تقنیه التحضیرات المعملیه رمز و رقم المقرر : حیا 1122
الفرقه الاولی قسم الاحیاء
محتوی المقرر
مقدمه عن التقنیه المجهریه
دراسه علی بعض اجهزه التقنیه (المجاهر الضوئیه – اجهزه القطع- المجهر الالکترونی )
دراسه التحضیرات المجهریه الضوئیه
طرق تحضیر العینه بعد التثبیت
طرق تحضیر العینه کامله ( الهرس-النسر-الدعک-الفرد )
طرق تحضیر عینات المجهر الالکترونی النفاذ
طرق تحضیر العینات النباتیه
طرق التحمیل
طرق تجهیز العینات النباتیه
طرق الحفظ الجاف للحشرات (ا- حفظ الحشرات الناضجه ب- حفظ الاطوار غیر الکامله )
لمحه عن البصریات الضوء ینتقل فی الفراغ بسرعه ثابته لکنه اذا انتقل خلال وسط معین کالهواء او الماء او الزجاج فان سرعته تتغیر وکل وسط ینتقل فیه الضوء بسرعه معینه .
العلاقه بین سرعه الضوء فی الفراغ وفی ای وسط آخر بمعامل الانکسار ( معامل الانکسار = سرعه الضوء فی الفراغ / سرعته فی الوسط الاخر )
سرعه الضوء فی الهواء قریبه جدا من سرعته فی الفراغ ولذا یعتبر معامل الانکسار للهواء مساویا للواحد لکن معامل الانکسار للزجاج عاده یساوى 5و1لذا نجد ان سرعه الضوء فی الزجاج تکون بطیئه .
اشعه الضوء تنکسر عندما تنتقل بین وسطین لکل منهما معامل انکسار یختلف عن الاخر ویعتمد علی شییئین هما
1- معامل الانکسار 2- الزاویه التی یصطدم عندها الشعاع بالوسط الثانی
عندما تسقط اشعه الضوء عمودیا علی الوسط فانه لا یحدث لها انکسار بل تستمر علی نفس المسار ( زاویه السقوط = زاویه الانکسار = 90 )
عندما تسقط الاشعه علی الوسط بزاویه معینه تقل عن الزاویه القائمه فان مسار الاشعه سوف ینکسر خلال الوسط بنفس زاویه السقوط کلما نقصت زاویه السقوط (س) کلما نقصت زاویه الانکسار (س“) وبنسبه ثابته تعادل معامل الانکسار (س= م) ودائما تکون زاویه السقوط اکبر قلیلا من زاویه الانکسار .
عندما تسقط اشعه ضوئیه متوازیه علی سطح عدسه زجاجیه محدبه فان هذه الاشعه المتوازیه سوف تسقط علی سطح العدسه المحدب بزوایا مختلفه نظرا للتحدب ای ان زوایا الانکسار سوف تکون هی الاخری مختلفه مما یودی الی تلاقی هذه الاشعه فی نقطه تعرف بالبوره وتعرف المسافه الفاصله بین البوره (ب) و المرکز البصری للعدسه (م) باسم البعد البوری
تکون الصور وتکبیرها بالعدسات البسیطه
لکیفیه تکون الصور وتکبیرها بالعدسات لابد من فهم الاتی:-
1- الشعاع الذی یسقط موازیا للمحور الرئیسی للعدسه ینکسر مارا بالبوره
2- الشعاع الذی یسقط مارا ببوره العدسه ینکسر موازیا لمحورها الرئیسی
3- الشعاع الذی یسقط مارا بالمرکز البصری للعدسه لاینکسر اطلاقا
تستطیع العدسه المحدبه ان تکون ست صور مختلفه لای جسم تبعا لموقعه امام هذه العدسه ومدی بعده او قربه منها
العدسه المحدبه تستطیع ان تکبر الجسم الموضوع امامها فی حالتین :-
1- یقع الجسم فیها قبل البوره وتتکون له صوره خیالیه معتدله .
2- یقع الجسم خلف البوره وبمسافه تقل عن ضعف البعد البوری وفی هذه الحاله یتکون للجسم صوره حقیقیه مقلوبه مکبره
کلما قرب الجسم من البوره کلما زادت قوه تکبیر الصوره
عندما یقع الجسم فی البوره تماما عندها تتکون للجسم صوره تقع فی اللانهایه
المجاهر الضوئیه البسیطه جهاز التکبیر عباره عن آداه علمیه لها القدره علی تکبیر وتوضیح العینات الصغیره جدا وبالذات تلک التی یستحیل رویتها بالعین المجرده مثل الخلایا الحیوانیه و النباتیه ویعتمد جهاز التکبیر علی الاستفاده من خاصیه العدسات
ترکیب المجهر البسیط
تعرف المجاهر الضوئیه البسیطه باسم العدسات المکبره ویعتمد علی مصدر ضوئی طبیعی او کهربائی .
توجد عده انواع تختلف من حیث التصمیم وتشترک جمیعا فی صفه واحده هی ان لها عدسه واحده محدبه الوجهین .وقوه تکبیر المجاهر تکون محدوده تتراوح بین 5الی 25 مره .
کانت هوایه لوفینهوک هی صقل العدسات ومنها تمکن من صنع مجهره البسیط
تمتاز المجاهر البسیطه بانها تعطی صورا معتدله و حقیقیه للاشیاء کما ان الصوره المکبره خالیه من الزیغ اللونی او الکروی .
عیوب المجاهر البسیطه انها تحتاج الی تقریب وبشکل ملفت للعین – حقل الرویه محدودا – صعوبه فی تحمیل واضاءه العینه المراد فحصها .
