موضوع : قارچ، ویروس، نماتد و پروکاریوتها
استاد: سهیل نژاد
محقق: محمد ملکی مقدم
شماره دانشجویی: 900425639
مقدمه و خلاصه موضوع
در گونه های گیاهی هزاران ژن مقاومت (R) در برابر عوامل بیماری ویروسی ، باکتریایی ، قارچی و نماتدی وجود دارد . ظهور مقاومت در بر هم کنش میزبان و عامل بیماری مستلزم بیان ژن مقاومت (R) در میزبان و ژن غیربیماریزا (Avr) در عامل بیماری می باشد . باور بر اینست که ژنهای مقاومت گیاه را قادر می سازند که ژنهای غیر بیماریزا را شناسایی کرده ، فرآیند انتقال پیام را آغاز نموده و واکنش دفاعی را فعال سازند . رویدادهای انتقال پیام که منجر به ظهور مقاومت می شوند عبارتند از جریانهای یونی در عرض غشاء سلولی ، تولید گونه های اکسیژن واکنشی ، تغییر حالت فسفوریلاسیون ، فعالیت رونویسی از سیستم های دفاعی گیاه و مرگ سریع سلولی در موضع آلودگی ( واکنش فوق حساسیت ) . هرچند که پاسخهای دفاعی از سوی گیاه در تقابل با عوامل بیماری ، متفاوت می باشند ، اما خصوصیات مشترکی نیز بین آنها وجود دارد . مهمترین ویژگی ژن های R این است که این ژنها در گونه های مختلف گیاهی که سبب مقاومت اختصاصی در برابر طیف وسیعی از عوامل بیماری می شوند ، اغلب پروتئین هایی با ساختمان مشابه را رمز می نمایند . ژنهای R همسانه شده به چهار گروه اصلی تقسیم می شوند . یکی از آسان ترین ، به صرفه ترین و از لحاظ زیست محیطی ایمن ترین راهای کنترل بیماریهای گیاهی استفاده از ارقام مقاوم است و به نژاد گران بطور گسترده ای به طریقه کلاسیک از ژنهای مقاومت در این زمینه استفاده نموده اند . اکنون با دسترسی به ژنهای R همسانه شده ، فرصتی برای انتقال ژنهای R جدید به گیاهان از طریق تراریختی ژنتیکی فراهم آمده است . تا زمانی که این روشها از لحاظ قابلیت اعتماد ، انعطاف پذیری و هزینه با روشهای اصلاح نباتات کلاسیک قابل مقایسه نباشند و یا برتری نداشته باشند ، نمی توان انتظار داشت که بطور گسترده مورد استفاده قرار گیرند . با توجه به ظرفیت قوی این روشها در عبور از موانعی همچون تفاوت گونه ای و صف آرایی ژنهای R به فرم دلخواه به نظر می رسد که تراریختی در آینده ای نزدیک در برنامه های اصلاحی وارد شود .
گیاه ، عامل بیماری و اساس ژنتیکی دفاع گیاهی
عوامل بیماری در تهاجم به گیاهان یکی از سه راهبرد ذیل را بر می گزینند ، نکروتروفی1 ، بیوتروفی2 و یا همی بیوتروفی3 . نکروتروفها ابتدا سلول میزبان را می کشند و سپس محتوای آن را متابولیزه می کنند ، برخی از این عوامل بیماری دامنه میزبانی گسترده ای را در بر می گیرند و مرگ سلولی اغلب توسط سموم و یا آنزیمهایی رخ می دهد که سوبسترای بخصوصی را مورد هدف قرار می دهند. Pythium و Botrytis نمونه هایی از نکروتروفهای قارچی هستند . سایر نکروتروفها سمومی تولید می کنند که میزبان گزینشی4 دارند ، بطوریکه این سموم فقط روی دامنه محدودی از میزبانهای گیاهی موثر می باشند . در مورد این گروه از عوامل بیماری ، مقاومت گیاهی از طریق حذف و یا تغییر ترکیب مورد هدف سم و یا از طریق سم زدایی قابل حصول است . به عنوان مثال ژن Hml در ذرت سبب مقاومت به قارچ لکه برگی Cochiobolus carbonum می شود . Hml یک آنزیم ردوکتاز را کد می کند که سم HC5 حاصل از C.carbonum را خنثی می سازد .
