دستگاه اسپکتروفتومتری



عنوان:

استاد مربوطه:

تهیه کننده:

آشنایی با دستگاه اسپکتوفتومتری

مقدمه
اسپکتروفتومتری
اسپکتروفتومتر یا طیف سنج یک دستگاه آزمایشگاهی اولیه است که جهت خواندن نتایج آزمایش هایی که واکنش آن ها از نوع End point هستند به کار می رود. این دستگاه میزان جذب یا عبور طول موج های مشخصی از انرژی تابشی (نور) از یک محلول را اندازه گیری می کند بیشترین کاربرد آن در آزمایشگاه، در بخش بیوشیمی است.اساس کار اسپکتروفتومتر همانند بسیاری از دستگاه های آزمایشگاهی، بر اندازه گیری میزان نور جذب شده توسط یک محلول رنگی است که طبق قانون بیر-لامبرت میزان جذب نور (OD) متناسب با غلظت ماده حل شده در محلول است.
روشهای طیف سنجی براساس بر هم کنش تابش الکترومغناطیسی با ماده بنیان گذاری شده است و چون امواج الکترومغناطیس، حاصل کاهش سرعت ذرات با بار الکتریکی است بنابراین توسط ماده جذب شده و سبب افزایش سرعت ذرات می گردد. علاوه بر این انرژی نورانی در بر هم کنش با ماده و جذب آن توسط ماده، باعث برانگیختن ماده به ترازهای انرژی بالا تر می گردد. بنابراین بسته به شدت و قدرت انرژی وارده به ذره با ماده بر هم کنش کرده و پدیده خاصی را سبب می گردد که اساس اندازه گیریهایی نظیر اسپکتروفتومتری را تشکیل می دهد. و می تواند شامل کلیه نواحی طیف الکترومغناطیس از اشعه گاما و ناحیه مریی تا امواج رادیویی باشد. در این رابطه، روشهای جذب، نشر، شکست، پراش (Diffraction) و پلاریزه شدن نور را می توان مورد توجه قرار داد که مهم ترین آن ها روشهای اسپکتروفتومتری جذبی و نشری و فلورسانس است.
طول موج نور مریی بیشتر و در نتیجه انرژی آن کمتر از UV است. در اثر تابش نور به ماده در آن نقل و انتقالات الکترونی صورت می گیرد، e ها تحریک شده و به سطوح انرژی بالا تر می روند. بسته به ساختمان شیمیایی جسم، نقل و انتقالات الکترونی مختلفی می تواند صورت گیرد، و محل جذب بستگی به ساختمان شیمیایی ماده دارد. بنابراین ازgmaxبرای شناسایی مواد استفاده می شود که طول موجی است که در آن حداکثر جذب صورت می گیرد و برای تعیین غلظت جسم مجهولgmaxرا به نمونه می تابانیم. مقدار جذب از قوانین جذب Bear & Lambert پیروی می کند و از رابطه A=e lcمحاسبه می شود.
معمولا در محدوده ای که جذب با غلظت رابطه خطی دارد، تعیین مقدار انجام می شود. اگر غلظت نمونه و استاندارد به هم نزدیک باشد و غلظت ها هم در محدوده خطی باشند، می توان با استفاده از تناسب محاسبات را انجام داد.
کووت
کــووت هــا مـحـفـظــه هــای شـفــافــی هـستنـد کـه مـحـلـول مـورد آزمـایـش در آن ریـخـتـه شـده و در جایگاه خاص خود که در مسیر نور تکرنگ تعبیه شده است قرار می گیرد. کووت ها با توجه به نوع مصرف، جنس، شکل و حجم متفاوتی دارند. برای مـحـلــول هــای اسـیــدی و قـلـیــایـی از کـووت هـای مـخـصوص شیشه ای و برای طول موج های زیر 320 نـانـومـتـر از لـولـه کوارتز یا پلاستیک استفاده می شود.
کالیبراسیون
