پاورپوینت واکنش زنجیره ای پلی مراز

واکنش زنجیره ای پلی مراز
بسم الله الرحمن الرحیم

بسم الله الرحمن الرحیم
واکنش زنجیره ای پلی مراز :

مخترع واکنش PCR کَری مولیس (Kary Mullis) می باشد که در سال 1983 این روش را جهت تکثیر DNA معرفی کرد.

قبل از این کشف، ساخت قطعات DNA با روش های کند و پر هزینه شیمیایی انجام می گرفت.

به دلیل اهمیت این اختراع، کاربردهای فراوان و نقش ارزنده آن در پیشرفت علم ژنتیک و زیست شناسی مولکولی، وی جایزه نوبل شیمی را در سال 1993 دریافت کرد.

واکنش PCR به طور روزمره در اکثر آزمایشگاه های تشخیصی و تحقیقاتی استفاده می شود و در موارد بسیاری مثل :
شناسایی و جداسازی ژن ها
کلونینگ
طبقه بندی و شناسایی موجودات زنده
تشخیص بیماری های ژنتیکی
و حتی پرونده های جنایی و تعیین هویت کاربرد دارد.

استخراج ماده ژنتیکی
اولین قدم در مهندسی ژنتیک جداسازی با خالص سازی DNA و RNA می باشد. که این کار دارای مراحلی است که عبارتند از : 1) شکستن سلول
سلول های حیوانی(شوک اسمزی- سدیم دودسیل سولفات)
سلول های گیاهی (پکتیناز و سلولاز)
باکتری ها با توجه با گرم مثبت یا گرم منفی
2) رسوب دادن DNA و RNA :
الکل سبب تجمع و رسوب ماده ژنتیکی می شود.
3) جدا کردن DNA وRNA :
4) رسوب پروتئین ها : (استفاده از فنل و یا محلول های غلیظ نمک های مختلف)
5) جداسازی DNA و RNA از یکدیگر: (استفاده از DNase و RNase)
6)رسوب ماده ژنتیکی با اتر
7) اسپکتروفتومتری:(جهت تایید استخراج)

PCR یا واکنش زنجیره ای پلیمراز (Polymerase Chain Reaction)
تکنیکی است که با استفاده از آن می توان در مدت زمان کوتاهی قطعه خاصی از مولکول DNA را در شرایط آزمایشگاهی میلیون ها بار تکثیر نمود.
این قطعه DNA ممکن است:
یک ژن
بخشی از یک کروموزوم
یا بخش هایی از ژنوم یک موجود باشد.

اساس این روش بسیار ساده بوده و مانند واکنش همانندسازی DNA در موجودات زنده توسط آنزیم DNA پلیمراز صورت می گیرد.

در موجودات زنده، مجموعه ای از چند پروتئین و آنزیم در فرآیند همانند سازی DNA نقش دارند در حالی که در واکنش PCR تنها نوع خاصی آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت به نام Taq polymerase به همراه بافر، کلرید منیزیم و نوکلئوتیدها جهت تکثیر قطعات DNA استفاده می شود.

ساز و کار (برنامه) واکنش PCR
اساس واکنش PCR جهت تکثیر توالی DNA دو رشته ای، تغییرات دمایی می باشد. در ابتدا پیوندهای هیدروژنی دو رشته توالی DNA با حرارت (94-95 درجه سلسیوس) شکسته و دو رشته از یکدیگر جدا می شوند.

سپس دمای واکنش پایین آورده می شود (معمولاً 50 تا 60 درجه سلسیوس). در این مرحله، دو قطعه کوتاه DNA تک رشته ای (معمولاً بین 18 تا 30 نوکلئوتید) که دقیقاً مشابه دو طرف قطعه DNA مورد نظر برای تکثیر طراحی و ساخته شده اند (با نام پرایمر یا آغازگر)، به توالی های مکمل خود در دو رشته باز شده DNA متصل می گردند. این دو قطعه انتهای 3’ آزاد جهت فعالیت آنزیم DNA پلیمراز را فراهم می نماید، کاری که در همانند سازی در موجودات زنده توسط آنزیم پریماز و توالی اولیه ساخته شده توسط آن انجام می گیرد.