انواع المجاهر البسیطه
مجهر لیوفینهوک
عدسه الساعاتی
عدسه الجیب
عدسه الید
عدسه الطاوله
المصباح المکبر
( الشرح من الکتاب )
مجهر روبرت هوک
المجاهر الضوئیه المرکبه
یمتاز هذا النمط بقوی تکبیر اعلی
تشترک جمیعا فی صفه واحده هی ان لها جهاز بصریا مکبرا مکونا من نوعین من العدسات
1- العدسات الشیئیه : هی التی تکون دوما بالقرب من الشئ المراد فحصه
2- العدسات العینیه : هی التی تنظر العین من خلالها
انواع المجاهر الضوئیه المرکبه :
1- المجهر مضئ الحقل
2- المجهر مظلم الحقل
3- مجهر الطور المتباین
4- المجهر الفلورسینی
5- المجهر المقلوب
6- مجهر متداخل الضوء
ترکیب المجهر المرکب ( المجهر الضوئی المرکب )
یمکن تجزئه المجهر الضوئی المرکب من حیث الترکیب الی ثلاث مجموعات هی :
1- جهاز الحمل و التحریک
2- جهاز التکبیر
3- جهاز الاضاءه
( الشرح فی الکتاب )
طرق التحضیر المجهریه
الخطوات او العملیات التی تستعمل فیها معدات او اجهزه علمیه وطرق تحضیر دقیقه تسهل على الدارس معرفه ماهیه التراکیب الخلویه المکونه لجسم الکائن الحی
اذکری اهم الاجهزه العلمیه ذات الصله الوثیقه بالتحضیرات المجهریه؟
المجاهر
اجهزه التقطیع
اجهزه التبرید
اجهزه التسخین
اجهزه الطرد المرکزی
الطرق الاکثر شیوعا لتحضیر العینات المجهریه
طریقه الحصول على العینه من الکائن الحیوانی:
تعتمد هذه الطریقه على الهدف المقصود اثناء الدراسه
یفضل معامله الکائن الحیوانی بطریقه انسانیه
اهم الطرق للحصول على العینه من الکائن الحیوانی
الذبح
التخنیع
الضرب على موخره الراس
التخدیر
الذبح
اسهل العملیات واسرعها على الحیوانات الفقاریه
شروطها:
الامساک الجید بالحیوان
استعمال سکین او شفره حاده جدا
تتم عملیه الذبح بقطع اورده وشرایین الرقبه مع القصبه الهوائیه والبلعوم
التخنیع
شل الحیوان شلا کاملا وذلک بفصل الحبل الشوکی عن الجهاز العصبی المکزی او المخ
تتم هذه الطریقه:
بغرز ابره التشریح الحاده فیما بین الفقره الاولى من الفقرات العنقیه والجمجمه حتى تصل الى الحبل الشوکی
تحرک هذه الابره یمنه ویسره حتى نضمن الانفصال التام للحبل الشوکی عن الجهاز العصبی
تطبق هذه الطریقه على: الضفادع والغزلان
ضرب موخره الراس
تتم بعمل ارتجاج مخی مفاجئ وبشکل سریع بحیث یصبح الحیوان بعدها فی حاله غیبوبه تامه
تناسب الحیوانات الصغیه مثل الضفادع والفئران
التخدیر
یجب ان یقوم بها موهلون
یعتمد نوع المخدر على طبیعه البحث ونوع الحیوان
یفضل عدم استعمالها فی الدراسات الخلویه
تستعمل فی حاله دراسه کیفیه قیام الاعضاء بوظیفتها والدراسات النسیجیه
انواع التخدیر
الماده المخدره غیر القاتله: تخدیر الحیوان لفتره زمنیه محدده بحیث یحدث بعدها انعاش للحیوان
الماده المخدره القاتله(القتل الرحیم): تعریض الحیوان الى ماده مخدره قویه تودی بالنهایه الى موته
اهم المخدرات
للحیوانات المائیه:الایثانول &کلورید المنغنیز &المنثول
الحیوانات اللافقاریه: ابخره الایثر
البرمائیات والزواحف: طبیعیا بتعریضها لدرجه حراره منخفضه
انواع المخدرات الحیویه
الکلوروفوم:
یعتبر مخدرا مناسبا لحیوانات المعمل الصغیره
تتم بسکب قلیل من سائل الکلووفورم على قطعه صغیره من القطن ثم توضع بالقرب من فتحتی انف الحیوان
2.نمبیوتال الصودیوم
من احسن المخدات غیر القاتله
یناسب معظم الحیوانات الفقاریه
تتم على شکل حقن فی عضلات فخذ الحیوان
یعطى بشکل محلول ملحی متزن
3.الکحول الایثیلی
مناسب للحیوانات اللافقاریه التی تعیش فی المیاه العذبه
یستعمل بنسبه 1%
4. کلورید المنغنیز MgCl2.6H2O
یناسب الحیوانات البحریه
تتم بان یوضع الحیوان فی محلول 7,5%کلورید المنغنیز ثم یحقن داخلیا
5.المنثول
ماده مخدره بلوریه
تستعمل للحیوانات التی تقطن بالمیاه العذبه
تتم بان ینثر قلیلا منها على سطح الماء ویترک الحیوان لمده لیله کامله
6.بخار الایثر
مناسب للحیوانات للحشرات والعناکب والحیوانات الفقاریه البریه
مناسب فی معامل العلوم وخاصه الدراسات الوراثیه
تتم بوضع الحیوان فی وعاء جاف وبه قطعه قطن مبلله بقلیل من سائل الایثر ثم یغطى الوعاء بغطاء مثقب خوفا من اختناق الحیوان
7.الاغراق
عملیه طبیعیه
مناسبه للکائنات الارضیه الصغیره مثل الحشرات
تتم باغراق الحیوان بالماء
8.التبرید
تخدیر طبیعی
مناسبه للزواحف والرمائیات واللافقاریات
تتم بخفض حراره الحیوان الى اقل من 20 درجه مئویه تحت الصفر
طریقه تثبیت العینه
الهدف من التثبیت هو:
المحافظه على طبیعه التراکیب النسیجیه والخلویه الى اکبر قدر ممکن على طبیعتها الاصلیه
الحد من التغیرات التی تحصل بعد الوفاه
لا یوجد مثبت مثالی یناسب جمیع الدراسات بل تحدد الدراسه نوع المثبت
یجب تصغیر حجم العینه المراد تثبیتها (2-4 ملم) فقط
کمیه المثبت اکبر من 20 مره من العینه المثبته
وضحی ماذا یحدث لقطعه نسیجیه عزلت من کائن حی او کائن حدیث الوفاهولم تحظ بعنایه خاصه؟
تفقد الکثیر من محتواها المائی بفعل الهواء وتنکمش وتتغیر
تنکمش او تنتفخ حسب طبیعه الضغط الاسموزی للمحلول
تتعرض لخطر البکتیریا
تتحلل تلقائی لاحتوائها على الانزیمات المحلله