اوامل بیماری بیوتروف و همی بیوتروف به سلولهای زنده حمله می کنند و سوخت و ساز سلولی را در جهت رشد و تکثیر خود تغییر می دهند . تشکیل اشکالی به صورت جزایر سبز رنگ روی برگهای پیر در پیرامون آلودگی بیوتروفی مربوط به قارچهای زنگ و سفیدک پودری نشان دهنده اهمیت زنده نگه داشتن سلولهای میزبان در طی ارتباط نزدیک بین عامل بیماری و گیاه است . بیوتروفها تنها روی یک و یا تعداد محدودی از گونه های مربوط بیماری ایجاد می نمایند . در مقابل قارچهای همی بیوتروف از قبیل جنسهای Phytophtora و Cilletotrichum در مراحل بعدی آلودگی ، سلولهای پیرامون را در میزبان می کشند . به علت طبیعت اختصاصی عمل کردن عوامل بیماری بیوتروف و همی بیوتروف تعجب آور نیست که تغییر کوچک در هر یک از طرفین ( میزبان یا عامل بیماری ) سبب بر هم خوردن تعادل گردد . ناسازگاری بین عامل بیماری و میزبان اغلب منجر به فعال شدن پاسخهای دفاعی گیاه از قبیل مرگ موضعی سلول میزبان یا واکنش فوق حساسیت ( HR ) می شود .
فرضیه ژن در برابر ژن
در گونه های گیاهی هزاران ژن مقاومت (R) در برابر عوامل بیماری ویروسی ، باکتریایی ، قارچی و نماتدی وجود دارد . هرچند که پاسخهای دفاعی از سوی گیاه در تقابل با عوامل بیماری ، متفاوت می باشند ، اما خصوصیات مشترکی نیز بین آنها وجود دارد که مهمترین آنها این است که عمل ژنهای R به ژنوتیپ عامل بیماری بستگی دارد . عوامل بیماری بطور بالقوه دارای توانایی ایجاد پیامهای گوناگون می باشند که به نحوی مشابه تولید آنتی ژنها توسط عوامل بیماری پستانداران می باشد . برخی از این پیامها توسط بعضی از گیاهان شناسایی می شوند . اگر ژن مربوط به بیماری در عامل بیماری پیامی را ایجاد کند که منجر به القاء یک پاسخ دفاعی قوی از سوی ژن R در گیاه گردد در آن صورت به آن ژن غیر بیماریزا6 (Avr) گویند . اما باید توجه داشت که در صورت عدم وجود ژن R در میزبان ، ژن Avr سبب ایجاد بیماری خواهد شد . عمل اختصاصی ژنهای R در میزبان در برابر ژنهای Avr در عامل بیماری نخستین بار توسط فلور کشف شد و متعاقب آن واژه مقاومت ژن در برابر ژن7 مطرح گردید . فلور پیشنهاد کرد در گیاه ژنی وجود دارد که در هنگام مواجه با عامل بیماری ، پاسخ دفاعی را القاء می نماید . اگر این ژن غایب و یا غیر فعال باشد ، گیاه نسبت به تهاجم عامل بیماری حساس خواهد بود . اما ، ژنهای مقاومت فقط در برابر انواع مشخصی از نژادهای عامل بیماری موثر می باشند . بنابراین عامل بیماری بایستی دارای ژنی باشند که محصول آن به طور مستقیم و یا غیر مستقیم با فرآورده ژن مقاومت گیاهی بر هم کنش نشان دهد که این ژنها در عامل بیماری به عنوان ژنهای غیر بیماریزا (Avr) نامیده شدند ، زیرا وجود آنها مانع توسعه عامل بیماری در حضور ژن مقاومت می شود . از این رو گیاهی که دارای یک ژن مقاومت مخصوص باشد فقط در برابر نژادی از عامل