در مرحله بعد، دمای واکنش تا 72 درجه سلسیوس (دمای مناسب آنزیم Taq polymerase) افزایش یافته و عمل تکثیر قطعه DNA مورد نظر بین دو پرایمر با استفاده از نوکلئوتیدهای موجود، توسط آنزیم Taq polymerase مقاوم به حرارت انجام می پذیرد.

DNA IN THE CELL
NUCLEUS
MITOCHONDRION

DNA STRUCTURE DEOXRIBO NUCLEIC ACID
DEOXYRIBOSE

DNA STRUCTURE
P
P
P
P
P = PHOSPHATE

DNA STRUCTURE
P
P
P
P
BASE
=
cytosine adenine thymine guanine
C
A
T
G
T
BASE
BASE
BASE
BASE
BASE

DNA STRUCTURE
P
P
P
P
P
P
C
G
A
T
T
G
A
C

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
DNA

Denature DNA by heating

Primers (short pieces of DNA) bind to specific parts

New DNA made by
DNA polymerase + subunits of DNA

New DNA made by
DNA polymerase + subunits of DNA

repeat cycling

PCR

مرحله اول: واسرشت سازی (Denaturation)، 30 تا 60 ثانیه
عمل انجام شده در این مرحله: جدا شدن دو رشته DNA
مرحله دوم: اتصال (Annealing)، 30 تا 60 ثانیه
عمل انجام شده در این مرحله: اتصال پرایمرها به نواحی مکمل روی DNA و تعیین محدوده تکثیر قطعه DNA
مرحله سوم: گسترش (Extension یا Elongation)، به ازای هر 1000 نوکلئوتید طول قطعه 60 ثانیه
عمل انجام شده در این مرحله: تکثیر قطعه DNA مورد نظر
این 3 مرحله بین 25 تا 40 بار تکرار می شود که به آن چرخه های PCR می گویند.

heated lids
adjustable ramping times
single/multiple blocks
gradient thermocycler blocks
Thermocyclers

اجزا واکنش PCR
در یک واکنش PCR از:
نمونه DNA
آنزیم Taq polymerase
پرایمرها (0.1 – 2.0 μM)
بافر
یون منیزیم ( (1 – 5 mM
نوکلئوتیدها (20 –250 μM)
آب نوکلئاز فری

نمونه DNA (الگو)
< 0.1 ng plasmid DNA, 50 ng to 1 μg gDNA for single copy genes
قطعه ای از DNA
محصول استخراج DNA ژنومی
DNA پلاسمیدی
یا حتی محصول PCR از یک واکنش دیگر

معمولاً حدود یک نانوگرم از DNA پلاسمیدی یا فاژی یا یک میکروگرم از DNA ژنومی برای یک واکنش PCR کافی است.
بیش از این مقدار، باعث تولید محصولات غیر اختصاصی (قطعات DNA دیگری غیر از قطعه مورد نظر)می شود .
مقدار کم نمونه DNA نیز باعث کاهش دقت واکنش PCR یا عدم تکثیر قطعه مورد نظر می گردد.
کیفیت نمونه DNA نیز مهم است به طوری که باقی ماندن ترکیبات مورد استفاده در مرحله استخراج DNA مثل فنل و EDTA، باعث کاهش فعالیت آنزیم Taq polymerase و عدم حصول نتیجه مورد نظر می گردد.
همچنین آلوده شدن واکنش PCR با مقادیر بسیار اندک DNA از هر منبع دیگری، به دلیل حساسیت فوق العاده این تکنیک، ممکن است به تولید قطعات غیر قابل انتظار بیانجامد.

آنزیم Taq polymerase
این آنزیم برای تکثیر قطعات کمتر از سه هزار جفت باز توصیه شده و پر مصرف ترین آنزیم مورد استفاده در PCR می باشد.

اگرچه دمای مناسب برای این آنزیم 72 درجه سلسیوس می باشد ولی چون این آنزیم در دمای معمولی نیز قادر به تکثیر می باشد برای جلوگیری از اتصال قطعات پرایمر به نقاط دیگری روی توالی نمونه DNA و امکان تولید قطعات غیر اختصاصی، توصیه می شود که تمامی مراحل آماده سازی واکنش PCR بر روی یخ صورت گیرد.