عرفی المثبت واذکری اهمیته؟
المثبت : محلول حافظ یمتاز بقدرته على
یمنع الانتفاخ او الانکماش
یقتل البکتیریا
یکبح عمل انزیمات التحلیل الذاتی
یقوی الانسجه حتى تصبح قابله للطمر والتقطیع
یزید من سرعه التفاعل النسیجی مع الاصباغ
هل جمیع المکونات النسیجیه تحتاج الى تثبیت؟
لیست جمیعها فمثلا الکیتین والسیلیلوز لا تحتاج تثبیت
بشکل عام البروتینات ان لم تکن ثابته لا تتحمل الانسجه والخلایا عملیات التقطیع لهذا یجب تحویل البروتینات الى الحالات الثابته وذلک عن طریق:
مثبتات مضیفه
مثبتات غیر مضیفه
الشروط الواجب توفرها فی المثبت
ان یکون سریع النفاذیه خلال اجزاء العینه
ان یحول المواد البروتینیه الذائبه الى مواد غیر ذائبه
ان تکون له القدره على منع عملیات التحلل البکتیری والتحلل الخلوی الذاتی
الا یسبب للخلایا ای تشوه
تصنیف المثبتات على حسب طریقه تفاعلها مع المواد البروتینیه الخلویه
مثبتات اولیه مخثره
مثبتات اولیه غیر مخثره
المثبتات الاولیه المخثره
مثبتات لها القدره على تحویل المواد البروتینیه الخلویه الذائبه الى مواد بروتینیه غیر ذائبه او مخثره
المثبت الاولی هو الذی یستطیع ان یقوم بوظیفه التثبیت بمفرده
عمله هو تحویل بروتین السیتوبلازم وغالبا السائل النووی الى ما یشبه الشبکه الاسفنجیه
اشهر المثبتات الاولیه المخثره 1. الکحول الایثیلی
سائل عدیم اللون یمتزج بشکل جید مع الماء ویعتبر من المثبتات الاولیه غیر المضیفه
عیوبه:
یسبب انکماش نسبی للنسیج الخلوی
تحطیم الانسجه السبحیه
یذیب القطرات الدهنیه فی الخلایا النسیجیه
میزاته:
سرعه نفاذ معتدله
یکسب النسیج صلابه کافیه
لا یکون تغیرات مصطنعه خارجی وبالتالی عدم الحاجه الى غسل العینه لازاله بقایا المثبت
2.کلورید الزئبق MgCl2
بلورات ابریه عدیم اللون قلیل الذوبان فی الماء یذوب فی الکحول الایثلی والبنزین وهو ملح سام
میزاته:
سرعه نفاذیته متوسطه
یسبب انکماشا خلویا طفیفا
یکسب الانسجه نوعا من الصلابه
عیوبه:یترک ترسبات حبیبیه صغیره
3.ثالث اکسید الکروم CrO3
بلوات بنیه یذوب بسهوله بالماء ویستعمل کمحلول مائی مخفف 0,5%
میزاته:
نفاذیته بطیئه
یکسب الانسجه نوعا من الصلابه
عیوبه:
یسبب انکماشا ملحوظا
یترک اثارا على العینه
2.مثبتات اولیه غیر مخثره
مثبتات لها القدره على جعل المواد البروتینیه اکثر صلابه ولکن بدون فصل جزیئات الماء منها
تعمل على تثبیت ماد البروتوبلازم بدون تکوین تراکیب اسفنجیه داخل الخلایا
یوجد منها نوعان :
مثبتات بسیطه
مثبتات مرکبه او مخلوطه
اشهر المثبتات غیر المخثره
المثبتات البسیطه:
الفورمالدهید
رابع اکسید الاوزمویوم
ثانی کرومات البوتاسیوم
حمض الخلیک
الفورمالدهید CH2CO
غاز عدیم اللون ویذوب فی الماء بنسبه 40%مکون فورمالین
میزاته:
سریع النفاذیه
یکسب النسیج صلابه قویه
عدم التاثیر على حجم الخلایا
لا یوثر على شکل النواه
لا یحتاج الى عملیه غسل
العینات تصطبغ جیدا مع الاصباغ القاعدیه
یستعمل للکشف عن الدهون والمواد السکریه والاجسام السبحیه
تابع الفومالدهید
عیوبه:
یسبب بعض التغیرات الداخلیه
ینتج عنه فراغات کبیره بین الخلایا المتجاوره
سیتوبلازم الخلیه ینکمش تجاه النواه
کل هذه العیوب ناتجه عن التغیر فی الضغط الاسموزی
کیف یمکن الحد من هذه العیوب؟
اضافه احد الاملاح المتعادله مثل کلورید الصودیوم بنسبه 0.75%
رابع اکسید الاوزمویوم OSO4
بلوات صفراء تذوب فی الماء بنسبه 7% وابخرته سامه وتتلف الخلایا الطلائیه المبطنه للعین والانف والفم
من المثبتات المضیفه ویستعمل کمحلول بترکیز 1%
میزاته:
سرعه نفاذ بطیئه نسبیا
لا یِوثر على الحجم
یترک العینه طریه نوعا ما
قادر على حفظ التراکیب الخلویه
العینات تتفاعل مع الاصباغ القاعدیه
ثانی کرومات البوتاسیوم K2Cr2O7
بلورات برتقالیه تذوب بالماء
میزاته:
یترک الانسجه طریه
لا یسبب ای تغیر فی الشکل العام للخلایا
عیوبه:
النویه یحدث لها انکماش
لا یستطیع تثبیت الماده الکروماتیه
تغسل العینه بالماء الجاری وتصبغ بالاصباغ الحمضیه والقاعدیه
حمض الخلیک
سائل عدیم اللون CH3COOH یمتزج بالماء والایثنول ویتبلور بالتبرید
یعرف بحمض الخلیک الثلجی
میزاته:
سریع النفاذیه
یثبت الحموض النوویه
یسبب زیاده فی حجم الخلایا
لا یوثر على صلابه النسیج
لا یحدث تغیرات خارجیه
لا یحتاج الى عملیه غسل
مناسب لداسه:الدراسات السیتولوجیه وبالذات کروموسومات الخلیه
وهو مثبت غیر مضیف
المثبتات المرکبه (المثبتات المخلوطه)
مثبتات مکونه من اکثر من ماده مثبته اولیه
المثبتات الاکثر استعمالا فی مجال التحضیرات المجهریه الضوئیه
مثبت کلارک
کحول ایثیلی+حمض الخلیک الثلجی (1:3)
ما الفائده من خلط الکحول الایثیلی مع حمض الخلیک؟
استعمالاته:
الدراسات التشریحیه والنسیجیه
الدراسات السیتولوجیه
مثبت زنکر
کلورید الزئبق+ثانی کرومات البوتاسیوم+کبریتات الصودیوم+ماء مقطر+حمض الخلیک الثلجی
مناسب کمثبت للانسجه لانه یحافظ على المعالم الخلویه
مثبت فلمنج
رابع اکسید الاوزمویوم+ثالث اکسید الکروم
+حمض الخلیک +ماء مقطر
مثبت هیلی