کالیبراسیون اسپکتروفتومتر، فرایندی است که در آن مراحلی جهت تضمین صحت کار دستگاه به کار گرفته می شود. این روش تضمین می کند که اندازه گیری های به دست آمده توسط وسیله مورد نـظــر دقـیــق هـسـتـنــد. روش کــالـیـبــراسـیــون بــرای مدل های مختلف متفاوت است با این حال اکثر تـولـیـدکـنـنـدگـان کـتـابـچـه راهـنـمـایـی را کـه شـامل جزئیات کالیبراسیون و نحوه کار با دستگاه است، برای استفاده کاربران فراهم می کنند.
اسپکتروفتومتر قادر است تا به عنوان فرستنده و گـیــرنــده نــور عـمـل کنـد. ایـن وسیلـه بـرای آنـالیـز نمونه هایی از ماده تست، توسط عبور نور از درون نمونه و خواندن شدت طول موج ها مورد استفاده قــرار مــی گـیــرد. نـمــونــه هــای مـخـتـلـف نـور را بـه روش هـای مختلـف فشـرده مـی کننـد و بـه محقق اجازه می دهند تا توسط بررسی رفتار نور هنگام عبور از نمونه مورد نظر، با ساختار آن بیشتر آشنا شوند. در کالیبراسیون این وسیله، از یک محلول مرجع جهت تنظیم صفر دستگاه استفاده می شود.
در اسپکتروفتومتر تک پرتویی، یک پرتو نور تولید و دستگاه باید بعد از هر بار استفاده، کالیبره شود. در نــوع دو پــرتـویـی، پـرتـوهـا از طـریـق نمـونـه تسـت فرستاده می شوند و نمونه مرجع در همان زمان، دو مجموعه از نتایج را که می تواند به عنوان مرجع و کـــالــیـبــراسـیــون اسـتـفــاده شــود، تــولـیــد مــی کـنــد. کـالـیبراسیون می تواند در آزمایشگاه توسط افراد باتجربه نیز صورت گیرد. البته اگر دستگاه دچار آسیب یا مشکل جدی شود، باید جهت تعمیر و تنظیمات اولیه به کارخانه سازنده یا نمایندگی های معتبر ارجاع داده شود.
1-دستگاه را روشن کنید و 10 دقیقه منتظر بمانید تا دستگاه گرم و آماده به کار شود.
2-نور محفظه را تغییر دهید تا به طول موج مورد نظر برسید.
3-کووت را تا نیمه با محلول واکنش پر کنید. کووت نباید حاوی نمونه ناشناخته باشد.
4-دو طرف کووت را با دستمال پاک کنید.
5-آن را در مـحـفـظــه قــرار دهـیـد و درب آن را ببندید.
6-منتظر بمانید تا اندازه گیری تمام شود.
نحوه کار با اسپکتروفتومتر D 20/20
1-دستگاه را روشن کنید. اجازه دهید تا به مدت 15 دقیقه گرم شود.
2-طول موج مورد نظر را با دکمه قرار گرفته در کنار محفظه نمونه تنظیم کنید.
3-محفظه نمونه را بررسی کنید تا از خالی بودن آن مطمئن شوید. دکمه مربوط به تنظیم صفر را که در جـلـو و سـمـت چـپ اسـپـکـتـروفـتـومـتـر اسـت، بچرخانید تا مقدار صفر را نمایش دهد.
4- برای اطمینان از پاکیزگی و کاهش اشتباه در نتایج اندازه گیری، از دستکش استفاده کنید.
5- کووت را با آب مقطر پر کنید و آن را در نگـه دارنـده قـرار دهید. کووت را به سمت پایین فشار دهید تا در جای خود تراز شود. دقت کنید که خارج کووت تمیز و خشک باشد.
6-دکمه کنترل نور را که در جلو و سمت راست دستگـاه قـرار دارد، بچـرخانید تا مقدار عبوری یا جذب را بخواند.
7-سپس کووت نمونه را در محفظه قرار دهید. مقدار نشان داده شده را ثبت کنید.

اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه اسپکتروسکوپ
اسپکتروفتوم تر از دو بخش اسپکتروم تر و فتوم تر تشکیل شده است. اسپکتروم تر بخشی است که نور منوکروم را ایجاد کرده و دارای منبع نور، عدسی، شکاف ها، منوکروماتور (صافی، منشور یا ((Grating system) می باشد. بخش فتوم تر دارای اسباب سنجش نور می باشد.
۱- منبع نورانی: منبع نور مورد استفاده در اسپکتروفتوم تر بسته به ناحیه مورد استفاده، متفاوت می باشد. برای نورهای مرئی از لامپ تنگستن استفاده می شود که نورهایی با طول موج بین ۳۵۰ تا ۸۰۰ نانوم تر ایجاد می کند. و برای نورهای ماوراء بنفش (UV) از لامپ جیوه، هیدروژن استفاده می شود. این لامپ ها در ناحیه بین ۲۰۰ تا ۶۰۰ نانوم تر بکار می روند. در دستگاههای پیشرفته تر هر دو نوع لامپ وجود دارد.
۲- عدسی ها: (آینه ها): برای کنترل کردن مسیر نور، وجود عدسی لازم است. به جای عدسی ها از آینه هایی که به شکل نیمدایره یا محدب ساخته شده اند می توان استفاده نمود.
۳- شکاف ها (slits): در هر اسپکتروفتومتری دو شکاف وجود دارد: یکی را شکاف ورودی و دیگری را خروجی می گویند. شکاف ها رل مهمی در جداکردن نور دلخواه با طول موج مشخص دارند. به همین جهت اندازه این شکاف ها بسیار مهم هستند. بیشتر دستگاه ها پیچی دارند که اندازه این شکاف ها را می توان برحسب احتیاج تغییر داد. هر چه طول این شکاف ها بیشتر باشد پهنای نور عبوری (band-pass) بیشتر بوده و دامنه طول موج آن نیز زیاد می باشد و به عبارت دیگر نورهای دیگری که مورد نیاز نیستند عبور می کنند. این نور اضافی را Stray light می نامند
۴- منوکروماتور (monochromators): اشعه نورانی پس از عبور از عدسی ها و شکاف مقدار و مسیر آن ها کنترل شده سپس به دستگاهی که می تواند نور پلی کروم را به منوکروم تبدیل کند وارد می شود. پس نوری با طول موج مشخص و انتخابی به وجود می آورند. دو نوع منوکروماتور وجود دارد منشور و Grating.
۵- محل نمونه: ظرف محتوی نمونه را سل یا کووت (cuvett) می نامند که از جنس شیشه، کوارتز یا پلاستیک است. برای اندازه گیری شدت رنگ محلول ها و بلانک بکار می رود. سلهای شیشه ای و پلاستیکی برای ناحیه مرئی به کار می رود و در ناحیه ماوراء بنفش از سل کوارتز استفاده می شود. طول سل ها معمولا ۱ سانتی متر است و سلهایی با طول cm ۱/۰تا cm ۱۰نیز موجود می باشد. محل قرار گرفتن نمونه بسته به اینکه دستگاه جایگاه جدا برای رفرنس (بلانک) دارد یا نه، Single beam و Double beam نام دارد. و کووت ها برحسب نوع شیشه و شکل چند نوع می باشند.
۶- دتکتور (نور سنج): نور پس از عبور از عدسی ها و شکاف ها و منوکروماتور به محلول لوله آزمایش رسیده و از آنجا به نورسنج می رود. اسباب منوکروماتور، نور دلخواه و با طول موج مشخص را به لوله آزمایش می تاباند. رنگ این نور مکمل رنگ محلول است. اگر رنگ محلول سبز- آبی (مثل تعیین مقدار گلوکز بوسیله ارتو تولوییدین) به طول موج nm ۴۹۵-۴۷۵باشد رنگ فیلتر- منشور یا گریتینگ باید نارنجی یا نزدیک آن با طول موج بین nm ۶۲۰-۶۰۰باشد. چون رنگهای نارنجی مکملش سبز-آبی است. بنابراین وقتی منوکروماتور رنگ مکمل رنگ محلول را به لوله آزمایش می تاباند مقداری از آن به وسیله محلولی که در لوله وجود داشته و بستگی به غلظت مواد مورد آزمایش دارد، جذب شده و بقیه آن به نورسنج می رسد. نورسنج با تبدیل انرژی نورانی به انرژی الکتریکی قادر است که مقدار جذب این نور را به وسیله محلول و یا درصد ترانس – می تانس آن اندازه گیری نماید. دتکتور ها شامل انواع فتوشیمیائی، فتوالکتریکی و حرارتی می باشد که در ناحیه مرئی و ماوراء بنفش از دتکتورهای فتوالکتریکی مانند فتوولتتیک و فتوتیوب و فتومولتی پلایر تیوب استفاده می شود.
