فاکتورهای همانند سازی
DNA پلیمرازها
در پروکاریوت و یوکاریوت
و
بررسی پروکاریوتیک:
خصوصیات DNA پلیمرازها:
دارای ساختار شبیه دست راست
Palm(کف دست): فسفریل ترانسفری
Finger(انگشت):موقعیت DNA وجابجایی
Thumb(شست):پلیمرازی
DNA پلیمرازهای E. coli
E.coli سه DNAپلیمراز شناخته شده با خصوصیات فیزیکی و نقش های متفاوت درسلول دارد:
پلیمراز I II III
پلیمریزاسیون 5 به 3 بله بله بله
اگزونوکلئازی 3 به 5 بله بله بله
اگزونوکلئازی 5 به 3 بله _ _
عملکرد عمده : همانند سازی ترمیم همانند سازی
و ترمیم
DNA پلیمراز های IV و V که در سال 1999 کشف شدند در ترمیم نقش دارند.
DNA پلیمراز I
دارای دو قطعه بزرگ و کوچک:
1- قطعه بزرگ (klenow fragment) : 79کیلو دالتن
دارای پایانه کربوکسیل – دارای یک شکاف 2نانومتری که درونش با بار
های + مفروش است ومحل مناسبی برای اتصال BDNA است .
دارای فعالیت :پلیمرازی 5 به 3
اگزونوکلئازی 3 به 5
خاصیت پلیمرازی اش در انتهای C ترمینال وخاصیت اگزونوکلئازی اش در انتهایN ترمینال است .
نقش درproof reading (حذف خطاها)
اولین انزیم کشف شده با فعالیت پلیمرازی
2- قطعه کوچک : 35 کیلو دالتن
دارای پایانه N
فقط خاصیت اگزونوکلئازی 5 به 3
اعمال : – حذف پرایمر
– ترمیم برشی (Excision Repair)
– پر کردن gap (Nick translation)
کمپلکس DNA با پلیمرازI :
DNAپلیمراز III
-900 کیلودالتن – به صورت هلوانزیم
به صورت یک هلوانزیم عمل میکند – متشکل از چندین زیرواحد:
1- یک جفت core انزیم:
– : α سنتزDNA (مرکز کاتالیتیک) (dnaE)
-ε : Proof Readingناشی از فعالیت اگزونوکلئازی3به5 ( dnaQ)
-θ : تجمع زیر واحد ها – تحریک کننده اگزونوکلئاز(hol E)
قطعه klenow یDNAPOL III شکلی تا حدودی شبیه بادست راست دارد:
2- کمپلکس گاما( clamp loader ): شامل :گاما-δ- χ- δ́- φ در تشکیل clamp loader فعالیت دارد.این باعث میشود انزیم روی رشته راحت حرکت کند.
گاما به coreانزیمی که رشته پیرو را می سازد متصل وقابلیت سنتز قطعات اکازاکی مجزا را به ان می دهد. لذا چون هلوانزیم فقط یک کمپلکس گاما پس نامتقارن است.
کمپلکس گاما مسئول اضافه شدن دایمرهای ßبه هررشته DNAوالدینی است.
A:هلوانزیمDNA POL III B: نمای روبروی کمپلکس کاما C:نمای مشابه شکلB ولی بدونδ-δ́ D:نمای بالا با تاکید بر ساختار مارپیچC ترمینال
E:نمای تحتانی نشان دهنده حالت نامتقارن
A
B
C
E
D
3- دو جفت زیر واحد ß (Clamp) :
ساختمانی است که حلقه یا گیره ای را میسازد و باعث اتصال DNAپلیمراز به رشتهDNA می شود. زیرواحد ßدر شناسایی OHازاد پرایمر نقش دارد.
سرعت هلوانزیم را زیاد میکند وباعث تسهیل وافزایش حرکت انزیم میشود.
4- یک جفت Τ (تاو):
دوتا Coreانزیم رابهم متصل می کند.لذا این کمپلکس در پایداری ساختاری که دایمراست دخالت میکند.
گفته می شود که این زیرواحد با DnaB (هلیکاز اصلی) در ناحیه چنگال همانندسازی متصل و این اتصال باعث افزایش فعالیت هلیکازی میشود.