کلورید الزئبق+ثانی کرومات البوتاسیوم+ کبریتات الصودیوم+ماء مقطر+فورمالین
مناسب لدراسه التراکیب السیتوبلازمیه بما فیها الدهون والاجسام السبحیه
مثبت التمان
رابع اکسید الاوزمیوم المائی+ثانی کرومات البوتاسیوم
مثبت مناسب لدراسه الاجسام السبحیه ( المیتوکندریا)
عللی لا یستعمل مثبت التمان فی دراسه النواه والکروموسومات؟
لانه یذیب البروتینات النوویه
مثبت کارنوی
کحول ایثیلی مطلق+کلوروفورم+حمض خلیک ثلجی
یناسب دراسه النواه والکروموزومات
عیوبه: یتلف معظم التراکیب السیتوبلازمیه
مثبت بوان
حمض البکریک+فورمالدهید+حمض خلیک ثلجی
مناسب انسجه اللافقاریات البحریه والثدیات
لا یناسب انسجه الکلیه والاعضاء التی تحتوی على خلایا مخاطیه
مثبت بوان الکحولی
کحول ایثیلی+فورمالین+حمض خلیک ثلجی+حمض بکریک
مناسب :للحیوانات المفصلیه (الحشرات)
وذلک لانه ذو سرعه نفاذیه عالیه
مثبت هیدنهین (سوسا)
کلورید الزئبق+کلورید الصودیوم+ماء مقطر+حمض ثالث کلور الخلیک+فورمالدهید+حمض الخلیک الثلجی
یستعمل عند دراسه الانسجه وبالذات اللافقاریات
مثبت شامبی
حمض الکروم المائی+ثانی کرومات البوتاسیوم المائیه+رابع اکسید الاوزمومیوم
مناسب لدراسه التراکیب السیتوبلازمیه للخلایا وبالذات الحیوانات الاولیه
مثبت شاودن
کلورید الزئبق المشبع+کحول ایثیلی مطلق+حمض الخلیک الثلجی
مناسب لتثبیت الاولیات
مثبت سانفیلیس
یتکون من مجموعتین:
المجموعه الاولى:حمض الکروم المائی+حمض الخلیک المائی
المجموعه الثانیه:فورمالدهید+ماء مقطر
مناسب لدراسه الکروموسومات والانقسامات الخلویه النباتیه
مثبت هولاندی
خلات النحاس+حمض البکریک+فورمالدهید+حمض الخلیک الثلجی+ماء مقطر
مناسب لدراسه التراکیب السیتوبلازمیه مثل اجسام جولجی
مناسب للاولیات والخلایا المعزولهالتی لاتحتاج الى طمر وتقطیع
مثبت سیرا
کحول ایثیلی مطلق+فومالدهید+حمض الخلیک الثلجی
مناسب لدراسه الحموض النوویه
مثبت تیجو
کحول ایثیلی+حمض الخلیک الثلجی+فورمالدهید
مناسب للخلایا المعزوله او المزروعه على اغطیه الشرائح عند الرغبه فی دراسه الکروموسومات
مثبت دیفدسن
ماء مقطر+کحول ایثیلی+فورمالدهید+حمض الخلیک الثلجی
مناسب فی دراسه کروماتین الجنس
سوال؟
صنفی المثبتات المرکبه الى اربع مجموعات حسب الجدول التالی؟
طریقه عمل القطاعات البرافینیه
قتل الحیوان والحصول على العینه
تثبیت العینه
غسل العینه
نزع الماء من العینه
ترویق العینه
تخلیل العینه
طمر العینه
تقطیع العینه
تحمیل العینه
عملیه صبغ العینه
عمل الشریحه المستدیمه
غسل العینه
بعد التثبیت لا بد من التخلص من اثار المثبت المتبقیه فی العینه
عملیه الغسل تعتمد على نوع المثبت
نزع الماء من العینه
وضحی طریقه نزع الماء من العینه مبینه السبب من نزع الماء منها؟
تتم عملیه النزع بتمریر العینه على سلسله متدرجه فی التراکیز من محالیل الکحول الایثیلی
السبب: حتى یسهل عملیه نفاذ البرافین المصهور الى داخل الانسجه وذلک لان الماء لا یمتزج مع ماده شمع البرافین شائعه الاستعمال فی عملیات الطمر
اذکری الماده المستخدمه فی عملیه نزع الماء من العینه وسبب استخدامها؟
ماده الکحول الایثیلی لانه یمتزج بسهوله مع الماء ومع ماده الزیلول المروقه والتی تمتزج جیدا مع ماده الطمر البرافینیه
ترویق العینه
نزع الکحولات المستخدمه فی عملیات نزع الماء بواسطه ماده مروقه تحل مکان الکحول لتسهل نفاذ ماده الطمر البرافینیه
من انسب محالیل الترویق ماده الزیلول لسهوله امتزاجها مع البرافین والکحول معا
تخلیل العینه
تشبیع العینه بالبرافین وذلک بتمریر العینه على مزیج متساو من الزیلول والبرافین ثم تنقل فی شمع البرافین المنصهر داخل الفرن
وضحی العوامل التی یعتمد علیها عدد مرات تغییر الشمع؟
تعتمد على نوع العینه بحیث تقل کلما کانت العینه رخوه وتزداد کلما کانت العینه صلبه
شمع البرافین المثالی هو المنصهر والمحفوظ لمده اسبوع فی فرن ساخن درجه حرارته اعلى قلیلا من درجه انصهار الشمع
طمر العینه
تتم بوضع قالب الطمر على لوح زجاجی قیق ثم یسکب شمع البرافین المنصهر فی هذا القالب
توضع العینه مباشره بملقط دافئ وسط الشمع المنصهر
تحرک العینه بابه تشریح ساخنه
النفخ المستمر على سطح العینه حتى تتکون طبقه متجمده على سطح القالب
یغمر القالب بماء بارد (10-15 درجه مئویه) حتى یتصلب البرافین
تقطیع العینه
تقطیع العینه: تحویلها الى قطاعات رقیقه جدا باجهزه خاصه للقطع تسمى المیکروتومات
اهمیتها:
دراسه العینه على مستواها النسیجی وذلک بتحویلها لاالى شرائح شفافه حتى یتمکن الضوء المرور خلالها ویتراوح سمکها من 5-7 میکرومیتر
تقطیع العینه
خطوات تقطیع العینه:
تشذیب قالب البرافین بشفره حاده
تثبیت العینه جیدا على حامل العینه فی المیکروتوم
تزوید جهاز القطع بسکین حاده
تحدید سمک القطاع 5-7 میکرومیتر
توضع القطاعات (الاشرطه) على صفیحه سوداء حتى یسهل تمییز القطاعات
یوضع القطاع على الشریحه المجهریه
لمعرفه الصعوبات فی تقطیع العینه راجعی صفحه 95 من الکتاب
تحمیل القطاعات
وضع القطاع النسیجی على الشریحه المجهریه
تتم بطریقتین:
یوضع القطاع فی حمام مائی 40-45 درجه مئویه ویترک القطاع یطفو على سطح الماء لمده 1-2 دقیقه حتى ینفرد تماما ثم تمرر الشریحه تحت هذا القطاع وتترک لتجف
ینقل القطاع مباشره الى شریحه مجهریه علیها قطره من الماء المقطر ثم توضع على مجفف
یجب دهن الشریحه المجهریه مسبقا بلاصق مایر حتى تزید من نسبه التصاق القطاع على الشریحه مما یضمن عدم سقوط القطاع اثناء عملیات الصبغ
ما هو لاصق مایر وما اهمیته؟
حجمین متساویین من زلال البیض والجلسرین وقلیل من سلالات الصودیوم
اهمیته: تزید من نسبه التصاق القطاع على الشریحه مما یضمن عدم سقوط القطاع اثناء عملیات الصبغ
صبغ القطاع
خطوات اعداد الصبغه
اذابه الشمع عن القطاع تماما بالزیلول
التخلص من الزیلول بالکحول المطلق
نقل القطاع الى بیئه مشابهه للبیئه المذابه فیها الصبغه
غمر القطاع فی محلول الصبغه
الاصباغ
المواد التی تستخدم لتلوین التراکیب الخلویه المختلفه لکی یصبح من السهل رویتها وتمییزها عن بعضها
الصبغه ماده عضویه تتکون من شقین :
الحامل اللونی:وهو الشق الذی یعزى الیه لون الصبغه
مساعد التلوین:یعزى له ارتباط حامل اللون مع جزیئات الماده المراد صبغها
تصنیف الاصباغ:یعتمد على مساعد التلوین
اصباغ قاعدیه
اصباغ حمضیه
اصباغ متذبذبه
الاصباغ القاعدیه
اصباغ لها القدره على صبغ الاجزاء الحمضیه من التراکیب الخلویه
مساعد التلوین عباره عن مجموعه امینیه او احد مشتقاتها و لدیه القدره على الارتباط بالایونات السالبه لجزیئات الماده المراد صبغها
الماده التی تصطبغ بها تسمى ماده محبه للصبغه القاعدیه
مثال :صبغه فولجن
الاصباغ الحمضیه
صبغه لها القدره على صبغ الاجزاء الخلویه القاعدیه
مساعد التلوین له القدره على الارتباط مع الایونات الموجبه
مساعد التلوین عباره عن مجموعه هیدوکسیل او کربوکسیل او مجموعه کبریتیه
الماده التی تصطبغ بها تسمى محبه الصفات الحمضیه
مثل حمض البکریک
الاصباغ المتذبذبه
صبغه قاعدیه فی وسط حمضی
او صبغه حمضیه فی وسط قاعدی
تصنیف آخر للصبغات بناء على طبیعه الماده
الاصباغ الطبیعیه
الاصباغ المصنعه
الاصباغ الطبیعیه
الاصباغ المستمده من مصادر طبیعیه سواء کانت حیوانیه او نباتیه
من الاصباغ من مصدر حیوانی مثل القرمز
من مصدر نباتی مثل الهیماتوکسلین
الاصباغ المصنعه
او تعرف المرکبه وهی الاصباغ المحضره نتیجه لعده تفاعلات کیمیائیه
اهمیتها:
امکانیه صبغ العینه باکثر من لون واحد
تصنیف آخر للاصباغ یعتمد على طبیعه الصبغ
صبغ بسیط
صبغ متخصص
صبغ مضاد
صبغ متعدد
صبغ بسیط
عندما تتلون مکونات النسیج الخلوی بلون واحد
صبغ متخصص
عندما تصطبغ مکونات خلویه محدده بلون خاص
مثال:
صبغه فولجن لصبغ DNA فی النواه
صبغ مضاد
بان تصبغ اجزاء محدده من العینه بلون خاص وتصبغ بقیه الاجزاء بلون آخر معاکس
مثال:
استخدام صبغه الایوسین والهیماتوکسلین
صبغ متعدد
صبغ مکونات العینه النسیجیه بالوان مختلفه فی آن واحد سواء بصبغه واحده او مزیج من العدید من الصبغات
مثال:
صبغه مالوری ولیشمان
العوامل الموثره على الصبغ
الاس الهیدروجینی(PH)
المثبت
درجه الحراره
قوه تاین الصبغه
الترابط الکیمیائی
الترکیز
نفاذیه الصبغه
داخل اجزاء العینه
اصباغ الانسجه
صبغه مایرهیمالوم:
ممیزاتها:صبغه سریعه ولا یستحب استخدامها مع العینات المثبته برابع اکسید الاوزمیوم
تحضر من:هیماتوکسلین+ایودات الصودیوم+الشب البوتاسی+ماء مقطر
هیدرات الکلور +حمض اللیمون
ایوسین
النتیجه:الانویه تصطبغ باللون الازرق والسیتوبلازم بلون قرنفلی
صبغه الهیماتوکسلین الحدیدی
ممیزاتها:
صبغه جیده للقطاعات التی یراد تصویرها فوتوغرافیا
قادره على توضیح التفاصیل الصغیره جدا فی الخلیه والنسیج
تحضر من:
الشب الحدیدی+کبریتات الامونیوم الحدیدیه
هیماتوکسلین+ماء مقطر
النتیجه:
الانویه والکروموسومات وکریات الدم الحمراء تصطبغ باللون الاسود الغامق
التراکیب الاخرى تظهر بلون یتراوح بین الرمادی والازرق المسود
صبغه مالوری
میزاتها:
تصبغ باللون الاحمر والازرق والاصفر لکنها تبهت خلال سنه من صبغها
تحفظ القطاعات المصبوغه بها بعیدا عن الضوء
لا تستعمل مع القطاعات المثبته برابع اکسید الاوزمیوم
تحضرمن:
حمض الفوسفوتنجستک+ماده Orange G +ازرق الانلین+الفیوشین الحمضی+ماء مقطر
النتیجه:
الانویه حمراء والنویات صفراء ماده الکولاجین والمواد المخاطیه زرقاء و کرات الدم الحمراء صفراء والسیتوبلازم قرنفلی
صبغه السفرانین والاخضر السریع
میزاتها: تستخدم للقطاعات المعموله بالید
تناسب الانسجه النباتیه
مکونه من: محلول السفرانین+حمض الخل الثلجی+الاخضر السریع+زیت القرنفل
النتیجه:
الانویه والکروموسومات والکیوتیکل واللجنین تصطبغ بالاحمر
المکونات الاخرى باللون الاخضر
صبغه کارمین البوراکس
میزاتها: تستخدم للعینات الکامله
تحضر من:کارمین+بوراکس+ماء مقطر
النتیجه:
الانویه باللون الاحمر الغامق والسیتوبلازم باللون الاخضر
اصباغ کیمیاء الانسجه
اصباغ تستخدم للکشف عن المکونات الکیمیائیه للنسیج
طرق الکشف عن البروتین
طریقه ازرق البروموفینول الزئبقی
تستخدم: للکشف العام عن البروتینات فی بعض الانسجه الحیوانیه من عضلات وخلایا بیضیه وغیرها