بیماری مقاومت نشان می دهد که واجد ژن معینی باشد که فرآورده آن باعث بر هم کنش پاسخ دفاعی شود . اگر عامل بیماری فاقد ژن غیر بیماریزایی مناسب باشد ، آنگاه هیچ گونه پاسخ دفاعی در گیاه رخ نخواهد داد و حتی علی رغم حضور ژنهای مقاومت بالقوه ، عامل بیماری گسترش خواهد یافت . مفاهیم ژن مقاومت در گیاه و ژن غیر بیماریزایی در عامل بیماری و در نتیجه پاسخ مقاومت ، اساس فرضیه ژن در برابر ژن را تشکیل می دهد . فرضیه ژن در برابر ژن مکانیسمی را پیشنهاد می نماید که فرآورده ژن مقاومت در گیاه از طریق بر هم کنش با فرآورده ژن غیر بیماریزا به حضور آن پی می برد . به علاوه ژن مقاومت باید دارای توانایی انتقال پیام8 ناشی از مکانیسم شناسایی به سیستم دفاعی گیاه باشد که این امر احتمالاً از طریق یک مکانیسم پیام رسانی صورت گرفته و منجر به بیان ژنهایی می شود که مانع رشد و گسترش عامل بیماری در بافتهای آلوده می شود .
مدل ژن در برابر ژن برای اکثر عوامل بیماری بیوتروف از جمله قارچها ، ویروسها ، باکتریها و نماتد ها صدق می کند . اعتقاد بر این است که خاستگاه هر گونه گیاهی جایی است که در آن بیشترین تنوع ژنتیکی موجود بوده و از این رو گیاهان همراه با عوامل بیماری تکامل پیدا کرده اند . بر این اساس برنامه های اصلاحی می تواند به سمت شناسایی ژرم پلاسم مقاوم در خویشاوندان وحشی گونه های زراعی سوق پیدا نماید . به غیر از مدل فلور ، چندین مدل ژن در برابر ژن ارائه گردیده است و با ایجاد لاین های ایزوژن مقاوم و حساس می توان تفاوت های آزمایشی ناشی از تغییر زمینه ژنتیکی را به حداقل رساند . با استفاده از این گونه بر هم کنشها اولین ژنهای R و Avr و Arabidopsis thaliana جداسازی شد . این گیاه در طی سالهای گذشته به عنوان یک سیستم مدل به نحو گسترده ای برای مطالعه بر هم کنش گیاه – عامل بیماری مورد استفاده قرار گرفته است .
هنگامی که یک ژن Avr و یک ژن R مختص به آن تظاهر می یابند پاسخ دفاعی قوی در گیاه القاء می شود . وجه مشخصه اکثر بر هم کنش های ژن در برابر ژن، ظهور پاسخ فوق حساسیت (HR) است که در آن سلولهای واقع در مجاورت عامل بیماری دچار مرگ برنامه ریزی شده9 می شوند . این واکنش به عنوان بخشی از پاسخ دفاعی کلی محسوب می شود . ویژگی های دیگر پاسخ مقاومت عبارتند از تولید متابولیک های ضد میکروبی ( تحت عنوان فیتوآلکسین ها10 ) ، تولید آنزیم هایی که می توانند برای عامل بیماری مضر ( باشد مانند کیتینازها11 و گلوکانازها12 ) و تقویت دیواره سلولی گیاهی در ناحیه آلوده شده . علاوه بر این پاسخهایی نیز بروز می یابند که گمان می رود در انتقال پیام دفاعی نقش دارند که از آن جمله می توان به جریان Ca2+ و سایر جریان های یونی ، تغییر فسفوریلاسیون پروتئینها ، تولید گونه های اکسیژن واکنشی13 از قبیل سوپراکسیداز و تولید و یا آزاد سازی اسید سالیسیلیک14 اشاره نمود .