نوکلئوتید ها
چهار نوکلئوتید تشکیل دهنده قطعه DNA از اجزا واکنش PCR می باشند که به عنوان واحد های ساختمانی مورد نیاز در ساخت قطعه DNA استفاده می شوند.

غلظت مورد نیاز از هر یک از نوکلئوتیدها برای واکنش PCR یکسان و برابر 200 نانو مولار می باشد. برای این منظور از مخلوط های آماده واجد هر چهار نوکلئوتید که با غلظت های مختلف مثل دو میلی مولار، 10 میلی مولار و 25 میلی مولار موجود است، استفاده می شود.

به طور مثال، در یک واکنش 50 میکرو لیتری PCR باید 5 میکرو لیتر از مخلوط دو میلی مولار نوکلئوتیدها برای دستیابی به مقدار مورد نیاز در واکنش استفاده کرد.

بافر
مهمترین نقش بافر PCR تنظیم pH مناسب واکنش PCR و آنزیم Taq polymerase می باشد.

اجزای این بافر نقش های دیگری نیز دارند از جمله کلرید پتاسیم که به اتصال پرایمر به DNA الگو (نمونه) کمک می کند.

یون منیزیم

یون منیزیم یکی از اساسی ترین اجزا واکنش PCR می باشد.
این یون برای اتصال پرایمر و قطعه DNA لازم است.
برای تکثیر با Taq polymerase این یون عمدتاً به صورت ترکیب کلرید منیزیم در واکنش PCR استفاده می شود.

غلظت بهینه یون منیزیم در واکنش PCR یک تا چهار میلی مولار است.

غلظت بالاتر از این مقدار باعث تکثیر قطعاتی غیر از قطعه مورد نظر (قطعات غیر اختصاصی) شده

غلظت پایین این یون نیز ممکن است به کاهش کارایی واکنش و میزان تولید قطعه مورد نظر منجر شود.

پرایمرها
غلظت بهینه پرایمرها برای واکنش PCR از 100 نانو مولار تا یک میکرو مولار متغییر است. غلظت بیش از این، منجر به تولید قطعات غیر اختصاصی می شود.
طول معمول پرایمرها : 18-24 باز باشد.
TM بین 52 تا 65 درجه سانتی گراد مناسب است .
تفاوت TM پرایمرها حداکثر 5 درجه سانتی گراد باشد .
بهتر است آغاز و انتهای پرایمر با یک یا دو باز پورین آغاز و خاتمه یابد .
پرایمر ها Blast شوند .(جلوگیری از دایمر)(بررسی اختصاصیت)
فرمول محاسبه TM:
TM=(A+T)*2+(G+C)*4
بهترین دمای انلینگ 3-5 درجه کمتر از TM است .

Melting Temperature :

Tm – the temperature at which half the DNA strands are single stranded and half are double-stranded.

Tm is characteristics of the DNA composition; Higher G+C content DNA has a higher Tm due to more H bonds.

وسایل مورد نیاز برای واکنش PCR
حداقل وسایل مورد نیاز برای انجام واکنش PCR:
دستگاه ترموسایکلر
میکرو پیپت
ظرف یخ
وسایل یکبار مصرفی :
مانند تیپ ، ویال و ظروف نگهداری آنها می باشد .

نکاتی در رابطه با تهیه واکنش PCR
نگهداشتن ویال بر روی یخ در طول زمان افزودن اجزاء واکنش و مخلوط کردن آنها.

تهیه واکنش در زیر جریان هوای یک هود لامینار استریل (درمواردی که در محل آزمایشگاه ازنوع DNA الگوی مورد نظر کار ما زیاد استفاده می شود)

بهتر است ابتدا آب واکنش در ویال کوچک ریخته شود.

به حداقل رساندن شانس اتصال پرایمر به DNA (ترجیحاً DNA الگو آخرین افزودنی قبل از آنزیم باشد)

افزودن آنزیم پلیمراز به عنوان آخرین ماده واکنش.