ابزارهای همانند سازی
– پریماز: نیاز به وجود گروه 3- هیدروکسیل ازاد رابا سنتزRNA پرایمر براورده می کند. (ساختن RNA پرایمر برای شروع پلیمریزاسیون ِDNA)(11نوکلئوتید در invivo و تا 60 نوکلئوتید RNA در invitro سنتز میکند.
DNA- پلیمراز: انتخاب نوکلئوتیدهای صحیح واتصال ان ها به هم
C-ترمینال
N-ترمینال
مرکز کاتالیتیک
ZINC FINGER
برهمکنش پروتئینی
A:اتصال به DNA :Bاتصال نوکلئوتید C:شروع ساختن پرایمر D:طویل شدن پرایمر
ٍٍٍE:امدن پلیمراز- خروج پرایمر
-لیگاز: اتصال رشته های DNA مجاور به هم(پر کردن شکاف)
واکنش کاتالیز شده با DNA لیگاز E.Coli :
مجموعهAMP – لیگا ز به 5-فسفات برش خورده می چسبد سپس باند فسفودی استربا سر 3-OH برش خورده شکل میگیرد ودر نهایت انزیم وAMP ازاد میشوند.
لیگازبرای انجام عمل خود نیاز به انرژی دارد که ممکن است از ATP (درT4-T7- پستانداران) یا NAD(باکتری ها) بدست اید.
برقراری اتصال فسفودی استر کوولانت بین 3-هیدروکسیل و 5-فسفات
انزیم های دخیل در حذف پرایمر و پر کردن شکاف:
اخرین پیوند فسفودی استر توسط لیگاز
حذف پرایمر: پلیمراز با داشتن فعالیت اگزونوکلئازی 5به3
پلیمرازشکاف راپر می کند DNA
لیگاز
حذف RNAومقداریDNA
– هلیکاز: هگزامر- اتصال به DNA دو رشته وباز کردن ان با صرف ATP
هلیکاز دورشته ای باDNA دورشته برهم کنش میکند. تغییرات کنفورماسیونی پروتئین و هیدرولیز NTP منجر به جداشدن جفت بازها میشود.
– پروتئین متصل شونده به تک رشته : (SSBP)
به صورت تترامر (نوع یوکاریوتی تریمراست)
اتصال بهDNA تک رشته که توسط هلیکاز ایجاد شده وساختارتک رشته را ثبات می بخشد. فقط دو زیرواحد ان با DNA از طریق برهم کنش الکتروستاتیک باسرهای فسفات برهم کنش می کند.
وقتی این پروتئین ها به تک رشته چسبیده اند هانندسازی 100 برابر سریع تر است.
DNA -گیراز:
DNA توپوایزومرازIIپروکاریوتی
اجازه چرخش یک رشته حول دیگری را به عنوان یک حلقه گردان می دهد.
گیراز DNAرا می برد
توپوایزومراز پروکاریوتی:
توپوایزومراز I :
نام قدیم:پروتئین امگا
ایجاد شکاف در یک رشته و بطورموقت یک پیوند کووالانت مابین انتهای فسفات DNA وعاملOH تایروزین توپوI ایجاد میشود (باندفسفوتایروزین) . چون شکاف در یک رشته ایجاد شده رشته دیگر میتواند خود را از ورای این شکاف بیرون کشد و یک پیچ کم شود. بعد ازعبوررشته رشته دوم ازورای شکاف , شکاف رشته اول توسط لیگاز پر میشود.
توپوI برای عمل خود نیاز به صرف ATP ندارد.
کمپلکس توپوI/ DNA:
– توپوایزومرازII:
نام دیگر در E.Coli:DNA گیراز
اکر به هرعلتی یک فراپیچ مثبت کنار یک فراپیچ منفی ایجاد شود, مثل حالتیکه درهمانندسازی درجلوی چنگال ایجادمیشود,توپوII ابتدا پیچ مثبت را ازبین می برد وحالت relaxایجادمیشود و چون relaxپایدار نیست تبدیل به سوپرکویل منفی میشود.
توپوII برای انجام عملش نیاز به صرف ATP دارد.زیرا توپوII بعد عمل تبدیل سوپرکویل به استراحت برای بازیابی شکل اولیه اش نیازبه ATP دارد.