باید توجه داشت که بسیاری از پاسخ های بیوشیمیایی فوق الذکر در غیاب بر هم کنش ژن در برابر ژن و در بر هم کنشی که طی آن بیماری توسعه می یابد ، نیز القاء می شوند . پاسخ هایی از قبیل بیان کیتیناز و بیوسنتز فیتو آلکسین ، نرخ رشد عامل بیماری را کاهش می دهند ولی آن را متوقف نمی سازند . بر عکس ، ژنهای R سبب فعال شدن دامنه وسیعی از پاسخ های دفاعی شده و در نتیجه موجب مقاومت موثر در برابر عامل بیماری می شوند . الیسیتورهای نژاد – اختصاصی15 در اثر بیان ژنهای Avr تولید می شوند که باید بین اینها و الیسیتورهای نژاد – غیر اختصاصی16 تمایز قائل شد . الیسیتورهای نژاد – غیر اختصاصی ، پاسخ هایی از قبیل سنتز فیتوآلکسین ها را القاء می کنند که بیماری را به حداقل می رسانند ، اما اینگونه الیسیتورها در گروه متمایز و متفاوتی از الیسیتورهای ناشی از ژنهای Avr قرار می گیرند که سبب القاء پاسخ دفاعی از سوی ژنهای R می شوند .
جداسازی و مطالعه ژنهای مقاومت
سوال این است که ژنهای R چه چیزی را رمز می کنند ؟ بیش از بیست سال پیش یک مدل الیسیتور – گیرنده برای توجیه بر هم کنش ژن مقاومت در مقابل ژن Avr مطح شد که در آن ژنهای Avr الیسیتورهایی را رمز می کنند که به عنوان لیگاند17 برای گیرنده هایی18 که توسط ژنهای R رمز می شوند عمل می نمایند . این مدل در برخی حالات می تواند معتبر باشد ولی نتوانست سبب تسهیل در امر جداسازی ژنهای مقاومت و یا فرآورده های آنها شود . موفقیت در جداسازی ژنهای مقاومت موکول شد به زمانی که تکنولوژی همسانه سازی گیاهی توسعه یافت . شناسایی عناصر متحرک در ذرت در این زمینه بسیار نوید بخش می نمود، اما نرخ بالای جهش خود به خودی در ژنهای R مورد نظر مانند Rpl در ذرت باعث شد که این امید عقیم گذارده شود . اما تلاش در این زمینه مقدمات آشنایی با جهش پذیری ژنهای R و اهمیت بیولوژیکی آن در ایجاد مقاومت های اختصاصی جدید را بنیان نهاد .
اولین ژن R که همسانه گردید ، Hml در ذرت بود که از لحاظ عمل متفاوت از گروه ژنهای R مربوط به Avr می باشد . Hml سبب ایجاد مقاومت در برابر نژاد شماره 1 عامل بیماری قارچی Cochliobolus carbonum می شود . Hml یک ردوکتاز وابسته به NADPH19 را کد می کند که قادر است سم قدرتمند تولید شده توسط قارچ مزبور را خنثی نماید . ساختمان و عمل Hml به نحوی است که نمی توان آن را در زمره ژنهای R قلمداد نمود زیرا نقش سم زدایی20 Hml ، در مواردی همچون ژنهای Avr القاء مرگ سلولی فوق حساسیت و سایر ویژگی های مربوط به بر هم کنش ژن در برابر ژن نمی گنجد .
