پاورپوینت مراحل کامل pcr و الکتروفورز

 بسم الله الرحمن الرحیم موضوع ارائه: روش pcr

مقدمه
 تشخیص، تمایز و شناسایی میکروارگانیسم ها می تواند توسط روش های متعددی از جمله آزمایش های فنوتیپی، بیوشیمیایی و ایمونولوژیکی انجام شود.  البته این روشها به دلیل اینکه گاهی نتایج واضح و قابل استنادی ندارند ,همچنین اینکه نیازمند صرف وقت زیادی می باشند تقریبا با روشهای جدید شناسایی که به وسیله تکنیک های مولکولی انجام میشوند جایگزین گردیده اند.  افزایش حساسیت و فرآیند اختصاصی تشخیص, احتمال خطا در این روش ها را نسبت به روش های فنوتیپی و بیوشیمیایی تا حد زیادی کاهش می دهد.

تاریخچه
تکنیک PCR در سال 1984 توسط (کری مولیس)Mullis kary ارائه شده است در این تکنیک یک مولکول DNAمیلیونها بار تکثیر میشود. ابتدا این کار توسط سه بن ماری با حرات دهی مختلف انجام میگرفت و از آنزیم کلنو بعنوان POLYMERASE DNA استفاده میشد. این آنزیم در اثر حرارت دناتوره میشود و اجبارا با ید دوباره در هر سیکل به واکنش اضافه شود. Saiki از آنزیم POLYMERASE DNA مقاوم به حرارت که اصطالحا Taq POLYMERASE DNAگفته میشود استفاده کرد وامروزه واکنش PCR بصورت اتوماتیک انجام میگیرد .

نام دیگر pcr واکنش زنجیره ای پلی مراز است .
واکنش زنجیره ای پلیمراز واکنش ارزان ،سریع و فراگیر ، که به کمک آن محققین توانسته اند آنرا برای بررسی مولکولی میکروبها ، گیاهان ، جانوران، نمونه های باستانشناسی و غیره به کار ببرند.

مکانیسم PCR
واکنش زنجیره ای پلیمرازPCR به سادگی در یک لوله آزمایش با مخلوط کردن DNAبا مجموعه ای از عوامل واکنش دهنده و قرار دادن لوله آزمایش در یک سایکلر حرارتی انجام میشود. اساس این روش بسیار ساده بوده و مانند واکنش همانندسازی DNA در موجودات زنده توسط آنزیم DNAپلیمراز صورت می گیرد. در موجودات زنده، مجموعه ای از چند پروتئین و آنزیم در فرآیند همانند سازی DNAنقش دارند ،در حالی که در واکنش PCR تنها نوع خاصی آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت به نام Taq polymeraseبه همراه بافر، کلرید منیزیم و نوکلئوتیدها,آب مقطر جهت تکثیر قطعات DNA استفاده می شود.

نمونه DNA الگو
تکثیر از روی نمونه DNA انجام می شود. این نمونه می تواند، قطعه ای DNA ،محصول استخراج DNA ژنومی، DNAپلاسمیدی یا حتی محصول PCR دیگری باشد. معمولا حدود یک نانوگرم از DNA پلاسمیدی یا یک میکروگرم از DNA ژنومی برای یک واکنش PCR کافی است. بیش از مقدارتعیین شده، باعث تولید محصولات غیر اختصاصی (قطعات DNAدیگری غیر از قطعه مورد نظر) شده و مقدار کم نمونه DNA نیز باعث کاهش دقت واکنش PCR یا عدم تکثیر قطعه مورد نظر می گردد. کیفیت نمونه DNA نیز مهم است به طوری که باقی ماندن ترکیبات مورد استفاده در مرحله استخراج DNA مثل فنل وEDTA ، باعث کاهش فعالیت آنزیم polymerase Taq و عدم حصول نتیجه مورد نظر می گرددو همچنین آلوده شدن واکنش PCR با مقادیر بسیار اندک DNA از هر منبع دیگری ممکن است به تولید قطعات غیر قابل انتظار بیانجامد.

آغازگرها Primer) )پرایمرها قطعات سنتز شده ای از بازهای آلی اند که بر اساس قطعه مورد نظرDNA الگو ساخته می شوند. طول پرایمرها بسیار مهم است و هر چه طول پرایمر بلند باشد اختصاصی تر عمل می کند . پرایمرها دو عمل انجام می دهند. اول این که محل ژنی را که باید تکثیر شود مشخص می کنند و دوم این که اندازه قطعات تکثیر شونده را تعیین می کنند. غلظت بهینه پرایمرها برای واکنش PCR از 100نانو مولار تا یک میکرو مولار متغییر است. غلظت بیش از محدوده، منجر به تولید قطعات غیر اختصاصی می شود. نرم افزارهایی وجود دارد که طراحی پرایمر را انجام میدهند بعد از طراحی پرایمر بهتر است توسط نرم افزارهایی مانند Blastآنها را چک نمود تا مشخص شود که با چه ژنهای دیگر میتوانند Anneal گردند. بافر مهمترین نقش بافر PCR تنظیم pH مناسب واکنش PCR و آنزیم polymerase Taq می باشد. اجزای این بافر نقش های دیگری نیز دارند. از جمله کلرید پتاسیم که به اتصال پرایمر به DNA الگو (نمونه) کمک می کند. بافر دارای گلیسرول میباشد که برای مشهود سازی DNA است.

کاتیونهای دو ظرفیتی: یون منیزیم
یون منیزیم یکی از اساسی ترین اجزا واکنش PCR می باشد واثر متقابل رشته DNA الگو و آغازگر را افزایش می دهد. انواع مختلف آنزیم DNA polymeraseبرای فعالیت خود به این یون نیاز دارند و این یون برای اتصال پرایمر و قطعه DNA لازم است. برای تکثیر باpolymerase Taq این یون به صورت ترکیب کلرید منیزیم در واکنش PCR استفاده می شود. این ترکیب گاهی در همان بافر PCR قرار داده می شود ولی از آنجا که برای برخی واکنش های PCR لازم است که غلظت این یون تغییر نماید، این ترکیب به طور جداگانه تهیه و به واکنش PCR افزوده می شود. غلظت کلریدمنیزیم اثر زیادی برروی اختصاصی شدن و در نهایت بازده واکنش PCR دارد. غلظت بهینه یون منیزیم در واکنش PCR یک تا چهار میلی مولار است. غلظت بالاتر از مقدارتعیین شده، باعث تکثیر قطعاتی غیر از قطعه مورد نظر (قطعات غیر اختصاصی )شده و غلظت پایین این یون نیز ممکن است به کاهش کارایی واکنش و میزان تولید قطعه مورد نظر منجر شود.