PCR PROCESS

Denaturation 15 Sec- 2 min 95 C

Annealing 30- 60 Sec 40-60 C

Extension 1-2 min 72 C

jhj

نکاتی در رابطه با مشاهده باند غیر اختصاصی
غلظت پرایمر خیلی زیاد است.
دمای Annealing پائین است خصوصاً در سیکل های اول دمای پائین Annealing سبب اتصال غیر اختصاصی پرایمر به الگو می گردد.
می توان غلظت یون منیزیم را کاهش داد
غلظت dNTP خیلی بالا است.
دناتوراسیون DNA الگو بطور کامل نیست.
زمان سیکل ها را می توان کمی کاهش داد.
سرعت RAMP خیلی کند است.
گاهی انجام یک واکنش NESTED PCR باند اضافی را حذف می کند.
بریدن باند مورد نظر از روی ژل آگارز، تخلیص آن و سپس Reamplify آن نیز توصیه می گردد.
در طراحی پرایمر اشکال بوده است

انواع روشهای PCR

مالتیپلکس پی سی آر (‏(Multiplex-PCR‏ :
– یکی از روش های تغییریافته ‏PCR‏ است که در آن با استفاده از پرایمرهای مختلف می توان چندین جایگاه را مورد بررسی قرار داد و از چندین جفت پرایمر اختصاصی جهت تکثیر استفاده می شود. کاربردهای این روش می تواند شامل موارد زیر باشد:
‏ ‏1) بخش های بزرگی از یک ‏DNA‏ (هدف)، جهت جست وجوی تغییرات می تواند بررسی شود.
‏2) بخش های غیرمربوط به هم در ژنوم هدف می تواند مورد آزمایش واقع شود.
‏3) می توان از طریق این روش با پرایمرهای مختلف به جست وجوی عوامل مختلف پرداخت، مانند شناسایی عوامل شایع مننژیت. این روش بیشتر برای شناسایی جایگاه هایی از ژن ها به کار می رود که انواع زیادی از جهش در آنها به وقوع می پیوندد.‏

زمانیکه بهترین شرایط اتصال فراهم شود باندهای غیر اختصاصی ممکن است قبل از انجام اولین چرخه PCR ایجاد شود .

حتی تا وقتی که دمای لوله ها تا70-65 درجه سانتی گراد افزایش می یابد اتصالات غیر اختصاصی پرایمر/پرایمر و پرایمر/ الگوممکن است بوجود آید و بعنوان سوبسترای اولیه برای DNAپلیمراز عمل کند.

ساده ترین روش برای جلوگیری ازچنین اتصالات اولیه غیراختصاصی و بهترکردن شرایط اتصال صحیح پرایمر، استفاده از روش Hot start است که اساس این روش بر جدا کردن مواد واکنش تا زمان رسیدن به دمای بالا می باشد.

یک یا چندماده قبل از رسیدن به دمای بالاتر از 70 درجه سانتی گراد از واکنش جدا می شود و پس از رسیدن به دمای بالا در واکنش وارد می کنند.

روشهای جداسازی :

فیزیکی
شیمیایی
Hot-Start PCR:

PCR Real time

این روش کمی است .

– در این سیستم یک ماده فلورسانت در طی واکنش متناسب با میزان محصولات هرسیکل آزاد میشود و میزان فلورسانت آن توسط دتکتورشناسایی وثبت میگردد و بدین ترتیب میزان DNAتکثیر شده طی یک چرخه تا چرخه بعدی را میتوان اندازه گیری کرد.

– میزان محصول در هرچرخه قابل ردیابی است در حالیکه محصول روشهای سنتی پس از پایان واکنش و الکتروفورز مشخص میشود.

روشهای سنجش با Real time PCR :
1- استفاده از رنگهای فلورسنت مثل سایبرگرین:همزمان با دورشته ای شدن DNA سایبرگرین به شیار کوچک DNAمتصل میشود و با جذب طول موج 498نانومتری، نور522 نانومتری را ساطع میکند. با افزایش مقدار محصول PCRرنگ بیشتری متصل میشود و میزان فلورسانس افزایش می یابد، پس میزان فلورسانس متناسب با مقدار DNA دو رشته ای در واکنش است اما مهمترین عیب آن اتصال به دو رشته هایی مثل پرایمردایمر و دیگر باندهای غیراختصاصی است که باعث می شود نتایج بیشتر از غلظت اصلی برآورد شود.
2- استفاده از پروبهای فلورسنت:پروبها برخلاف سایبرگرین بر اساس تشخیص اختصاصی توالی محصول کار میکنند.