با پیشرفت تکنولوزی های همسانه سازی موضعی21 ( گام زنی کروموزمی22 ) و نشانمند کردن ترانسپوزون هترولوگ23 ، جداسازی ژنهای مقاومت امکان پذیر شد و موفقیت هایی در این زمینه بدست آمد . فهرستی از ژنهای جدا شده در جدول 1 ارائه گردیده است . اولین ژن اختصاصی در گیاه ( برای Avr ) که جدا سازی شد ژن Pto بود که سبب مقاومت گوجه فرنگی بهPseudomonas syringae pv . tomato می شود . این ژن پروتئینی را رمز می نماید که شبیه پروتئینهای کینازی سرین – ترئونین24 می باشد .
نکته جالب این که پنج ژن R که پس از Pto جداسازی شدند ، شباهت زیادی به یکدیگر داشتند ولی شبیه Pto نبودند . این ژنها عبارتند از : RPS2 در آرابیدوپسیس ، N در تنباکو ، L6 در کتان ، و Cf-9 و prf در گوجه فرنگی که گروه جدیدی را تشکیل دادند . پروتئین های رمز شده توسط این گروه جدید دارای حوزه تکرارهای غنی از لوسین25 (LRR) هستند . سپس ژنهای RPM1 در آرابیدوپسیس ، Cf-2 در گوجه فرنگی و xa21 در برنج نیز جداسازی شده و مشخص گردید که پروتئینهای با حوزه LRR را رمز می کند ( جدول 1 ) . با استفاده از تجزیه توالی ها برخی ویژگی های ساختمانی ( علاوه بر LRR ) مشخص گردیده ، اما با جداسازی و تعیین خصوصیات هر ژن R جدید بر پیچیدگی این ویژگی های ساختمانی افزوده شده است . اولین و مهمترین ویژگی این است که ژنهای R در انواع متنوع گونه های گیاهی که در برابر دامنه وسیعی از عوامل بیماری ویروسی ، باکتریایی و قارچی بطور اختصاصی عمل می کنند ، پروتئین هایی را رمز می کنند که شباهت ساختمانی دارند . این شباهت نشان دهندَه این است که مسیرهای بیوشیمیایی مورد استفاده در گیاهان برای ایجاد پاسخهای دفاعی از نقطه نظر تکاملی از درجه بالایی حفاظت بالایی برخوردار می باشند ( بسیار حفاظت شده هستند ) .
حوزه های ساختمانی فرآورده های ژنهای مقاومت
الف) کینازهای سرین – ترئوتین
با همسانه سازی و تعیین خصوصیت ژن Pto ، نقش کینازها در انتقال پیام طی مقاومت ژن در برابر ژن مشخص گردید . یکی از مکانیسم هایی که در موجودات زنده برای کنترل فعالیت پروتئینها بسیار معمول است تغییر حالت فسفوریلاسیون26 می باشد که بطور وسیعی مورد مطالعه قرار گرفته است . تاکنون 11 حوزه فرعی و 15 واحد اسید آمینه غیر متغیر ( ثابت ) مربوط به پروتئین های کینازی مشخص شده و نواحی محفوظ کینازها که واحدهای سرین-ترئونین فسفوریله می نماید تعیین گردیده است . توالی اسید آمینه بدست آمده از ژن pto دارای نواحی حفاظت شده مذکور است و مشخص شده است که Pto در شرایط درون شیشه ای27 ، فعالیت کاتالیتیکی مربوط به پروتئین های کینازی را ظاهر می سازد .
توالی اسید آمینه ای Pto در انتهای N دارای یک جایگاه بالقوه برای مریستولاسیون28 است که یک لنگر غشائی را برای این پروتئین آب دوست29 ایجاد می نماید .