Taq polymerase آنزیم
این آنزیم برای تکثیر قطعات کمتر از سه هزار جفت باز توصیه شده است. به طور معمول حدود یک واحد از این آنزیم در 50 میکرو لیتر از واکنش PCR استفاده می شود. اگر نمونه DNA حاوی مواد ممانعت کننده PCR باشد، می توان مقدارتعیین شده را دو تا سه برابر افزایش داد ، ولی مقادیر بالاتر آنزیم باعث تولید محصولات غیر اختصاصی می گردد.گرچه دمای مناسب برای این آنزیم 70 درجه سانتیگراد می باشد ولی چون این آنزیم در دمای معمولی نیز قادر به تکثیر می باشد، برای جلوگیری از اتصال قطعات پرایمر به نقاط دیگری روی توالی نمونه DNA و امکان تولید قطعات غیر اختصاصی، توصیه می شود که تمامی مراحل آماده سازی واکنش PCR بر روی یخ صورت گیرد .چون واکنش زمانی به طور کارآمد انجام می شود که DNA پلی مراز بتواند در حین چرخه های گرم کردن پایدار بماند,پژوهشگران از یک DNA پلی مراز مقاوم به حرارت تحت عنوان Taqپلی مراز استفاده می کنند.

نوکلئوتید ها
چهار نوکلووتید تشکیل دهنده قطعه DNA از اجزا واکنش PCR می باشند که به عنوان واحد های ساختمانی مورد نیاز در ساخت قطعه DNA استفاده می شوند. غلظت مورد نیاز از هر یک از نوکلووتیدها برای واکنش PCR یکسان و برابر 200 نانو مولار می باشد. برای این منظور از مخلوط های آماده واجد هرچهارنوکلووتید که با غلظت های مختلف مثل دو میلی مولار، 10 میلی مولار و 25 میلی مولار موجود است، استفاده می شود.

روغن معدنی :Oil Mineral
یک قطره روی مخلوط واکنش اضافه می شود تا از تبخیر نمونه در دستگاه چرخش حرارتی Cycler Thermal جلوگیری می شود. معمولا 50 تا 60 میکرولیتر به محلول واکنش 100 میکرولیتری اضافه می شود.

مراحل اصلی در یک واکنش PCR
مرحله اول : Denaturation جدا شدن دو رشته DNA 94تا95 درجه سانتیگراد در 30 الی 60 ثانیه مرحله دوم Annealing: اتصال پرایمرها به نواحی مکمل روی DNA و تعیین محدوده تکثیر قطعه DNA 40تا60 درجه سانتیگراد در 30 الی 60 ثانیه مرحله سوم Elongation : تکثیر قطعه DNA مورد نظر70تا74 درجه سانتیگراد در 5 الی 15 دقیقه

برنامه واکنشPCR
اساس واکنش PCRبرای تکثیر توالی DNA دو رشته ای، تغییرات دمایی می باشد. در ابتدا پیوندهای هیدروژنی دو رشته توالی DNA با حرارت 95-94 درجه سانتیگراد شکسته و دو رشته از یکدیگر جدا می شوند. سپس دمای واکنش پایین آورده می شود معمولا 50 تا 60 درجه سانتیگراد. در این مرحله، دو قطعه کوتاه DNA تک رشته ای معمولا بین 18 تا 30 نوکلئوتید که دقیقا مشابه دو طرف قطعه DNA مورد نظر برای تکثیر طراحی شده اند (با نام پرایمر یا آغازگر)، به توالی های مکمل خود در دو رشته باز شده DNA متصل می گردند. این دو قطعه انتهای 3‘ آزاد جهت فعالیت آنزیم DNA پلیمراز را فراهم می نماید. در این دما دو رشته هر مولکول میتوانند دوباره به یکدیگر متصل شوند ولی این اتفاق نمی افتد زیرا مخلوط حاوی مقدار بیشتری مولکولهای کوچک DNAبه نام پرایمراست که درمحلهای ویژه ای به مولکولهای DNAاتصال میابند. در مرحله بعد، دمای واکنش تا 72 درجه سانتیگراد افزایش یافته . این مناسبترین دما برای عملکرد آنزیم DNAپلیمرازTaqموجود در مخلوط واکنش است. عمل تکثیر قطعه DNA مورد نظر بین دو پرایمر با استفاده از نوکلووتیدهای موجود، توسط آنزیم polymerase Taq مقاوم به حرارت انجام می پذیرد. درطی این مرحله این آنزیم به هر پرایمر میچسبد و رشته جدیدی ازDNAرا میسازد.با این رشته ها میتوانیم واکنش دیگری را شروع کنیم. این 3 مرحله بین 25 تا 40 بار تکرار می شود که به آن چرخه های PCR می گویند.

تاچ داون پی سی آر Touchdown pcr
یکی از روش های تکثیر DNA است که سبب کاهش احتمال تکثیر غیر اختصاصی می گردد. دماهای بالا سبب کاهش اتصال پرایمر به توالی مکمل خود شده و حساسیت PCR را کم می کند (ولی اختصاصیت افزایش می یابد). دماهای پایین نیز سبب افزایش اتصال پرایمر به محل های غیر اختصاصی شده و اختصاصیت (specificity یا PCR (stringency را کاهش می دهد (ولی حساسیت افزایش می یابد). بنابراین در این روش به جای یک دمای اتصال مشخص، از یک بازه دمایی در مرحله Annealing استفاده می کنند. بدین صورت که دمای اتصال با بالاترین دما شروع می شود که فقط سبب تکثیر اختصاصی قطعه مورد نظر می شود. به تدریج در سیکل های بعدی دما به صورت تدریجی کاهش می یابد که سبب افزایش حساسیت تکثیر قطعه مورد نظر می گردد. اگر در مراحل اولیه (دمای بالا) پرایمر به ناحیه اختصاصی خود متصل شود احتمال تکثیر غیر اختصاصی در مراحل بعدی (دمای پایین) کاهش می یابد. در واقع این روش سبب افزایش اختصاصیت (دمای بالا) و افزایش حساسیت (دمای پایین) تکثیر قطعه DNA مورد نظر می شود