آرتی – پی سی آر (‏RT-PCR‏)
به خاطر اینکه آنزیم DNA پلی مراز به DNA دو رشت ای برای رونوشت برداری نیاز دارد، لذا بایستی ابتدا RNA را به cDNA(complementary DNA) DNA- مکمل- تبدیل کنیم .
این روش به ‏PCR‏ نسخه برداری معکوس نیز معروف است که ماده اولیه در آن ‏RNA‏ است. اولین مرحله در این روش تبدیل ‏RNA‏ به ‏cDNA‏ توسط آنزیم نسخه بردار معکوس صورت می گیرد (‏RT‏).
برخی از موجودات مانند برخی از ویروس های ‏RNAدار، ژنومشان تنها از ‏RNA‏ ساخته شده است.
کاربرد این آنزیم به دلیل آن که آنزیم به حرارت حساس بود در ابتدا پایین بود ولی با کشف باکتری به نام "ترموس ترموفیلوس" یک ‏DNA‏ پلیمراز مقاوم به نام (‏Tth‏) بهبود یافت که در حضور یون ‏Mn+2‎‏ دارای فعالیت نسخه برداری معکوس است و در دمای 72 درجه سانتیگراد توسط این آنزیم از روی ‏RNA، ‏DNA‏ ساخته می شود و سپس ‏Mn+2‎‏ اضافی توسط اتیلن گلیکول تترااستیک اسدی (‏EGTA‏) حذف می شود و سپس این آنزیم از ‏DNAای که خود ساخته استفاده و آن را تکثیر می کند.‏

آرمز پی سی آر (‏ARMS-PCR‏)
‏- این روش تکثیری قدرتمند برای مشخص کردن جهش های نقطه ای است.
در این روش از پرایمرهای جهش یافته و طبیعی در دو لوله جداگانه استفاده می شود.
اگر عمل پلیمریزاسیون در لوله حاوی پرایمر طبیعی انجام شود، نشان دهنده نبود جهش نقطه ای در باز مورد نظر است و اگر عمل پلیمریزاسیون در لوله حاوی پرایمر جهش یافته انجام شود، نشان دهنده حضور جهش نقطه ای در باز مورد نظر است.

نستد پی سی آر (‏Nested-PCR‏)
در این روش از دو جفت پرایمر استفاده می شود، طوری که جفت دوم در بین جفت اول جای می گیرد.
در این روش ابتدا پرایمر بیرونی توالی هدف در طول 30-15 چرخه تکثیر می شود، سپس محصول ‏PCR‏ حاصل به لوله ای دیگر منتقل می شود و به عنوان الگو و با استفاده از جفت پرایمر داخلی مرحله دوم ‏PCR‏ انجام شده و ترادف کوچکتری از ‏DNA‏ که درون ‏PCR‏ اولی است، به اندازه 40-15 چرخه تکثیر می شود.‏
مزایای این روش تغییر یافته ‏PCR‏ عبارت است از:
نیاز به تاییدهای بعدی کمتر است.
حساسیت در این روش به میزان زیادی بالاتر است .
به دلیل انتقال محصول ‏PCR‏ دور اول به لوله جدید، ممانعت کننده ها رقیق می شود.

این روش در تعیین جنسیت جنین در سه ماهه اول بارداری استفاده شده و از این طریق توانسته اند بیماری های وابسته به جنس را تعیین کرده و از تولد کودکان بیمار جلوگیری کنند.‏ همچنین ویروس "سیتومگالوویدوس" که می تواند سبب ناشنوایی در 1% از کودکان شود، توسط این روش تشخیص داده شده و امکان درمان زودهنگام از این طریق امکان پذیر است. جنین های مبتلا به سندروم داون نیز در مرحله بارداری مادر با این روش تشخیص داده شدند.

ELECTROPHORESIS
+ VE
– VE

ELECTROPHORESIS
+ VE
– VE

ELECTROPHORESIS
+ VE
– VE

ELECTROPHORESIS
+ VE
– VE

الکتروفورز

DNA Size from Agarose Gel Electrophoresis: Compares unknown DNA to known size standards

پایان