من المفضل تثبیت العینات بمثباتات الکارنوی او الفورمالین
تحذیر:یجب عدم استخدام مثبتات الاوزمیوم
تحضر من :کلورید الزئبق+ازرق البروموفینول +حمض الخل المائی
النتیجه:البروتینات تصطبغ باللون الازرق الغامق
طریقه الننهیدرن
تستخدم القطاعات المثبته بمثبت زنکر او الکحول الایثیلی المطلق+کارنوی+الکحول الحمضی
والقطاعات المحضره باستخدام المیکروتوم الثلجی
النتیجه:
البروتینات تصطبغ باللون الوردی المحمر الى الارجوانی
للکشف عن الحموض النوویه
تفاعل فولجن
جمیع المثبتات یمکن استخدامها فی حالات کشف فولجن ما عدا مثبت بوان
النتیجه:
الحمض النووی الرایبوزی اللااکسجینی یصطبغ باللون الاحمر
طریقه اخضر المیثیل والبیرونین
یستخدم مثبت الفورمالدهید او مثبت کارنوی او 70%کحول ایثیلی
النتیجه:
الحمض النووی الریبوزی(RNA )یصطبغ باللون الاحمر اما الحمض الریبوزی اللااکسجینی (DNA) باللون الاخضر
لعمل تفاعل ضبط
ممکن هضم قطاعات مختلفه باحد انزیمی RNase او DNase
یذاب 0,05 مجم /1ملم من بلورات انزیم الحمض النووی الریبوزی اللااکسجینی فی محلول منظم PH=5,7
یذاب 1مجم/1ملم من بلورات انزیم الحمض النووی الریبوزی (ا) فی محلول الفوسفات المنظم PH=6,4
النتیجه:
محلول 1 النتیجه اصطباغ RNA باللون الاحمر
DNA هضم بواسطه الانزیم ولا یوجد نتیجه للتفاعل
محلول 2 العکس DNA باللون الاخضر وRNA هضم باانزیم
الکشف عن الانزیمات
طریقه مرکب الکالسیوم والکوبالت للکشف عن انزیم الفوسفاتیز القاعدی
عللی للکشف عن الفوسفاتیز القاعدی یفضل استعمال قطاعات ثلجیه؟
لان هذه الطریقه تقلل من تکسیر او تحطیم الانزیمات
النتیجه:
التراکیب الخلویه التی تحتوی على انزیم الفوسفاتیز القاعدی النشط تصطبغ باللون الاسود او البنی المسود
طریقه نترات الرصاص للکشف عن انزیم الفوسفاتیز الحمضی
فی هذه الطریقه یمکن استخدام عده مثبتات
یمکن استخدام القطاعات الشمعیه او الثلجیه
النتیجه:
الاماکن الموجود فیها حمض الفوسفاتیز فی القطاعات ینتج فیها راسب اسود من کبریتید الفضه
الکشف عن الدهون
الدهون تذوب فی المواد الکیمیائیه التی تستخدم لتجفیف العینات المراد طمرها بالبرافین مثل الکحول
یجب استخدام القطاعات الثلجیه للکشف عن الدهون
اشرحی طریقه اخرى یمکن استخدامها بدلا من القطاعات الثلجیه؟
طریقه العالم مکمانس :وذلک بتثبیت العینات لمده اسبوع الى خمسه اسابیع بمخلوط من(نترات الکوبلت+ماء مقطر+کلورید الکالسیوم+فورمالین)
ینتزع الماء من العینات بعد اکمال عملیه التثبیت بواسطه ثلاثه محالیل من الاسیتون تترک نصف ساعه ثم توضع فی شمع البرافین المذاب
1.طریقه اسود سودان (ب) للکشف عن الدهون
النتیجه:جمیع الدهون ما عدا المغلقه تصطبغ باللون الاسود
2.طریقه اسود سودان (ب) للدهون المغلقه
تستخدم هذه الطریقه للکشف عن الدهون فی سبحه الدم
النتیجه :الدهون المغلقه تصطبغ باللون الاسود
طریقه الاحمر الزیتی (o ) للکشف عن الدهون المعتدله
النتیجه: الدهون المعتدله تصطبغ باللون الاحمر
الکشف عن المواد السکریه (الکربوهیدراتیه)
الکربوهیدرات مرکبات عضویه صیغتها CH2O)n)
السکریات من المواد الاساسیه بالنسبه للحیوان او النبات
انوع السکریات
سکریات احادیه التسکر
سکریات قلیله التسکر
سکریات عدیده التسکر
طریقه حمض البیریودیک –شف للکشف عن السکریات
حمض البیریودیک
حمام الاختزال
محلول کاشف شیف
النتیجه:
السکریات السداسیه والتی تحوی مواد مخاطیه تصطبغ بالوان مختلفه من القرنفلی المحمر
الجلیکوجین صبغه غامقه من نفس اللون
الکشف عن الکیتین
طریقه العالم ریتشارد وهی طریقه للکشف عن الکیتوسان وهی طریقه نافعه جدا ولکنها تحطم الانسجه الاخرى
النتیجه:الکیتین یتحول لونه الى البنفسجی المحمر
الکشف عن السیلیلوز
عن طریق محلول شلوتز
النتیجه:
الجدر الخلویه التی تحوی على کمیه من السیلیلوز تصطبغ بالازرق
الجدر التی تحتوی على کمیه کبیره من اللجنین والکیتوین والسوبرین او الکیتین تصطبغ باللون الاصفر
الکشف عن النشا
بواسطه یودید البوتاسیوم وماء مقطر ویود
النتیجه:
الجدر الخلویه التی تحتوی على السیلیلوز تصطبغ بالازرق
الجدر التی تحوی اللجنین تاخذ اللون الاصفر
الکشف عن اللجنین
محلول الفلوروجلوسین
النتیجه:
اللجنین یصطبغ باللون البنفسجی المحمر
طریقه ازرق الالیشان للکشف عن عدیدات التسکر المخاطیه الحمضیه
تصطبغ بمحلول ازرق الالیشان وحمض الخل
النتیجه:
عدیدات التسکر المخاطیه الحمضیه تصطبغ باللون الازرق المخضر
الانویه تصطبغ باللون الازرق او احمر غامق
طریقه الکارمین للکشف عن النشا الحیوانی
یمکن استخدام العینات المثبته فی مثبت بوان وکارنوی والکحول والفورمالین
النتیجه:
الانویه تصطبغ باللون الازرق الغامق
الجلیکوجین باللون الاحمر
واجب بیتی املئی الجدول بکل انواع الصبغات التی تعرفتی علیها؟
ارسلی الواجب على البرید الالکترونی
W.almansi@mu.edu.sa
العوامل الموثره على الصبغ
ترکیز ایون الهیدروجین (PH )
المثبت
درجه الحراره
قوه تاین الصبغه نفسها
الترابط الکیمیائی
الترکیز
نفاذیه الصبغه داخل اجزاء العینه
الاس الهیدروجینی