در این روش از انواع PCR که به TD-PCR نیز شناخته می شود روشی است که در آن دمای اولیه اتصال بالاتر از Tm بهینه پرایمر ها است و به تدریج طی سیکل های بعدی کاهش می یابد تا زمانی که بهترین دمای Tm یا دمای اتصال برسد. کاهش تدریجی دما تا دمای اتصال مجاز در طول سیکل های PCR تکثیر قطعه ژنی مورد نظر را بهینه می کند. دمای مطلوب اتصال پرایمرها به قطعه ژنی بسیار مهم و مورد نیاز در انواع PCR است. این به طور معمول بر اساس دمای ذوب (Tm) پرایمر – الگو تعیین می شود.

کاربرد Touchdown PCR
TD – PCR در پروتکل های استاندارد انواع PCR ، از جمله PCR وابسته به ترانس کریپتاز معکوس، و همچنین در تولید کتابخانه های cDNA و غربال گری چند شکلی تک نوکلئوتیدی، کاربرد گسترده ای یافته است. TD-PCR مخصوصاً برای رشته های DNA الگویی که که تکثیر آن ها دشوار است مفید واقع شده اما همچنین می توانند به طور استاندارد برای افزایش اختصاصیت و شکل گیری محصول استفاده شوند. این روش بسته به طول رشته الگو بین 90 تا 120 دقیقه طول می کشد.

پی سی آر کلونی Colony PCR
PCR کلنی چیست؟
PCR کلنی اصلاح PCR معمولی است که در آن کلنی­ های باکتریایی بطور مستقیم به عنوان الگوی PCR مورد استفاده قرار می­گیرند.
DNA پلاسمیدی که حاوی DNA مورد نظر ما است در شرایط وابسته به دمای تناوبی تکثیر می­شود. از این روش به صورت معمول جهت مطالعه ژنوم باکتری ها استفاده می گردد. توسط این تکنیک کلونی های باکتریایی حاصل از القا پلاسمید با تکثیر بالا به آن ها غربالگری می گردند. این روش علاوه بر فراهم کردن میزان کافی از محصول PCR جهت توالی یابی به عنوان جایگزین روش غربالگری سنتی کلونی آبی و سفید استفاده می شود.
PCR کلنی یک روش سریع برای تعیین حضور یا عدم حضور DNA درج شده در پلاسمید به طور مستقیم از سایر کلنی­ های باکتریایی است. کلونینگ مولکولی یکی از محبوب­ترین روش­ها برای انتقال DNA است. با این حال ، برای تعیین وجود یا عدم وجود DNA باید آزمایش­های مختلفی را انجام دهیم.

اصل کلنی PCR:
کلونی باکتری ای که شامل پلاسمید است، مستقیما” از دو دسته پرایمر برای ثکثیر استفاده میکند. دسته اول insert-specific پرایمر ها هستن که برای تکثیر توالی در نقطه ی الحاق استفاده می­شوند و دسته دوم vector-specific پرایمر ها هستن که برای تکثیر قطعه الحاق شده از آنها استفاده می­شود)در نواحی کناری دو طرف نقطه الحاق(. روش انجام
کلنی PCR نیازی به استخراج DNA ندارد. ما در اینجا استخراج DNA نمی کنیم. در عوض، چندین روش دیگر برای افزایش حساسیت واکنش استفاده می­شود. 
چرا ما DNA پلاسمید را استخراج نمی کنیم؟ از آنجا که دلیل آن ساده است، غشای سلولی سلول باکتری بسیار صاف است. انواع مختلفی از روش­های استخراج DNA باکتری حاوی غشای سلولی نرم است که با گرم کردن یا سانتریفیوژ کردن آن با سرعت بالا به راحتی لیز می شود. همچنین، ما به DNA خود باکتریایی احتیاج نداریم. پلاسمید حلقوی در داخل سیتوپلاسم باکتری وجود دارد، بنابراین مراحل اضافی تصفیه نیز لازم نیست. با پارگی غشای سلول، DNA الگوی ما برای تقویت آماده است .با کمک جمع کننده استریل، چندین کلونی باکتریایی را انتخاب کرده و آن را به لوله Eppendorf منتقل کنید. حالا بافر TE را در آن بیفزایید و خوب
مخلوط کنید. می توانید از D / W نیز استفاده کنید.نمونه را ۲۰ دقیقه در حمام آب جوش گرم کنید.
به آرامی آن را محکم کنید. نمونه را با سرعت بالا به مدت ۲ دقیقه سانتریفیوژ کنید.
 مایع رویی را به لوله دیگری منتقل کرده و از آن به عنوان یک الگوی DNA استفاده کنید.یک نمونه 20 μL به واکنش اضافه می شود.

 مزایای استفاده از PCR کلنی:
– این روش سریع و مقرون به صرفه است.
علاوه بر این، دقت و ویژگی تکنیک بالاتر است.
تنظیم درست مانند PCR معمولی ساده است، استخراج DNA و تصفیه پلاسمید لازم نیست.
کل آزمایش را می توان طی ۹۰ دقیقه به پایان رساند.
معایب کلونی PCR:
این روش مقرون به صرفه، سریع و قابل اعتماد است، اما هیچ جهشی در داخل قابل شناسایی نیست.
علاوه بر این، اطلاعات توالی را نمی توان با PCR کلنی بدست آورد. برای تایید تحول DNA باید ترتیب توالی را انجام دهیم .احتمال نتایج مثبت کاذب زیاد است.