نقشDNA گیراز:
هلیکاز
نقشDNA گیراز:
گیراز
نقشDNA گیراز:
گیراز
نقشDNA گیراز:
گیراز
نقشDNA گیراز:
گیراز
نقشDNA گیراز:
گیراز
نقشDNA گیراز:
گیراز
نقشDNA گیراز:
گیراز
نقشDNA گیراز:
گیراز
نقشDNA گیراز:
گیراز
اغازهمانند سازی در E.Coli:
اغاز همانندسازی ازمکانی به نام OriC شروع میشود که این ناحیه شامل245جفت باز است.
و شامل نواحی خاصی است:
– ناحیه غنی از T
– باکس Dna A : که Dna A روی ان می نشیند
– جایگاه متیلاسیون GATC
پروتئین های لازم برای شروع همانندسازی:
– Dna A
– Dna B
– Dna C
– فاکتور HU
– DNA گیراز
– پروتئین های متصل شونده به تک رشته( SSBP )
تکرارهای13جفت بازی
( غنی از AT)
تکرارهای 9جفت بازی
Ori C
DnaA -:
تترامر-اولین فاکتوری که رویOriC مینشیند.مونومرهای ان با نواحی mer9 اتصال و با کمک ATP کمپلکس ابتدایی میسازندوشروع به باز کردن DNA از mer13 میکند.
DnaA تا زمانی که زنجیره DNA به صورت فراپیچ منفی در نیامده نمی تواند روی باکس DnaA بنشیند وعمل باز شدن DNA را اغاز کند.
محل های اتصال برای DnaA
توالی mer 13 پشت سرهم(AT-rich)
́3-GATCTNTTNTTTT-́5
́5-CTAGANAANAAAA-́3
با بازشدن زنجیر DNA وشروع همانندسازی, DnaA ازDNA جدا میشود.
– Dna B:
انزیم هلیکاز اصلی – معمولا به صورت یک هگزامر- دورشته را باز میکند.
پس از انکه DnaA روی سایتش مینشیند وشروع به باز کردن تعدادی نوکلئوتید میکند, حال نوبت DnaB است که بیاید ونوکلئوتیدهای بیشتری رابازکند.
عمل هلیکازی با صرف ATP است.
́5
́3
́3
́5
رشته پیشرو
رشته پیرو
– Dna C:
پروتئین یک بخشی – نقش حامل DnaB را برعهده دارد.
هر6 مولکول DnaB یک هگزامر DnaCرا حمل میکند.
پیچش DNAی OriC دور DnaA سبب میشود ناحیه غنی از ATدناتوره شود.سپس برای باز شدن بیشتر احتیاج بهDnaB است.DnaB همراه DnaC می اید.همین طور SSBP می اید.DnaC پس از انجام عمل خود یعنی حمل DnaB جدا می شود.
DnaA
DnaB
– DnaG :
همان پریماز است. مسئول ساختن RNA پرایمر لذا یک RNA پلیمراز محسوب میشود.
معمولا در ارتباط با هلیکازDnaB قرارمی گیرد وتشکیل کمپلکس پرایموزوم میدهد.
به عبارتی کمپلکس پرایموزوم شامل:پریماز(DnaG),
پروتئین های وابسته به پریماز(́ n-˝ n – DnaT(i) ) ,
DnaB و DnaC است.
نقش هلیکازی وابسته بهATP
│
←
– فاکتور HU : (HU1/HU2)
برای شروع همانندسازی فاکتور اصلی نیست. شاید در Bending(خم کردن DNA) نقش دارد (نقش در تغییرات ساختمانی DNA) . به هیستون ها شباهت دارد.