۷- رکوردر (الکتریک سنج) در اسپکتروفتوم تر احتیاج به دستگاهی است که جریان الکتریکی دتکتور را اندازه بگیرد. دو سیستم گالوانوم تر و نول پوینت وجود دارد که در اسپکتروفتومترهایی که دارای نواحی مرئی باشند معمولا از یک گالوانوم تر یا صفحه دیجیتالی استفاده می شود. دیاگرام زیر، طرح یک اسپکتروفتوم تر ساده را نشان می دهد.
روش کار:
۱- پس از اتصال به برق مدتی باید صبر کرد تا دستگاه گرم شود
۲- انتقال دستگاه را صفر می کنیم.(فقط یک بار و در همان ابتدای کار با دستگاه)
۳- محلول بلانک را در جای مخصوص سل قرار داده و روی موج400 نانومتر قرار می دهیم. سپس جذب دستگاه را صفر میکنیم.
4 – محلول برمو فنل رد (ا میلی گرم بر لیتر) را در جای سل دستگاه گذاشته و مقدار را یادداشت می کنیم.
5- سپس اندازه گیری مقدار جذب را برای طول موج های 420 تا 700 نانومتر انجام می دهیم.(مقدار طول موج هر بار 20 نانو متر افزایش می دهیم). باید توجه داشت که هر بار بعد از تغییر طول موج دستگاه، باید مقدار جذب را با محلول بلانک صفر کرده و سپس اندازه گیری را انجام دهیم.
6 -مقدار طول موج ماکزیمم را بدست می آوریم.
7- سپس6 محلول 5 سی سی تهیه می کنیم، به طوری که به ترتیب شماره( 1 تا 6 )، 0 سی سی ، 0.5 سی سی ، 1 سی سی ، 1.5 سی سی ، 2 سی سی ، و 2.5 سی سی از محلول برموفنل رد در آنها میریزیم و ما بقی باقی مانده از 5 سی سی را آب مقطر می ریزیم.
8 – سپس طول موج را بر روی مقدار 580 قرار داده و محلول شماره 1 (که همان بلانک محسوب می شود) را در دستگاه گذاشته و مقدار جذب را صفر می کنیم. برای بقیه محلول ها، مقدار جذب را انذازه میگیریم.
اسپکتروفتومتر نشر شعله ‏‎(Flame):
ساختمان این دستگاه شبیه اسپکتروفتومتر یا فتومتر ساده است با این تفاوت که در فتومتر، لامپ الکتریکی و در این دستگاه نور حاصل از سوختن ماده مورد آزمایش در درون شعله به عنوان منبع نوری در نظر گرفته می شود. در طیف سنجی نشر شعله، نور حاصل مستقیما اندازه گیری می شود.
اسپکتروفتومتر جذب اتمی ‏‎(Atomic Absorption):
اسپکتروفتومترهای جذب اتمی ‏‎(AAS)‎‏ غلظت عناصر فلزی که از نظر پزشکی برای حفظ سلامتی مهم است را اندازه گیری می کند. در خصوص این عناصر می توان به کلسیم، منیزیم، مس، روی و آهن اشاره نمود. اسپکتروفتومترهای جذب اتمی همچنین برای تعیین اینکه آیا سطح درمانی داروهایی نظیر لیتیم در خون، تامین شده است یا خیر و همچنین برای آشکارسازی و تعیین کمیت سموم فلزی مورد استفاده قرار می گیرد
قانون کمی جذب یا قانون بیر-لامبرت:
این قانون اساس تجزیه کمی در جذب سنجی را تشکیل می دهد.هرگاه یک نور تکفام با شدت I عمد بر سطح تابش دارد که یک محلول همگن و شفاف به ضخامت L و غلظت مولکولی C گردد،قسمتی از آن جذب می شود ( Ia) ،بخشی منعکس ( Ir) ، و قسمت دیگر از محلول عبور می کند و در امتداد شعاع تابش خارج می گردد ( It) بنابراین رابطه ی زیر برقرار است":
It + Ia+Ir= Io

