1
DNA استخراج
DNA Extraction
2
چیست؟DNA
DNA ماده وراثتی موجود در هسته سلولها، مولکولی دو رشته ای است که از اتصال میلیونها جفت نوکلئوتید به یکدیگر ساخته شده است.
DNA مسئول توارث است و ترتیب اسید آمینه را در پروتئین تنظیم می کند .
نوکلئوتیدها مانند نردبان پشت سرهم ردیف شده اند و بازهای آلی
در دورشته به فاصله مشخص پله های این نردبان را تشکیل داده اند.
DNA به علت داشتن گروههای فسفات دارای بارالکتریکی
منفی است.
3
4
استخراج
برای استخراج DNA از عصاره هسته، در اولین مرحله باید غشای سلول و هسته تجزیه شود.
معمولاً از روشهای فیزیکی، مکانیکی و شیمیایی برای این کار استفاده می شود.
کاربرد DNA استخراج شده و نوع سلول هدفی که DNA از آن استخراج می شود، روش تجزیه کردن سلول را تعیین می کنند.
5
DNA استخراج کاربرد
دانشمندان DNA را برای مقاصد مختلفی استخراج می کنند، از قبیل :
شناسایی جسد
آنالیز شواهد جنایی
آزمایش ژنتیکی
و …
6
DNA منبع
همه سلولهای هسته دار، DNA دارند.
در بافتهایی مثل خون فقط گلبولهای سفید مثل لنفوسیتها DNA دارند.
گلبولهای قرمز و پلاکتها که فاقد هسته اند DNA ندارند.
منبع انسانی DNA بطورمعمول عبارتند از:
سلولهای خون محیطی
نمونه های ادرار
نمونه های مدفوع
اسمیرهای سلولی
ریشه مو
مایع منی
مایع مغزی نخاعی
مواد بیوپسی
مایع آمنیوتیک
ویلوس های کوریونیک و جفت و…
7
ضرورت یک روش استخراج DNA
– بیشینه سازی بازیابی DNA – حذف بازدارنده – حذف و یا مهار nucleases – به حداکثر رساندن کیفیت DNA – تهیه سوبسترا برای مطالعات ژنتیکی(RFLP و PCR)
8
روش های استخراج
DNA
9
DNA استخراج
روش های گوناگونی برای استخراج DNA از سلول های یوکاریوت وجود دارد که براساس متلاشی کردن غشا سلولی و پوشش هسته با استفاده از دترجنت ها ، حذف پروتئین ها با استفاده از مواد شیمیایی و رسوب دهنده های پروتئین نظیر
فنل-کلروفرم و یا استفاده از محلول های نمکی با غلظت بالا، و نهایتا رسوب DNA با الکل و انحلال آن در بافرهای نگهدارنده و یا آب می باشد.
10
dnaروشهای تخلیص
نقطه شروع بسیاری از روشهای بیولوژی مولکولی ضرورت جداسازی DNA با کیفیت عالی است.
کیفیت DNA با عوامل زیر سنجیده می شود:
– عدم آلودگی ناشی از RNA ، لیپید و سایر ساختارهایی که برای آنزیمهای برشی و پلیمرازها مزاحمت ایجاد می کنند .
– به علت بزرگ بودن اندازه مولکول DNA ، روشهای استخراجی باید حداقل استرس مکانیکی را در طی مراحل استخراج ایجاد نمایند .
11
dnaروشهای تخلیص
١- تخلیص DNA از خون:
روش فنل – کلروفرم، روش Salting out، روش جوشاندن، روش اسید – گوانیدیوم – فنل – کلروفرم ( AGPC ) و…
٢- تخلیص DNA از بافت:
روش آنزیم تریپسین، روش جوشاندن، ( AGPC )، روش TRIzoL و DNAzoL
12
Salting outروش
١- تخریب غشای سلولی و آزاد کردن DNA
– لیز کردن گلبول های قرمز(آب سرد)
– حذف هموگلوبین و سایر اجزا موجود در پلاسما(سانتریفیوژ)
– لیز کردن غشا لکوسیتی و در مرحله بعدی غشا هسته ای(دترجنت)
٢- جدا کردن مولکول های DNA از پروتئین ها و رسوب پروتئین ها
– پروتئینازK
– SDS
– NaCl : u=1/2Ʃcz2
c: غلطت نمکی
z:بار الکتریکی هر یون
13
14
15
16
Salting outروش
٣- رسوب دادن DNA محلول
– اتانول سرد یا ایزوپروپانول سرد
٤- نگهداری رسوب DNA
– در آب مقطر یا بافر TE(تریس-EDTA) PH=7.5
17
کاربرد مواد
آب سرد: به عنوان یک لیز کننده برای لیز کردن RBC ها استفاده می شود.