 پی سی آر دژنره Degenerate PCR
یکی از انواع روش های PCR است که از پرایمرهای دژنره به منظور تکثیر توالی های ناشناس پیوسته به توالی های شناخته شده استفاده می نماید. این پرایمرها بر اساس همولوژی ژن شناسایی و توالی سنجی شده طراحی شده اند. از این روش در شناسایی ژن های اورتولوگ از ارگانیسم های مختلف یا عضوی جدید از یک خانواده ژنی استفاده می گردد.
توصیف یک واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) که در آن پرایمرها اختصاصی نیستند، اما عمداً مخلوط می شوند تا دنباله ای که از توالی پپتیدی استنتاج شده است )بنابراین استفاده دقیق کدون ناشناخته است)یا جداسازی شود. ژن های همولوگ یک رویکرد مشابه، با استفاده از توالی های عمدی دژنره شده، در غربالگری کتابخانه های ژنومی نیز استفاده می شود.

پی سی آر هات استارت Hotstart PCR
تنها تفاوتی که این روش با PCR معمولی دارد اضافه شدن پلیمراز Taq به مخلوط واکنش در زمانی است که بقیه اجزای واکنش فوق تا دمای ذوب DNA گرما داده شده اند بدین ترتیب از تولید محصولات غیراختصاصی ممانعت می کند. در بعضی مواقع هم می توان از پلیمراز Taq متصل به مهارکننده هایی استفاده نمود که پس از رسیدن مخلوط واکنش به دمای ذوب Tm مهارکننده ها از آن جدا شده و آنزیم فعال می گردد. استفاده از DNA پلیمرازهای Hot Start اغلب برای کاربردهای با بازدهی بالا و آزمایشاتی که به درجه بالایی از حساسیت و ویژگی نیاز دارند، توصیه می شود.
انواع تکنیک Hot Start PCR
۱- Hot Start به کمک آنتی بادی
مونوکلونال آنتی بادی ضد آنزیم پلیمراز را به واکنش اضافه می کنند. در نتیجه فعالیت پلیمرازی آنزیم را مهار می کند. هنگامی که دمای واکنش به ۹۴ درجه سانتی گراد می رسد، آنتی بادی دناتوره می شود و دوباره پلیمراز فعال می شود.

– Hot Start 2 به کمک Ampliwax
به دیواره لوله های مخصوص این کار به نوعی واکس آغشته است که بعد از کمی گرم کردن ذوب شده و روی واکنش را می پوشاند. آنزیم پلیمراز را روی واکس قرار می دهند. در دمای ۹۴ درجه سانتیگراد این واکس بخار می شود و آنزیم پلیمراز با واکنش تماس پیدا می کند. این تکنیک در ابتدا به عنوان روشی برای متوقف ساختن عملکرد تکثیری DNA پلیمراز در دماهای پایین به کار می رفت. اما امروزه روش های دیگری نیز توسعه یافته اند که مواد اولیه اصلی واکنش را مورد هدف قرار داده و به این ترتیب عملکرد پی سی ار را با جلوگیری از تکثیر قطعات غیر هدف بهبود میبخشد. در مواقعی مفید است که تکثیر غیراختصاصی به علت وجود مقادیر بسیار کم DNA الگو، پیچیده بودن توالی آن مثلا در long PCR و استفاده از جفت پرایمرهای متعدد مثلا در multiplex PCR مشکل ساز باشد. همچنین این تکنیک در RT-PCR بسیار حیاتی است و می تواند برای تکثیر توالی های پیچیده کمک کننده باشد.

پی سی آر مینی پرایمر (Miniprimer PCR
از این تکنیک PCR در مواردی مانند شناسایی ژنوتیپ محافظت شده سلول پروکاریوتی (16S rRNA) و یوکاریوتی (18S rRNA) جهت مطالعات تکاملی و رده بندی آن ها مورد استفاده قرار می گیرد. در این روش از یک پرایمر با توالی کوتاه 10 نوکلئوتیدی و پلیمراز Taq مهندسی شده استفاده می گردد که در حالتی که طول پرایمر 20-30 نوکلئوتید باشد تکثیر توالی محافظت شده میسر نیست.

Inverse pcr
واکنش زنجیره ای پلیمراز معکوس (Inverse PCR) گونه ای از واکنش زنجیره ای پلیمراز است که برای تکثیر DNA تنها با یک توالی شناخته شده استفاده می شود. یکی از محدودیت های PCR معمولی این است که به پرایمرهای مکمل هر دو انتهای DNA هدف نیاز دارد، اما این روش به انجام PCR اجازه می دهد حتی اگر فقط یک توالی در دسترس باشد که ممکن است پرایمرها از آن طراحی شوند.
PCR معکوس به ویژه برای تعیین مکان های درج مفید است. برای مثال، رتروویروس ها و ترانسپوزون های مختلف به طور تصادفی در DNA ژنومی ادغام می شوند. برای شناسایی مکان هایی که وارد شده اند، می توان از توالی های ویروسی یا ترانسپوزونی شناخته شده «داخلی» برای طراحی پرایمرهایی استفاده کرد که بخش کوچکی از DNA ژنومی (خارجی )را تقویت می کنند.
روش PCR معکوس شامل مجموعه ای از هضم های محدود و بستن می شود که منجر به ایجاد یک قطعه حلقه ای می شود که می تواند برای PCR از یک بخش منفرد از توالی شناخته شده آماده شود. سپس، مانند سایر فرآیندهای واکنش زنجیره ای پلیمراز، dna توسط DNA پلیمراز مقاوم در برابر حرارت تقویت می شود.
 

یک منطقه هدف با یک بخش داخلی از توالی شناخته شده و مناطق جانبی ناشناخته شناسایی می شودو dna ژنومی توسط یک آنزیم محدود کننده برش معمولاً با فرکانس متوسط ​​کم (6-8 پایه) به قطعات چند کیلو باز هضم می شود.
تحت غلظت های کم DNA یا شرایط بستن سریع، خود بستن القا می شود تا یک محصول DNA دایره ای ایجاد کند. PCR به طور معمول با قالب دایره ای انجام می شود، با پرایمرهای مکمل بخش هایی از توالی داخلی شناخته شده که به سمت بیرون اشاره می کنند. در نهایت توالی محصول PCR توالی یابی شده با پایگاه های داده توالی مقایسه می شود. در صورت خزیدن کروموزوم استفاده می شود.