چنگال همانند سازی:
قطعه اکازاکی
رشته پیرو
رشته پیرو
رشته پیشرو
DNA پلیمراز
DNA پلیمراز
هلیکاز
توپوایزومراز
پریماز
قطعه اکازاکی
پروتئین متصل شونده به تک رشته (SSBP)
DNA مادری
Clamp loader
Sliding clamp
∆ شکلی دیگر از چنگال همانند سازی:
پروتئین هایی که در فرایند همانند سازی نیاز به دارند:
ATP
هلیکاز: برای باز کردن دو رشته
گیراز: برای چرخاندن دو رشته
پریماز: برای شروع
DNA پلیمرازIII: برای فعال شدن
بررسی یوکاریوتیک:
DNA پلیمراز یوکاریوتی
پلیمراز α(الفا) ß(بتا) Ύ(گاما) δ(دلتا) €(اپسیلوم)
پلیمریزاسیون + + + + +
́5 به ́ 3
اگزونوکلئازی – – + + +
́ 3 به ́ 5
DNA پلیمراز Υ(گاما) مربوط به همانندسازی ژنوم میتوکندری است .
DNA پلیمرازα(الفا) (III):
فسفو پروتئین هترو تترامریک – دوکاره – شروع کننده سنتز هردو رشته پیشرو وپیرو
و دارای فعالیت پریمازی . در یوکاریوتها برای همانندسازی رشته lagging نیاز به پریماز نیست زیرا DNAپلیمرازα خود نقش پریمازی دارد و RNA پرایمر را در ابتدای هر قطعه اکازاکی میسازد, لذا این انزیم DNA پلیمراز α-پریماز نامیده می شود. پرایمر شامل هم RNA وهم طول کوتاهی (20 نوکلئوتید) DNA است.
متشکل از 4 زیرواحد:
180 کیلودالتن: دارای فعالیت پلیمرازی (RNA پرایمر را با ساختن iDNA کوچک -20 الی 30 باز- گسترش می دهد
70 کیلودالتن: نقش متوازن کننده زیرواحد ها(فاقد فعالیت کاتالیتیک شناخته شده)
48 و 58 کیلو دالتن:دارای فعالیت پریمازی
فاقد فعالیت اگزونوکلئازی و متعاقب ان فاقد فعالیت Proof Reading ( استثنا: دروزوفیلا )
DNA پلیمراز δ(دلتا) (III) :
مسئول ادامه سنتز رشته پیشرو(Leading)
دارای دو زیرواحد 125و 48 کیلودالتنی
برای عمل خود به PCNA(انتی ژن هسته ای تکثیرشونده) نیاز دارد. فاکتور C همانندسازی پلیمراز الفا را از پرایمر جابجا می کند سپس PCNA راجذب می کند و اجازه سنتز توسط پلیمراز دلتا داده میشود.
دارای فعالیت ProofReading – دارای برهم کنش با فاکتور C ( RF-C ) و PCNA .
DNAپلیمرازß (بتا):
نقش در ترمیم(Base excision repair)
39 کیلودالتن – ساختارش شبیه قطعه Klenoew از DNA پلیمرازI پروکاریوتی است.
یک دومن 8 کیلو دالتنی نزدیک انتهای امینو و یک دومن 31 کیلودالتنی درانتهای کربوکسیل قرارگرفته شبیه Finger , Palm و Thumb دست راست
به محض اتصال DNA یک تغییر عمیق در کنفورماسیون دومن 8 کیلودالتنی رخ می دهد بظوریکه رشته DNA را در بر بگیرد.
DNA پلیمراز € (اپسیلوم) (II) :
DNA پلیمراز ß همراه با DNA :
دارای دو زیر واحد 258و 55 کیلودالتنی -نقش در ترمیم
ممکن است در ساختن رشته پیرو درگیر باشد. به هر حال اعمال دیگری هم دارد.
بر خلاف DNA پلیمراز دلتا احتیاج به PCNA ندارد.
به انتهای 3- OH ازاد از i DNA متصل DNA پلیمراز دلتا به همراه PCNA همانند سازی را تا انتها ادامه می دهند.(clamp loader)( اوردنPCNA روی رشته )
فعالیتATP ازی اش برای باز کردن حلقه PCNA بکار می رود .
یک نوع هلیکاز است. دارای زیرواحدهای 36.5 – 37- 38 -40- 145کیلودالتنی
گفته می شود در راهنمایی DnaB به چنگال همانندسازی نقش دارد.
– فاکتور همانند سازی C (RF-C) :
– انتی ژن هسته ای تکثیر شونده (PCNA) :
به صورت ترایمر حلقه ای دور DNA تشکیل میدهد .