تکرارهای غنی از لوسیون
LRR ها تکرارهای متوالی و چند گانه ای با طول حدود 24 اسید آمینه می باشند. LRR ها شامل لوسیون و یا سایر اسید های آمینه آب گریز30 هستند که به فواصل منظم واقع شده اند و همچنین دارای اسید آمینه پرولین و آسپاراژنین به فواصل منظم می باشند . ساختمان کریستالی یکی از پروتئین های دارای LRR ، به نام مهار کننده Porcin Rnase ، تعیین گردیده است . ساختمان سوم این پروتئین شبیه مشت دست یا فنر پیچ خورده است که هر یک از انگشتان جمع شده در حکم یک LRR منفرد می باشد . این تکرارها در پروتئین مهار کننده Porcin Rnase بطور غیر طبیعی طویل می باشند ( هر یک 28 تا 29 اسید آمینه ) اما چنین تصور می شود که حوزه های LRR کوتاهتر ، ساختمانی شبیه زنجیره مارپیچی بتا31 داشته باشند . در هر دو حالت بنظر می رسد که عمل اختصاصی LRR بیشتر به اسید آمینه های بیرونی و کمتر به واحدهایی که آب گریز بوده متکی باشد . در بسیاری از توالی های LRR که تاکنون شناسایی شده اند ، نحوه قرار گرفتن تکرارها با هم همخوانی ندارد ، یعنی نمی توان به یک LRR مورد توافق دست یافت و در برخی حالات ، این افتراق32 به حدی است که نمی توان LRR مربوطه را واجد ساختمان منظم دانست . علاوه بر این نواحی LRR مفروض در برخی از ژنهای R توسط توالی کوتاهی از اسیدهای آمینه به دو نیم تقسیم شده است و تشکیل ساختمان LRR را غیر ممکن می سازد .
مشخص شده است که حوزه های LRR در پروتئین های مخمر ، مگس سرکه ، انسان و سایر گونه ها در بر هم کنش پروتئین – پروتئین نقش دارند . بطور مثال می توان به بر هم کنش بین اجزاء درون سلولی آبشار انتقال پیام ( مانند بر هم کنش بین ras و adenylade cyclase در مخمر ) و پیوند بین هورمونهای پیتیدی و گیرنده های غشائی ( مانند گیرنده های gonadotropin و هورمونهای تحریک کننده فولیکول33 ) اشاره نمود .
گیرنده های هورمونی مثال جالبی در رابطه با مدل الیسیتور – گیرنده در مقاومت ژن در برابر ژن می باشند و این فرض که LRR به عنوان حوزه اتصال فرآورده ژنهای R با لیگاند عمل می کند را تقویت می کند . LRR ها همچنین در کنش فرآورده های ژنهای R با سایر پروتئین هایی که در انتقال پیام دفاعی شرکت می کنند نقش دارند . از آنجا که فرآورده های ژنهای از نوع LRR را می توان به چند گروه مجزا تفکیک نمود تعجب آور نخواهد بود که در این گروه ها پروتئین هایی را بیابیم که از لحاظ عمل کاملاً از یکدیگر متمایز باشند .
اهمیت حوزه های LRR در مقاومت از اینجا نشات می گیرد که دیده می شود این حوزه ها در برخی از ژنهای R ، حفاظت شده می باشند و بعنوان مثال آللهای موتانت RPS2 و RPM1 فقط به علت تغییر در یک اسید آمینه در ناحیه LRR غیر فعال می گردند .
مکانهای اتصال نوکلئوتیدها
توالی های اسید آمینه ای رمز شده توسط بسیاری از ژنهای LRR ، با مکانهای اتصال نوکلئوتیدها (NBS) نیز شباهت نشان می دهند ( NBS ها به نام حلقه های P34 نیز نامیده می شوند ) . حوزه های NBS در بسیاری از پروتئین ها با قابلیت اتصال به ATP و GTP مانند زیر واحدهای β مربوطه به ATP Synthase ، پروتئین های ras ، عوامل بسط ریبوزومی35 و کینازهای adenylate دیده می شوند . ساختمان و عمل حوزه های NBS در سایر پروتئین حتی بیش از LRR ها مورد مطالعه قرار گرفته است . این مطالعات شامل تعیین ساختمان کریستالی ، تعیین خصوصیات فیزیکی و شیمیایی ، کنش پروتئین – لیگاند و تجزیه کینتیکی36 پروتئین هایی که در یک اسید آمینه از حوزه NBS آنها جایگزینی رخ داده است ، می باشد . NBS مورد توافق ( مشترک ) 37 برخی از پروتئین ها بقدری جامع است که نه تنها حلقه P را در بر می گیرد ( توالی مورد توافق [T/S]GXXXXGK ) بلکه حوزه های کیناز 2 و کیناز 3 که دورتر واقع هستند را نیز در بر می گیرد .