Assembly pcr
برای سرهم کردن و جوش دادن دو قطعه DNA هم اندازه ژن به صورت یک قطعه واحد برای انجام کلونینگ راحتٰ تر از این حالت از انواع PCR استفاده شده و از آن به نام پی سی آر مونتاژ یا Assembly PCR نام برده می شود. در اصل شامل PCR دو قطعه به طور جداگانه با آغازگرهایی که 20bp و سپس انجام یک مرحله PCR اضافی با استفاده از دو محصول به عنوان الگو همپوشانی دارند. این روش از انواع PCR اساساً فقط برای سهولت انجام کلونینگ است.
به جای تلاش برای PCR یا برش وکتور به دو قطعه جداگانه و سپس هضم و اتصل آن ها با اندونوکلئاز، در Assembly PCR می توان به سادگی از PCR اولین قطعه پرایمر «معکوس» (Reverse) که با قطعه دوم پرایمر «رو به جلو» (Forward) همپوشانی دارد استفاده کرد و سپس از محصول اولین واکنش های PCR به عنوان الگویی برای واکنش مونتاژ استفاده شود. اگر قطعه ’5 پرایمر ریوِرس و قطعه ’3 پرایمر فوروارد در 20 جفت باز همپوشانی داشته باشند، محصول اولین واکنش های PCR باید در منطقه همپوشانی ایجاد شود و محصول کامل )فیوژن ژن)را ایجاد کند.

با استفاده از آغازگر فوروارد برای قطعه اول و آغازگر ریوِرس برای قطعه دوم در واکنش مونتاژ، محصول کامل مورد نظر را تکثیر می کند. از محاسن این تکنیک این است که سریع تر از روش مونتاژ استاندارد 3 – طرفه است (زیرا برای حالت استاندارد کلونینگ، به DNA با کیفیت خوب نیاز دارید تا بتواند به خوبی کار کند که معمولاً به معنی زیر کلون سازی هر قطعه است) و به علاوه قابل اطمینان تر است (کیفیت محصول بسیار خوب است بنابراین می توانید آن را مستقیماً در وکتور مورد نظر کلون کنید). Assembly PCR برای بهبود عملکرد پروتئین مورد نظر استفاده می شود و همچنین می تواند برای تولید مقادیر زیادی RNA برای مطالعات ساختاری یا بیوشیمیایی مورد استفاده قرار گیرد.
در واقع نوعی از PCR است که هدف از آن سوار کردن الیگونوکلئوتیدهای دارای همپوشانی توالی روی همدیگر است. به طوریکه ژن هایی کامل تبدیل شوند.

ISSR PCR
جهت تمایز افراد یک گونه در مطالعات ژنتیک جمعیت و انگشت نگاری افراد نزدیک به هم بسیار کاربرد دارد. مارکر های ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) نواحی در ژنوم هستند که در بین توالی های ریز ماهواره ای قرار دارند. تکنیک ISSR، یک روش مبتنی بر PCR است که شامل تکثیر یک قطعه DNA  در فاصله تکثیر پذیر میان دو ناحیه تکراری ریز ماهواره منحصر به فرد با جهات مخالف می باشد.
تکرار توالی بین ساده(ISSR)-PCR تکنیکی است که شامل استفاده از توالی های ریزماهواره به عنوان آغازگر در یک PDR برای تولید نشانگرهای چند مکان است. این یک روش ساده و سریع است که بیشتر مزایای ریزماهواره ها (SSRs) و چندشکلی طول قطعه تقویت شده (AFLP) را با جهانی بودن RAPD ترکیب می کند. نشانگرهای ISSR بسیار چندشکلی هستند و در مطالعات مربوط به تنوع ژنتیکی، فیلوژنی، برچسب گذاری ژن، نقشه برداری ژنوم و زیست شناسی تکاملی مفید هستند . توالی های تقویت شده توسط ISSR-PCR را می توان برای انگشت نگاری DNA استفاده کرد. از آنجایی که یک ISSR ممکن است یک منطقه حفاظت شده یا غیر حفاظت شده باشد، این تکنیک برای متمایز کردن افراد مفید نیست، بلکه برای تجزیه و تحلیل های فیلوژئوگرافیک یا شاید تعیین حدود گونه ها مفید است. تنوع توالی کمتر از SSRPCR است، اما همچنان بیشتر از آن در توالی های ژنی واقعی است. علاوه بر این، توالی یابی ریزماهواره و توالی یابی ISSR به یکدیگر کمک می کنند، زیرا یکی برای دیگری آغازگر تولید می کند .

کاربرد ISSR به دلیل مشخصات انگشت نگاری چندجایگاهی که به دست می آید، تجزیه و تحلیل ISSR می تواند در مطالعاتی مانند هویت ژنتیکی، تعیین والد، شناسایی سویه های نژادی و کلون ها و مطالعات طبقه بندی گونه های خیلی نزدیک به هم به کار گرفته شود. به علاوه، ISSRها در مطالعات نقشه برداری ژنتیکی مفید دانسته می شوند.

LATE PCR
این تکنیک تک رشته های DNA ایجاد می کند. در این تکنیک نیاز به جداسازی آنزیمی و یا مکانیکی محصولات تک رشته ای و خالص سازی آنها و انجام یک مرحله تکثیر خطی به صورت جداگانه را از بین می برد. در PCR نامتقارن معمولی به دلیل محدود بودن غلظت یک پرایمر به ناچار دمای ذوب پرایمرها پایین تر از دمای اتصال آن ها می باشد و بدین ترتیب این نوع از PCR سخت و ناکارآمد است. تکنیک PCR خطی پس از لگاریتمی (LATE-PCR) یک الگوی جدید برای طراحی پرایمر را ارائه داده که بدون توجه به نسبت غلظت پرایمرها، خروجی آن آزمون هایی به کارآمدی آزمون های PCR متقارن است. روش LATE-PCR محصولات تک رشته ای با سینتیک قابل پیش بینی در محدوده ای فراتر از فاز لگاریتمی برای تعداد بسیاری از چرخه ها را ایجاد می نماید. این روش معیارهای طراحی پروب جدیدی را ارائه داده که تشخیص پروب هیبریداسیون را از اتصال و طویل سازی پرایمر جدا می نماید و بدین ترتیب موجب افزایش قابلیت اطمینان به پروب، بهبود تمییز میان آلل ها و افزایش قدرت سیگنال دهی 80 تا 250 درصد نسبت به PCR متقارن می گردد. این بهبودها در PCR به طور ویژه ای در تجزیه و تحلیل کمی زمان واقعی (ریل تایم) مقادیر عددی هدف در نمونه های کوچک مفید می باشد. روش LATE-PCR با کاربردهای با بازدهی بالا در زمینه هایی مانند تشخیص های بالینی، پزشکی قانونی، دفاع زیستی و توالی یابی DNA استفاده میشود.