روش محاسبه:
XC X 100 جذب نور X=
جذب نمونه استاندارد
2-LOG T% =جذب A

طول موج
مقدار جذب
400
420
440
460
480
500
520
540
560
580
600
620
640
660
680
700
0.048
0.058
0.067
0.070
0.075
0.090
0.123
0.174
0.255
0.373
0.110
0.030
0.023
0.014
0.008
0.004
6
5
4
3
2
1
شماره لوله
2.5
3
3.5
4
4.5
5
آب مقطر
2.5
2
1.5
1
0.5
0
برموفنل رد
0.135
0.108
0.087
0.052
0.026
0
OD
0.0005
0.0004
0.0003
0.0002
0.0001
0
c
270
270
290
260
260
0
k
مشاهدات:

فرمول های محاسبه c و k:

نتایج و نتیجه گیری کلی:

1- طول موج با ماکزیمم جذب: 580
2- با افزایش غلظت ماده ای که جذب نوری آن را اندازه می گیریم، مقدار جذب به طور خطی افزایش می یابد.
3- مقدار ضریب جذب ویژه ماده ای که جذب آن را اندازه می گیریم، مقدار ثابتی است.( در اینجا حدود 260 شد.)

Reference:
اسپکتروفتومتر یا طیف سنج یک دستگاه آزمایشگاهی اولیه است که جهت خواندن نتایج آزمایش هایی که واکنش آن ها از نوع End point هستند به کار می رود. این دستگاه میزان جذب یا عبور طول موج های مشخصی از انرژی تابشی (نور) از یک محلول را اندازه گیری می کند بیشترین کاربرد آن در آزمایشگاه، در بخش بیوشیمی است.اساس کار اسپکتروفتومتر همانند بسیاری از دستگاه های آزمایشگاهی، بر اندازه گیری میزان نور جذب شده توسط یک محلول رنگی است که طبق قانون بیر-لامبرت میزان جذب نور (OD) متناسب با غلظت ماده حل شده در محلول است.
روشهای طیف سنجی براساس بر هم کنش تابش الکترومغناطیسی با ماده بنیان گذاری شده است و چون امواج الکترومغناطیس، حاصل کاهش سرعت ذرات با بار الکتریکی است بنابراین توسط ماده جذب شده و سبب افزایش سرعت ذرات می گردد. علاوه بر این انرژی نورانی در بر هم کنش با ماده و جذب آن توسط ماده، باعث برانگیختن ماده به ترازهای انرژی بالا تر می گردد. بنابراین بسته به شدت و قدرت انرژی وارده به ذره با ماده بر هم کنش کرده و پدیده خاصی را سبب می گردد که اساس اندازه گیریهایی نظیر اسپکتروفتومتری را تشکیل می دهد. و می تواند شامل کلیه نواحی طیف الکترومغناطیس از اشعه گاما و ناحیه مریی تا امواج رادیویی باشد.
اسپکتروفتومتر
طیف سنج
دستگاه
آزمایشگاهی
اولیه
خواندن
نتایج
آزمایش
واکنش
نوع
End point
بکار
میزان
جذب
عبور
طول موج
مشخص
انرژی
تابشی
نور
محلول
اندازه گیری
افزایش
کنش
بالاتر
قدرت
شدت
خاص
اساس
طیف
اشعه
گاما
امواج
رادیویی
الکترومغناطیس
ناحیه
تحقیق
مقاله
آشنایی با دستگاه اسپکتروفتومتر
26