وجود حوزه های بسیار حفاظت شده NBS در فرآورده برخی از ژنهای R نشان می دهد که اتصال نوکلئوتید تری فسفات برای عمل این پروتئین ها الزامی است . مشخص شده است که جهش های اختصاصی38 که واحدهای کلیدی در NBS را تغییر می دهند ، سبب عدم رویداد واکنش HR توسط ژن RPS2 در آرابیدوپسیس می شوند .
اما نقش حوزه های NBS در فعال سازی مکانیسم دفاع گیاهی هنوز نامشخص است . بنابراین چالش اصلی در آینده عبارتست از مستند ساختن فرآیند اتصال نوکلئوتید تری فسفات و هیدرولیز احتمالی و مشخص نمودن نقش این فرآیندها در فعالیت فرآورده های ژنهای R . به عنوان مثال اتصال نوکلئوتید تری فسفات ممکن است باعث تغییر در بر هم کنش بین فرآورده ژن R و سایر اعضای دخیل در آبشار انتقال پیام دفاعی 39 شود . با توجه به انبوه اطلاعات موجود پیرامون حوزه های NBS در سایر پروتئین ها می توان پیشرفت قابل ملاحظه ای را در این زمینه انتظار داشت .
لوسین زیپرها40
در درون گروه LRR از ژنهای R گروه فرعی دیگری قرار داد که لوسین زیپر (LZ) نامیده می شوند . سه ژن RPS2 ، RPM1 ، prf که مسئول مقاومت در برابر P.syringae می باشند همگی توالی هایی را رمز می کنند که دارای ناحیه لوسین زیپرها دارای توالی های تکراری 7 واحدی ( با توالی مورد توافق XXXYXXL ، که Y نشان دهنده واحدهای آب گریز ) می باشند . این توالی ها در سایر پروتئین ها ساختمان چنبره ای41 تشکیل می دهند و بر هم کنش پروتئین – پروتئین را میسر می سازند . LZ ها بنا به نقشی که در همو – و هترودایمریزاسیون42 عوامل رونویسی در یوکاریوتها دارند ، مشهور می باشند مه از آن جمله می توان میوزین ها43 و زیر واحدهای β و γ از پروتئین G را نام برد . در مورد این گروه نیز مطالعات زیادی روی سایر پروتئین ها به منظور تعیین خصوصیات ساختمانی و عملکردی از قبیل تعیین ساختمان کریستالی صورت گرفته است ، با این حال ، در اینجا نیز اطلاعات ما پیرامون نقش این نواحی در عمل ژنهای R محدود است . تحقیقات در حال انجام است تا معلوم شود که آیا فرآورده های ژنهای R قابل دایمریزاسیون هستند و یا خیر تا پس از آن سایر پروتئین هایی که ممکن است با فرآورده های ژنهای R از طریق نواحی LZ کنش نشان دهند ، ردیابی شوند .
