
گروههای سیلانول بستگی به نوع سلیکا و چگونگی تهیه و مراقبت از آنها
دارد.معمولا برای کروماتوگرافی , سیلیکا توسط حرارت دادن در 150 تا 200
سانتیگراد فعال می شود و سپس توسط فاز متحرک و میزان کمی از آب یا حلال آلی
قطبی دیگر به مقدار جزئی غیر فعال شده تا میزان و جذب آن در حد استاندارد گردد.
با وجود سیلیکا و فاز متحرک غیر قطبی که با میزان کم حلال قطبی تعدیل شده , لایه
ای از مواد قطبی روی سطح سیلیکا جذب می شود.
25
کروماتوگرافی طردی
روشی است که مولکولها برمبنای اندازه موثر و شکل آن در محلول از یکدیگر جدا
می شوند. و اگر از حلالهای آلی استفاده کنیم این روش اغلب کروماتوگرافی ژل
تراوا و اگر از حلالهای آبی استفاده نمائیم آن را کروماتوگرافی ژل صافی می نامند.
فاز های ساکن مورد استفاده در کروماتوگرافی طرد ذرات متخلخل با اندازه منافذ
کنترل شده می باشند. و نباید بین جزء نمونه و سطح فاز ساکن برهم کنش موجود
باشد. حجم کل فاز متحرک درون ستون عبارت است از مجموع حجمی که خارج از
ذرات فاز ساکن می باشد.
26
مزایای این روش
کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا سریعترین رشد را در بین تمام فنون جداسازی تجزیه ای با فروش سالیانه در گستره میلیارد دلار داشته است .
و دلیل این محبوبیت:
1- حساسیت روش
2- سازگاری آن برای انجام اندازه گیریهای کمی صحیح
3- مناسب بودن آن برای جداسازی گونه های نافرار یا ناپایدار گرمایی
4- کاربرد گسترده آن برای مواد پراهمیت در صنعت
5- زمینه های مختلف علوم و جامعه
27
موارد استفاده از:HPLC
جداسازی، خالص سازی و شناسائی پروتئین ها و ترکیبات آلی بویژه ترکیبات دوائی. همچنین در برخی از آزمایش های مربوط به تعیین غلظت دواها مورد استفاده قرار می گیرد .
در تحقیقات پروتومیک (تحقیقاتی که برروی پروتئین ها انجام می شود)، آنالیز و هضم پروتئین
مقایسه ساختارهای پروتئین های مختلف
تعیین ساختار پلیمرها
28
با تشکر
91/2/21
29