SP-PCR پی سی ار فاز جامد
PCR فاز جامد یا SP-PCR یکی از انواع PCR و تکنیک منحصربه فردی است که اجازه می دهد اسیدهای نوکلئیک هدف را بر روی یک تکیه گاه جامد در جایی که یک یا هر دو پرایمر در سطح بی حرکت هستند، تقویت کند. جداسازی فضایی آغازگرها به طور قابل توجهی فعل و انفعالات آغازگر نامطلوب را به حداقل می رساند، در نتیجه از تشکیل پرایمر – دایمر جلوگیری می کند و اجازه می دهد تا «تکثیر چندگانه» (Multiplexing Amplification) بالاتر انجام شود. ایده اصلی این روش جدید اتصال انتهای ’5 پرایمرها به یک سطح است به جای اینکه اجازه دهد آغازگرها به صورت آزاد در یک محلول پراکنده و پخش شوند.
انتشار آزادانه DNA هدف، می تواند روی سطح جامد انجام شده و سپس توسط پلیمراز تکثیر صورت گیرد. کپی های تکثیر شده به سطح متصل می شوند، در حالی که مولکول اولیه DNA پس از مرحله اتصال پرایمرها به محلول برمی گردد. انتهای آزاد مولکول کپی شده DNA با پرایمر )متصل به سطح(ترکیب شده سپس با توالی مولکول DNA مکمل شده و روند تکثیر می تواند شروع شود. کاربرد PCR فاز جامد 
واکنش زنجیره ای پلیمراز فاز جامد ابزاری است که به طور فزاینده ای مورد استفاده قرار می گیرد و برای تولید DNA بی حرکت برای انواع برنامه ها، از جمله توالی یابی DNA با توان بالا و تجزیه و تحلیل SNP مورد استفاده قرار می گیرد.

تکنیک الکتروفورز
از روش های آزمایشگاهی مرسوم جهت جداکردن مولکولهای باردار تکنیک ژل الکتروفورز میباشد .این جداسازی با توجه به  اندازه، بار و جرم مولکولی آنها انجام میگیرد. فرایند کلی این تکنیک به این صورت است که با برقراری جریان در ژل الکتروفورز ، دو سمت ژل دارای دو قطب مخالف مثبت و منفی میشود که باعث میشود مولکول های باردار به سمت قطب مخالف خود حرکت کنند.این عمل حرکت مولکول ها تحت اصطلاح ” مهاجرت ” شناخته شده است. دلیل این مهاجرت ساختار ماتریکس نفوذپذیر ژل است که مولکول ها را قادر میسازد از میان منافذ موجود در آن  عبور و در طول ژل حرکت کنند. 
اساس کار این تکنیک اعمال جریان الکتریکی است که منجر به جداسازی و شناسایی مولکول ها میشود . کاربرد این روش  در آزمایشگاه های مولکولی و بیوشیمی برای جداسازی مولکول های باردار مانند RNA ،DNA  و پروتئین است. ژلی که برای این تکنیک استفاده میشود آگارزو یا پلی آکریل امید است . ساختار این ژل ها منفذ دار است و همین امر موجب میشود ، مولکول ها با اندازه های متفاوت به راحتی از آن عبور کند. برای کوچک یا بزرگ کردن این منافذ جهت حرکت مولکول های کوچکتر و یا بزرگتر ، میتوانیم غلظت ژل های مورد استفاده درالکتروفورز را کمتر و یا بیشتر کنیم.

کاربردهای تکنیک ژل الکتروفورز
کاربرد اصلی این متد در آزمایشگاه ها به دو بخش اصلی تقسیم میشود :
1-جداسازی مولکولهای DNA که یا بصورت استخراج شده هستند و یا محصول PCR ، ریل تایم و یا کلونیگ ژن
2-بررسی و مطالعه کیفیت محصول PCR
منافذ بزرگ  ژل آگاروز قطری حدود ۱۰۰ تا ۵۰۰ نانومتردارد که کاملا متناسب برای جداسازی  مولکول های DNA با طول بالا میباشد. البته این تکنیک  برای جداسازی پروتئین ها نیز میتواند بسیار ایده آل باشد ، اما روش رایج شناسایی پروتئین ها ،  کروماتوگرافی است. اما توجه داشته باشید که تکنیک ژل الکتروفورز نیز بعنوان یک متد ساده و اقتصادی میتواند برای شناسایی پروتئین ها کاربرد داشته باشد. در اصطلاح آزمایشگاهی روش الکتروفورز ژل پلی آکریلامید که منافذی با قطر 10 تا 200 نانومتر دارد برای  جداسازی پروتئین ها بسیار ایده آل است.به این روش PAGE نیز گفته میشود مبنای آن بر اساس سایز پروتئین ها است.

انواع الکتروفورز:
عملکرد الکتروفورز  به دو روش عمودی یا افقی میباشد که هر یک کاربردهای مخصوص به خود را دارد. 
از تفاوت های آشکار این دو جهت قرارگیری ژل است :
در الکتروفورز افقی، ژل مورد استفاده آگاروز است و نیز قرارگیری ژل به صورت افقی در محیط بافر است، 
الکتروفورز عمودی ، ژل مورد استفاده پلی آکریلامید است  و قرارگیری ژل به صورت عمودی و درون محفظه الکتروفورز است و تماس آن با بافر محدود است.
در روش عمودی ، نمیتوان از ژل آگاروز استفاده کرد و فقط از ژل پلی آکریلامید استفاده میشود چون در پلیمریزه شدن آن ، اکسیژن بعنوان یک مهارکننده فعالیت دارد. در الکتروفورز افقی ژل در ارتباط مستقیم با اکسیژن است. بنابراین از الکتروفورز عمودی که تماس آن با اکسیژن محدود است استفاده میکنند.