:TES شامل(تریس(T)، EDTA(E)، سدیم کلراید(S)):
– EDTA(E): غیر فعال کننده نوکلئاز ها از طریق مهار یون های لازم جهت فعالیت این آنزیم ها و از طرف دیگر بدلیل مقدار املاح مناسب باعث پایداری DNA می شود.
:SDS(10X) برای دناتوره کردن پروتئین ها و فعالیت بهتر آنزیم پروتئولیتیک
پروتئیناز:K پروتئینهای هیستونی و غیرهیستونی در DNA را تخریب می کند .
NaCl(نمک اشباع): برای رسوب دادن پروتئین ها.
اتانول مطلق سرد( یا ایزوپروپانول): برای آبگیری از رشته های DNA.
TE: شامل (تریس و EDTA) می باشد که برای حل کردن و نگهداری DNA استفاده می شود.
18
روش کار مرحله اول
١- µl ٥٠٠ خون + µl ١٠٠٠آب مقطر سرد داخل یک میکروتیوب
٢- سانتریفیوژ با دور ١٣٠٠٠به مدت یک دقیقه
٣- تکرار مرحله ٢ سه مرتبه همراه با مخلوط کردن
٤-µl ٢٥٠ بافر TES را با رسوب باقیمانده مخلوط کرده
٥- µl ٢٥محلول SDS 10 % اضافه کرده
٦- µl ٢٥ پروتئیناز K اضافه کرده
٧- میکروتیوب را بسته به مدت ١تا ١/٥ساعت در ٣٧ درجه
19
روش کار مرحله دوم
٨- µl ٢٥٠ نمک اشباع را به میکروتیوب مرحله اول اضافه کرده
٩- خوب مخلوط کرده و سانتریفیوژ با دور ١٣٠٠٠ به مدت ١٢دقیقه
١٠- خالی کردن محلول رویی داخل یک میکروتیوب
١١-µl ٥٠٠ ایزوپروپرانول الکل به میکروتیوب اضافه کرده ومخلوط می کنیم
رسوب DNA دیده می شود.
١٢- سانتریفیوژ با دور ١٣٠٠٠به مدت یک دقیقه
20
21
روش کار مرحله دوم
13- µl 1000 اتانول سرد اضافه کرده مخلوط می کنیم .
14- سانتریفیوژ با دور 13000 به مدت یک دقیقه
15- تکرار مراحل 13 و 14
16-خالی کردن الکل اضافی و خشک شدن رسوب
17- اضافه کردن µl 25 از محلول TE یا آب مقطر به رسوب
18- یک شب بماند سپس اندازه گیری و تست روی آن انجام می شود.
22
Dna عوامل موثر در استخراج
١- PH محیط
٢- دما
٣- قدرت یونی مولکولی
٤- غیره
23
استخراج شدهDNAبررسی کیفیت
برای بررسی کیفیت DNA استخراج شده :
µl10 از نمونه را برداشته با یک قطره loading buffer مخلوط کرده و در ژل آگاروز 0/8% الکتروفورز می کنند.
24
بررسی کمیتDNA استخراج شده
برای بررسی کمیتDNA استخراج شده :
µl٢ از نمونه را در µl١٠٠٠ بافر TEحل کرده و با دستگاه اسپکتروفتومتری جذب نوری نمونه در ٢٦٠ نانومتر (طول موجی جذبیDNA ) و ٢٨٠ نانومتر(طول موجی جذبی پروتئین) اندازه گیری شده و سپس نسبت جذب نوری ٢٨٠ به ٢٦٠ نانومتر محاسبه شده که مقدار مناسب برای آزمایش PCR کمتر از ٢ می باشد.
برای محاسبه مقدار DNA از فرمول زیر استفاده می شود:
DNA( ng/µl یا ( µg/ml = 50×200×260OD (جذب نوری در 260 نانومتر)
25