بما ان الاصباغ حمضیه او قاعدیه فمن الموکد بانها تتاثر بالاس الهیدروجینی
فمثلا یصطبغ البروتین جیدا عند PH = 3 فی حاله الصبغ بالاخضر السریع
وعند PH =8 فی حاله ازرق میثلین
المثبت
التراکیب الخلویه تتفاعل بشکل اوضح مع الاصباغ الحمضیه والقاعدیه بعد التثبیت
عللی المثبت مهم فی عملیه التفاعل الکیمیائی للاصباغ؟
وذلک بسبب الترابط الذی یتم بین المثبت ومجموعات خاصه فی بروتینات العینه المصبوغه مما یجعل هذه المجموعات غیر قابله للتفاعل مع الاصباغ الاخرى من الصبغات
امثله
العینات المثبته فی الفورمالدهید تصطبغ جیدا مع الاصباغ القاعدیه
العینات المثبته فی کلورید الزئبق تصطبغ مع الاصباغ الحمضیه
الترابط الکیمیائی
یعتمد الترابط الکیمیائی بین مکونات الانسجه الخلویه والاصباغ اساسا على نوعیه هذه المکونات
بما ان الغالبیه العظمى للمکونات الخلویه تتفاعل مع ایه صبغه ولکن بتفاوت فلقد استغلت هذه الظاهره فی تحدید مده الصبغ
اقسام الصبغ حسب مده الصبغ
الصبغ المتدرج
الصبغ الرجعی او التمایز
الترکیز
مده الصبغ تزداد کلما زاد ترکیز الماده الخلویه فی العینه
سوال: ایهما تمتص کمیه اکبر من الصبغه قرصین واحد 5% والثانی 20% من الجیلاتین وثبتناهما بالفورمالدهید ثم قطعناهما الى شرائح رقیقه بنفس السمک؟
النفاذیه
نفاذیه الاصباغ تعرف بالتجربه العملیه
فهناک اصباغ سریعه النفاذیه مثل الایوسین وصبغه البرتقالی ج
وهناک اصباغ بذطیئه النفاذیه مثل ازرق المیثل
والسبب ان الاصباغ سریعه النفاذیه تمیل لتشکیل ایونات مفرده اما بطیئه النفاذیه تکوین محالیل غرویه
الاصباغ حسب نوعیه مساعد التلوین
الاصباغ حسب طبیعه الماده الصبغیه
الاصباغ حسب طبیعه الصبغ
الاصباغ حسب الوسط المراد صبغه
عمل الشریحه المستدیمه
التحضیر المستدیم : یعتمد على استخلاص ای نسبه رطوبه من العینه وصبغتها بالصبغ المناسب ثم ترویقها واخیرا تحمیلها فی وسط مناسب ولصق غطاء الشریحه على التحضیر ببلسم ذو معامل انکسار یقارب معامل انکسار الزجاج
عللی استخدام بلسم فی عمل الشریحه المستدیمه له معامل انکسار قریب من الزجاج؟
حتى لا یحدث تداخل یعوق الرویه
توضع التحضیرات بعد ذلک فی افران تجفیف خاصه ثم تدون بیانات کل عینه على احد ارکان الشریحه وتحفظ فی علب حفظ الشرائح مرقمه ومرتبه
وضحی الهدف من التحمیل؟
نقل المقطع من الزایلین الى بلسم کندا وتغطیته بغطاء الشریحه
اهم اوساط التحمیل المستخدمه بلسم کندا
میزاته:
جمیع التحضیرات المجهریه معها تصبح ثابته بعد ان تتبخر المواد التی اذیب فیها بلسم کندا
له معامل انکسار عال من خلاله یمکن مشاهده تفصیلات من العینات
یسهل استخدام الصبغات
لا یوجد ترسبات فی العینه
یعطی نسبه ثبات عالیه
اسئله؟
عللی ضروره التخلص من الماء والکحول الموجود فی القطاعات المصبوغه اثناء عمل الشریحه المستدیمه؟
کیف یمکن التخلص من الماء فی العینات؟
کیف یمکن التخلص من الکحول فی العینات؟
الاجابات
لان المواد الحافظه المستخدمه فی عمل الشرائح المستدیمه لا تذوب فی الماء او الکحول
یجب تمریر القطاعات على سلسله متدرجه الارتفاع فی التراکیز من محالیل الکحول الایثیلی
تمریر القطاع على محالیل نقیه من الزیلول
خطوات عمل الشریحه المستدیمه
التخلص من الماء والکحول فی القطاع
نقل القطاع على محلول نقی من الزیلول
اضافه قطره من محلول بلسم کندا المذاب بالزیلول
یوضع غطاء للشریحه وبحذر شدید
تترک الشریحه 24 ساعه على مجفف الشرائح حتى یتم تجفیف ماده بلسم کندا تماما
بیئات اللصق
ما هو الهدف من عمل القطاعات النسیجیه او الخلایا المصبوغه على الشرائح المجهریه؟
المحافظه علیها بشکل دائم لتسهیل عملیه فحصها وخزنها دون تغیر فی لونها او شکلها
ما المقصود ببیئات اللصق؟
المقصود لصق غطاء الشریحه جیدا على القطاع او الخلایا المثبته فوق الشریحه المجهریه
ممیزات بیئات اللصق
لا تغیر من طبیعه لون الصبغه للنسیج او الخلایا
توفر لصق جید للغطاء
معامل انکسارها مساو لمعامل انکسار العینه او مقارب
تصنیف بیئات اللصق
الراتنجات الطبیعیه
امثله على الراتنجات الطبیعیه
البیئات اللاصقه المائیه
اساسیه لحفظ المکونات النسیجیه وصباغتها
تذوب فی الکحولات او الهیدروکربونات
مکونه منه :
ا) الجیلاتین والصمغ العربی:یستعمل للتقویه
ب)السکر والاملاح: تستعمل لزیاده معامل الانکسار
ج)الجلسرول: یحمی العینه من الجفاف والتکسر
4. ماده حافظه: تنمع نمو فطریات التعفن
اشهر البیئات المائیه اللاصقه
المحالیل المنظمه
تمتاز الخلایا الحیه بمیکانیکیه فریده تعمل على المحافظه على طبیعه الاس الهیدروجینی .
وضحی الهدف من ذلک ,ثم بینی کیفیه المحافظه على الاس الهیدروجینی؟
لان الاس الهیدروجینی للخلایا یلعب دورا مهمافی سرعه التفاعلات الکیمیائیه الحیویه وای تغیر فی PH ذو تاثیر بالغ على سرعه التفاعلات
یمکن التحکم فی قیمه PH من خلال تفاعلات کیمیائیه تتحکم فیها محالیل یطلق علیها اسم المحالیل المنظمه
وضحی المقصود بالمحلول المنظم؟
محلول مکون من حمض ضعیف وملح او من قاعده ضعیفه وملح , بحیث یبقى ترکیز ایونات الهیدروجین ثابتا فی المحلول .