ژل آگاروز / آگارز ( Agarose):
از پلی ساکارید جلبک های دریای تهیه میشود.
درون کاست افقی شکل میگیرد. 
برای استفاده، ایمن است.
قادر به جداسازی مولکول های بزرگ است.
ایده آل برای جداسازی DNA است.
دارای منافذ بزرگ است. 
ساختار ساده ای دارد.

ژل پلی آکریلامید (Poly Acrylamid):
از اتصالات عرضی پلیمر آکریلامید درست میشود. 
درون کاست عمودی شکل میگیرد.
سمی و خطرناک است. 
قادر به جداسازی مولکول های کوچک نیز است.
برای جداسازی پروتئین و DNA کاربرد دارد.
دارای منافذ کوچک است.
ساختار سخت و پیچیده ای دارد.

طرز تهیه ژل آگاروز

برای ساخت ژل، به دو مواد زیر نیازمند هستیم :
• پودر آگاروز
• بافر TBE
1 .1 گرم از پودر آگاراز را با استفاده از ترازوی دیجیتال وزن میکنیم.
2 .سپس آن را به ml 99 بافر 5x.0 TBE اضافه میکنیم.
در تهیه ژلهای الکتروفورز اغلب از بافرهای TAE و TBE استفاده میشود. نکته مهم در انتخاب و استفاده از بافرها این است که همیشه از همان بافری که برای تهیه ژل استفاده میشود باید برای پر کردن تانک الکتروفورز نیز استفاده کرد.
3 .مخلوط بافر و پودر آگاروز برای انحالل بیشتر، حرارت )بر روی هیتر ( میدهیم.حرارت باعث حل شدن تمام ذرات آگاروز در بافر میشود، به طور ی که بعد از اتمام حرارت دهی، مایع شفاف و یکنواختی بدست میآید.
4 .در این مرحله صبر میکنیم تا به خوبی سرد شود )تا دمای °C 40)
5 . 6میکرولیتر اتیدیوم برماید )Bromide Ethidium ) به آن اضافه میکنیم )عمل رنگ آمیزی را انجام میدهیم(.

6.آن را به کاستهای ژل )که شانه چاهک برای روی آن قرار گرفته( منتقل میکنیم. مجددصبر میکنیم تا زمانی که ژل میبندد و برای انجام الکتروفورز آماده میشود. ژل آگاروز بیشتر در الکتروفورز افقی استفاده میشود.
7.سینی ژل را درون تانک الکتروفورز قرار میدهیم.
8 .تانک را از بافر )TBE )پر میکنیم بهطوری که بافر به خوبی روی ژل را بپوشاند.
9 .حال ژل آماده است که نمونه ها را درون آن لود کنیم (Loading .) نمونه هر فرد را درون هریک از چاهکها میریزیم.
10 .به دلیل آنکه رنگ DNA استخراج شده از آزمایش سوم سفید بوده و رنگ ژل نیز سفید است قبل از آنکه نمونهها را درون ژل لود کنیم از یک رنگ به عنوان نشانه استفاده میکنیم برای انکه متوجه شویم که به خوبی DNA درون چاهکها ریخته شده است و دستگاه نیز به خوبی کار میکند. این رنگ Day است

استفاده از هر یک از این بافر ها  با توجه به نوع مولکول و هدف از جداسازی انتخاب میشود.
بافر TAE یا Tris/Acetate/EDTA: برای تهیه این بافر از تریس (Tris-base)، استات (Acetate) و EDTA به همراه آب استفاده می شود.
بافر TBE یا Tris/Borate/EDTA: برای تهیه این بافر تریس به همراه بوریک اسید (Boric acid) در آب رقیق شده و با
Na2EDTA مخلوط می شود.
خصوصیات بافر TAE:
برای جداسازی قطعات بلند DNA
خصوصیات بافر TBE:
برای شناسایی قطعات DNA با طول 2kb
ایجاد محیطی با رسانایی بالا
مناسب جهت الکتروفورزهای طولانی
تشکیل باندهای بهتر نسبت به بافر TAE

مواد لازم برای تهیه بافرها

طرز تهیه ژل پلی آکریلامید:
برای تهیه این ژل ترکیب دو ماده پلی آکریلامید و بیس آکریلامید به همراه حجم مشخصی از آب استفاده میشود .سپس محلول را برای تخلیص از فیلتر عبور داده و در دمای اتاق در فضای تاریک نگهداری می شود. بافر مورد استفاده در این ژل معمولا بافر TBE است. قبل از ریختن محلول در کاست به آن آمونیوم پرسولفات و TEMED
اضافه میکنند تا پلیمریزاسیون ژل سریع تر انجام شود.توجه کنید که کار با TEMED باید در شرایط خاص ایمنی و زیر هود آزمایشگاهی انجام شود چون بسیار خطرناک و جهش زا است. از ژل پلی آکریلامید در الکتروفورز عمودی و جهت جداسازی پروتئین و مولکول های DNA کوچک و تک رشته ای استفاده می شود.

الکتروفورز مولکول های DNA
الکتروفورز مولکول های DNA
با این تکنیک کاربر قادر به شناسایی مولکولهای DNA با طول های متفاوت است. از آنجاییکه مولکول های DNA دارای بار منفی هستند زمانی که روی ژل  و تحت جریان الکتریی قرار میگیرند به سمت الکترود مثبت حرکت می کنند. در این شرایط ، جداسازی مولوکول های DNA ، تنها بر اساس اندازه و سایز آنها انجام می شود. حرکت رشته های کوتاه DNA سرعت بیشتری نسبت به مولکول های بلندتر دارند، بنابراین جداسازی  مولکول های DNA با اندازه های متفاوت آسان تر انجام میشود. ردیابی نمونه ها، با اضافه کردن رنگهای فلورسنت درون چاهک ژل  انجام میگیرد. بعضی رنگ های فلورسنت را با ژل ، درست قبل از انتقال آن به قالب الکتروفورز مخلوط میکنند که در این شرایط ، نیاز به اضافه کردن رنگ هنگام لود نمونه  نیست. الکتروفورز برای مولکول های DNA به صورت افقی انجام می گیرد که روشی ساده تر نسبت به روش عمودی است. بعد از توقف جریان، باند مولکول های DNA در اندازه های مختلف بر روی ژل نمایان است که جهت تعیین اندازه باند نمونه، از یک نشانگر و یا در اصطلاح  (Ladder) به عنوان استاندارد استفاده می شود. Ladder) لدر(روی ژل به صورت باندهایی با طول معین نمایان بوده و با استفاده از آن اندازه باندهای نمونه بر روی ژل را می توان ارزیابی کرد.