سبب افزایش ااتصال انزیم به رشته الگو (Processivity) می شود (عمل مشابه ß clamp) .
و باعث سرعت انزیم در همانند سازی می شود.
– فاکتور همانند سازی A (RF-A) :
پروتئین متصل شونده به تک رشته
(SSBP)
– اگزونوکلئاز MF1(FEN-1) :
برداشتن RNA پرایمر
– انتی ژن Tهلیکاز :
معادل DnaA پروکاریوتی –
نقش در شناسایی و باز کردن محل شروع همانند سازی
در اوردن(loading) هلیکاز نقش دارد.
DNA – لیگاز I :
درز بندی شکاف ها
حذف قطعات اکازاکی در پستانداران:
اندونوکلئاز RNAsa HI : ( مخصوص برای هیبرید DNA-RNA )
– اگزونوکلئاز FEN 1 : حذف RNA به صورت ́5 به ́3
عملکرد های مشابه در چنگال همانند سازی باکتریایی و پستانداران :
هلیکاز
اوردن هلیکاز
اتصال به تک رشته
سنتز پرایمر
Sliding clamp(گیره لغزنده)
Clamp loading(اوردن گیره)
کاتالیز
دایمریزاسیون هولو انزیم
حذف RNA
اتصال (لیگاسیون)
DnaB
DnaC
SSB
DnaG
ß
Υδ
Core پلیمراز III
Τ(tau )
DNA پلیمراز I
لیگاز
انتی ژن T
انتی ژن T
اگزونوکلئازMF1
لیگاز1
RF-A
DNA پلیمراز /αپریماز
PCNA
RF-C
DNA پلیمراز δ(III)
؟؟؟
رده بندی انواع توپوایزومرازها
تلومراز:
انزیمی است که به صورت نوکلئوپروتئینی است.(کمپلکسی از پروتین و اسید نوکلئیک از جنس RNA )
یک نسخه بردار معکوس ( revers transcriptase ) است, زیرا توالی DNA رااز الگوی RNA ای سنتز می کند. به عبارتی قطعه RNA ای تلومرازبه عنوان الگویی برای ایجاد توالی های تکراری در تلومرقرار می گیرد.
تلومراز درسلول های سوماتیکی بعد از تمایز سلول غیر فعال می شود ولی در سلول های جنسی و سلول های سرطانی فعال است و باعث ثابت نگهداشتن طول تلومر می شود.
RNA الگو
نوکلئوتید
← DNA
تلومراز:
در انتهای خطی کروموزوم ها رشته پیرو نمی تواند کامل شود زیرا اخرین پرایمر برداشته شده وگروه هیدروکسیلی دردسترس برای انزیم DNA پلیمراز نیست.
تلومر
حذف RNA پرایمر انتهای 5
همانندسازی بعدی
GGGTTG
تلومراز یک کمپلکس ریبوپروتئینی است که نوکلئوتیدهارا به انتهای کروموزوم اضافه می کند و طول انها را به حالت اول بر می گرداند.
GGGTTG
GGGTTG
تلومراز یک کمپلکس ریبوپروتئینی است که نوکلئوتیدهارا به انتهای کروموزوم اضافه می کند وطول انها را به حالت اول بر می گرداند.
GGGTTG
GGGTTG
GGGTTG
سکا نس تلومری تکراری TTGGGG می تواند تشکیل یک hairpin را که ناشی از جفت شدن نامعمول بازهای GC است را بدهد.
5’GACCGAGCCTCTTGGGTTGGGGTTGGGG
3’GTTGGGG
3’CTGGCTCGG
T
T
GGGGTTG
DNA
پلیمراز
5’GACCGAGCCTCTTGGGTTGGGGTTGGGG
AGAACCCAACCCGTTGGGG
3’CTGGCTCGG
T
T
DNA
پلیمراز
5’GACCGAGCCTCTTGGGTTGGG
3’CTGGCTCGG
AGAACCCAACCC
پروتئین ها و ژنهای مورد نیاز برای پیشرفت چنگال وپایان همانند سازی :
By: SADEGH BABASHAH
SCIENCE & RESEARCH UNIVERSITY
DEC,2006