مثال:
محلول مکون من حمض الکربونیک H2CO3 وبیکربونات الصودیوم NaHCO3
H2CO3↔H+ HCO3
NaHCO3 ↔Na+HCO3
انواع المحالیل المنظمه
محلول حمض الخل /الخلات المنظم
0,2 جزیء حمض الخل (11,55 مل /1لتر)
0,2جزیء خلات صودیوم (27,25 جم /1لتر )
بالاعتماد على الحجوم من محلول 1 ومحلول 2 نحضر محالیل منظمه لها PH ثابته
ملاحظه:انظری الجدول صفحه 278 من الکتاب
محلول الکاکودیلات المنظم
محلول منظم یستخدم لتعدیل الاس الهیدروجینی للالدیهیدات المستخدمه فی تثبیت عینات المجهر الالکترونی
تحذیر : المحلول خطر وسام لاحتوائه على الزرنیخ
یحضر من:
0,2 جزیء کاکودیلات الصودیوم وماء مقطر
0,2 جزیء حمض الهیدروکلوریک وماء مقطر
یضاف المحلولین لتحضیر محلول له PH ثابت بالاعتماد على الحجوم للمحالیل
انظری الجدول صفحه 279 من الکتاب
محلول الفوسفات المنظم
محلول محضر من :
0,067 جزیء فوسفات البوتاسیوم ثنائیه الهیدروجین فی 1لتر ماء
0,067 جزیء فوسفات الصودیوم الهیدروجینیه
یحضر المحلول المنظم من المحلول 1 والمحلول 2 بحجوم معینه لیعطی PH ثابت
انظری الجدول صفحه 280 من الکتاب
محلول ترس المنظم
0,2 جزیء من ترس
0,2 جزیء حمض الهیدروکلوریک
تحذیر: لا یستخدم هذا المنظم لتعتدیل اس الالدیهیدات الهیدروجینی
یضاف المحلول 1 مع المحلول 2 لتحضیر محالیل منظمه
انظری الجدول صفحه 281 من الکتاب
محلول خلات الفیرونال المنظم
خلات الصودیوم و فیرونال الصودیوم
حمض الهیدروکلوریک
ملاحظه: لا یستخدم لتعدیل الاس الهیدروجینی لمحالیل الالدهیدات
لتحضیر محالیل لها PH ثابت نخلوط محلول 1 مع 2 بحجوم مختلفه
انظری الجدول صفحه 282 من الکتاب
المحالیل الملحیه المتزنه
المحلول الملحی الحقیقی هو المحلول الذی تنسجم فیه الانسجه وتسلک کانها فی الکائن الحی
من اهم المحالیل المستخدمه:
السوائل الحیویه کالدم والمستخلصات النسیجیه
ماء البحر وخاصه فی حاله انسجه الاحیاء البحریه
عللی استخدام المحالیل المتزنه عند دراسه انسجه المجموعات الحیوانیه؟
لان بعض هذه الانسجه تتحلل بملامستها للهواء مثل السوائل الدمویه للحشرات وبعض القواقع
قائمه ببعض المحالیل الملحیه المستخدمه للکائنات الحیه المختلفه
انظری صفحه 286 من الکتاب
ملاحظه : هذا الجدول للدراسه فقط ولیس للحفظ
التصویر الاشعاعی الذاتی
التصویر الاشعاعی یهدف الى تسهیل دراسه کیمیاء الخلایا والانسجه
اهمیه العناصر المشعه کعناصر مرقمه
اهم العناصر المشعه: التریتیوم , الکربون14,الفوسفور 32 الکبریت 35
هذه العناصر حققت تتبع ما یجری داخل الخلایا من تفاعلات کیمیائیه حیویه
امکن ذلک بتعریض الخلایا لجزیئات ماده معینه ومشعه باحد العناصر المشعه وبشرط ان هذه الماده تدخل فی ترکیب الخلیه
امثله
استخدمت ماده الثیمدین المشععه بالتریتیوم لتتبع ما یحدث لماده DNA اثناء هیمنتها على نشاطات الخلیه
استخدام الیوریدین المشعع بالتریتیوم لتتبع عملیه تمثیل RNA
الخطوات العملیه لاستخدام النظائر المشعه فی دراسه کیمیاء الخلایا والانسجه
تعرض الخلایا الحیه لجزیئات الماده المشععه ولمده زمنیه محدده
تثبت عل شریحه مجهریه
تغطى فی الظلام بفلم تصوری حساس خاص لهذه الطریقه
تترک مده من الزمن فی الظلام
یتم تعرض الفلم للومیض الذی ینطلق من الماده المشعه الممتصه من الخلایا
یحمض الفلم ویثبت قبل تعریضه للضوء
تفحص الشریحه تحت المجهر
استعمال النظائر المشعه
تحذیر…تحذیر…تحذیر
جمیع النظائر المشعه یجب استعمالها بحذر شدید خلال استخدامها او التخلص من بقایاها
المواد المرقمه تحضر على شکل محالیل معقمه محفوظه فی امبولات او قواریر زجاجیه محکمه الغلق ویکتب علیها ترکیز المحلول والنشاط النوعی للعنصر المشع
وحده الاشعاع هی الکیوری
سوال؟؟
على ماذا تعتمد طریقه استخدام المواد المشعه للترقیم؟
یعتمد على نوع التجربه وطبیعه الکائن المستخدم لهذا الغرض
وضحی الفرق فی کیفیه استخدام النظائر المشعه فی حاله کل من ,الطحالب ,النبات ,الحیوانات الکبیره
تحضیر الخلایا والانسجه
تحذیر …تحذیر ….تحذیر
عدم استخدام المثبتات التی تحوی حمض البکریک او الفورمالدهید مع الخلایا او الانسجه المعرضه للعناصر المشعه
عللی ذلک؟؟؟
لانها توثر على طبقه المستحلب التی تغطی افلام التصویر الحساسه
خطوات تحضیر الخلایا والانسجه
تثبیت العینات بعد تعرضها للعناصر المشععه
غسلها جیدا
تقطیع العینه
اذا کانت العینه على شکل خلایا معلقه فتنشر بطریقه الهواء الجاف
استخدام شرائح مغطاه بطبقه حیلاتینیه رقیقه
سوال؟؟
1)وضحی اهمیه استخدام تقنیه الشرائح المغطاه مع النظائر المشعه؟
یساعد على التصاق فلم التصویر الحساس وعدم تمزقه اثناء عملیه التحمیض
2) ما هو المحلول المناسب لعمل الشرائح المغطاه؟
محلول من الجیلاتین مع الماء وکبریتات البوتاسیوم الکرومیه
اعداد فلم التصویر الحساس
لاعداد الشریحه للفلم الحساس یجب تغطیه الانسجه او الخلایا بطریقه مستحلبه حساسه للجسیمات التی تنطلق من المواد المشعه المتحده مع الانسجه
انواع طبقات المستحلب
المستحلب السائل
الفلم الشریطی
المستحلب السائل
یوجد على شکل مواد غرویه تذاب عند درجه حراره 42-45 درجه مئویه
تخزن عند درجه حراره الثلاجه العادیه ولمده شهرین فقط
ینصح دائما باتباع التعلیمات المرفقه مع المستحلب
لا ینصح استخدام المستحلب لاکثر من مره
میزاته امکانیه الحصول على فلم رقیق جدا یلتصق بشکل مباشر مع الانسجه الخلویه المشعه وبالتالی تاثیر الاشعاع علیه اکثر فاعلیه
الفلم الشریطی
الفلم طبقه رقیقه جدا من مستحلب حساس منشوره على طبقه رقیقه من الجیلاتین ومحموله على الواح زجاجیه
یخزن لمده سته شهور عند درجه 4 درجه مئویه
مده التعریض للاشعاع وهی المده اللازمه لتعریض الفلم للاشعاع
بعد ان تجف الشرائح المغطاه بالمستحلب توضع فی صنادیق مانعه للضوء
من الافضل ان توضع قطعه صغیره من ماده مجففه کماده السلیکا الغروانیه
توضع فی صنادیق وتغلف وتخزن فی ثلاجه عند 4درجه مئویه
یصعب تحدید فتره التعریض المثالیه لاجراء التجارب وذلک لانها تعتمد على عناصر عدیده
من خلال التحمیض ممکن تحدید فتره التعریض المناسبه
طریقه الاظهار والتثبیت
بعد ان تخرج العینات من الصنادیق یحضر محلول التحمیض المظهر المناسب
بعد التحمیض یوضع مثبت مناسب تحت ضوء احمر مامون
ثم تغسل بالماء الجاری
اخیرا تجفف بالهواء الخالی من الغبار
الفحص المجهری
یستخدم مع هذه الشرائح مجهر الطیف المتباین بعد وضع قلیل من ماده الجلسرول وقبل وضع غطاء الشریحه على العینه
لا بد من صبغ العینه قبل الفلم او بعده
عند الفحص یفضل استخدام العدسه الزیتیه ذات التکبیر المتوسط بدلا من العدسات عالیه التکبیر