ویژگی های ژل آگارز
ژل آگارز نوعی ماتریکس سه بعدی تشکیل شده از مولکول های هلیکسی آگارز می باشد که کنار هم قرار گرفتن به صورت سه بعدی منافذی ایجاد می نمایند که جهت جداسازی بیو مولکول ها فوق العاده مناسب می باشند. تمام این ساختار سه بعدی تشکیل شده حاصل پیوند های هیدروژنی می باشد که می­توان با افزایش درجه حرارت آن را از بین برد. دمای ژله ای شدن آگارز بسیار متفاوت از دمای ذوب آن می باشد. بسته به نوع منبع، آگارز دارای دمای ژله ای شدن بین 35-42 درجه سانتیگراد می باشد و دمای ذوب آن حدود 85-95 درجه سانتیگراد می باشد. ژل آگارز به دلیل اندازه بزرگ منافذ و قدرت ژل بالای آن برای الکتروفورز پروتئین های بزرگ و نیز DNA بسیار مناسب می باشد. ژل آگارز 1 ٪  دارای منافذ در حدود 100 تا 300 نانو متر می باشد. غلظت های پایین ژل بسیار ظریف می باشند و جابجایی آنها خیلی مشکل دارد. ژل آگارز به دلیل اندازه بزرگ منافذ، قدرت جداسازی و تفکیک پایین تری نسبت به اکریل آمید برای DNA دارد، اما دامنه جداسازی آن بسیار وسیع­تر می باشد. حداکثر بازه جداسازی توسط این نوع ژل حدود 750 کیلو باز می باشد، اما برای جداسازی های در حد 6 مگا باز از تکنیک PFGE استفاده می شود. این تکنیک همچین برای جداسازی پروتئین های بزرگ نیز کاربرد دارد و می­تواند با کارآیی بالایی ذرات دارای شعاع موثر بیشتر از 5-10 نانومتر را جدا سازد. یک ژل آگارز 0.9 ٪ آنقدر بزرگ می­باشد که باکتریوفاژ T4 بتواند وارد آن شود.

بارگیری نمونه ها
هنگامی که ژل بسته شد، شانه را از آن بیرون آورده و حالا می­توان با قرار دادن آن در محفظه تانک و ریختن بافر تازه به اندازه کافی نمونه ها را بارگذاری کرد. باید دقت کرد که قبل از بارگذاری نمونه­ها، آنها را با بافر Loading مخلوط نمود تا به راحتی در چاهک ها قرار بگیرند. معمولا بافر loading از یک ترکیب با چگالی بالا مانند گلیسرول، ساکاروز و یا فیکول می باشد که چگالی کلی نمونه ها را بالا می برد و نمونه DNA به راحتی در ته چاهک قرار خواهد گرفت. بافر Loading همچنین شامل رنگ­هایی مانند زایلن سیانول و بروموفنول بلو می باشد. این رنگ ها به منظور نشان دادن میزان پیشرفت نمونه ها بر روی ژل مورد استفاده قرار می گیرند. حالا نمونه های DNA را با استفاده از پیپت بارگذاری کنید 

شروع عمل الکتروفورز
ژل الکتروفورز آگارز معمولا در تانک الکتروفورز افقی ران می شود و در حین عمل الکتروفورز ژل کاملا در بافر غوطه ور می شود. همچنین می­توان این نوع الکتروفورز با به صورت عمودی انجام داد، اما کمتر از این نوع روش جهت الکتروفورز آگارز استفاده می شود.
باید دقت شود که ولتاژ بالاتر موجب جداسازی سریع­تر نمونه ها خواهد شد، اما موجب ذوب شدن ژل و نیز بافر گردد و از این رو جداسازی نمونه ها با کیفیت خوبی صورت نگیرد. ولتاژ پایین نیز می­تواند موجب پهن شدن باندها برای قطعات کوچک DNA شود. به دلیل آنکه مولکول DNA در نور معمولی قابل مشاهده نمی باشد  همراه آنها رنگ­هایی نیز بارگذاری می­گردد. زایلن سیانول (آبی کم رنگ) به همراه مولکول های بزرگ DNA مهاجرت می کند ، اما بروموفنل بلو )آبی تیره)همراه با با قطعات کوچک تر DNA مهاجرت می کند.
همچنین طی بارگزاری نمونه ها یک مارکر DNA نیز در چاهک جداگانه ای افزوده می شود. این مارکر حاوی قطعاتی از مولکول DNA با وزن های مشخص می باشد که برای تخمین وزن مولکول های DNA مورد استفاده قرار می گیرد. باید در نظر گرفته شود که حرکت مولکول های حلقوی DNA )مانند پلاسمید( متفاوت از حرکت مولکول­های خطی DNA می باشد و نمی توان با مارکر های معمول به تخمین وزن آنها پرداخت. از این رو لازم است قبل از ران نمودن آنها بر روی ژل با استفاده از آنزیم­های محدود الاثر آنها را به صورت خطی در آورد.

.مشاهده پرایمر دایمر
علت : اتصال پرایمرهای رفت و برگشت به یکدیگر
.عدم مشاهده باند
علت :
1 .عدم اتصال پرایمر به محل مورد نظر بر روی الگو
۲ .اختصاصی نبودن پرایمرها
۳ .ست آپ نبودن میزان هر یک از اجزای PCR و یا برنامه دمایی
۴ .غلظت پایین نمونه الگو

.مشاهده اسمیر
علت :
1 .غلظت بالای DNA الگو
۲ .تکثیر غیر اختصاصی قطعاتی با سایزهای مختلف
۳ .وجود آلودگی Dna

.مشاهده باند غیراختصاصی
علت : اتصال غیر اختصاصی پرایمرها به الگو

تهیه کننده : هاوری فاتحی