جدول 1 – ژنهای همسانه شده مقاومت به بیماری در گیاهان
گروه
ژن R
گیاه
عامل بیماری
ژن aver
تیپ آلودگی اندام مورد تهاجم
ویژگی پیش بینی شده برای پروتئین مقاومت
1
Hm 1
ذرت
Helminothospprium maydis
–
نکروتروف قارچی/ برگ
آنزیم سم زدا (HC-toxin reductase)
2
Pto
گوجه فرنگی
Pseudomonas syringae pv tomato
Av Pro
باکتری خارج سلولی / برگ
پروتئین کینازی سرین – ترئونین داخل سلولی
a3
PRS2
آرابیدوپسین
Psedomonas syringae pv tomato
avrRpt2
باکتری خارج سلولی / برگ
LZNBS/LRR
PRM1
آرابیدوپسین
Psedomonas syringae pv maculicola
avrRpml , avrB
باکتری خارج سلولی / برگ
LZNBS/LRR
L2
گوجه فرنگی
Fuzarium oxysporium f.sp. lycopersicon
___
قارچ نکروتروف/ ریشه و بافت آوندی
LZNBS/LRR
3b
N
توتون
ویروس موزائیک توتون
–
برگ و آوند آبکش
Toll/NBS/LPR
L6
کتان
Melampsora lini
AL6
قارج بیوتروف زنگ با هیف/ برگ قارچ زنگ
Toll/NBS/LPR
M
کتان
Melampsora lini
AM
بیوتروف با هیف/ برگ
Toll/NBS/LPR
PRP5
آرابیدوپسین
Peronospora parasitica
–
قارچ بیوتروف سفیدک دروغی با هیف/برگ
Toll/NBS/LPR
4
Cf-9
گوجه فرنگی
Cladosprorium fulvum
Ovr9
قارچ بیوتروف خارج سلولی بدون هیف/ برگ
LRR
Cf-2
گوجه فرنگی
Cladosprorium fulvum
Ovr2
قارچ بیوتروف خارج سلولی بدون هیف/ برگ
LRR
Cf-4
گوجه فرنگی
Cladosprorium fulvum
Ovr4
قارچ بیوتروف خارج سلولی بدون هیف/ برگ
LRR
Cf-5
گوجه فرنگی
Cladosprorium fulvum
Ovr5
قارچ بیوتروف خارج سلولی بدون هیف/ برگ
LRR
5
Xo2 l
برنج
Xanthomonas compestris pv oryzae
–
باکتری خارج سلولی/ برگ
LRR/ پروتئین کینازی
شکل 1- حوزه های ساختمانی پروتئین های رمز شده توسط ژنهای مقاومت به بیماریها در گیاهان و پیش بینی محل استقرار آنها
ه) حوزه مشابه گیرنده های Toll/Interleukin-l
گروه فرعی دیگری در درون گروه NBS-LRR از ژنهای R قرار دارد و ژنهای این گروه حوزه بزرگی را در انتهای N رمز می کنند که شبیه حوزه پیام رسانی سیتوپلاسمی پروتئین Toll در مگس سرکه و گیرنده های Interleukin-l در پستانداران می باشد . ژنهای N ، L6 و RPP5 در این زیر گروه قرار می گیرند . علاوه بر شباهت بین توالی های N ، L6 ، Toll و IL ، مسیرهای بیو شیمیایی که توسط آنها کنترل می شود ، نیز مشابه می باشند . به عنوان مثال lR – IL نسبت به سیتوکین IL-l واکنش نشان می دهد و باعث می شود که عامل رونویسی خانواده Rel به نام NF-kB فعال شود و NF-kB نیز به نوبه خود در تولید گونه های اکسیژن واکنشی نقش دارد . در پاسخ دفاعی ژن در برابر ژن نیز انفجار اکسیداتیو44 بطور وسیعی مشاهده می شود . بعلاوه فعالیت NF-kb تحت تاثیر ترکیبات اسید سالیسیلیک مانند آسپرین45 می باشد و اسید سالیسیلیک مولکول پیام رسانی پائین دست46 مهمی در پاسخ دفاعی گیاه می باشد . Dif ( یکی دیگر از عوامل رونویسی مربوط به Rel ) و NF-kB هر دو در پاسخ ضد میکروبی47 میزبان نقش دارند . و در پایان اینکه قابلیت Toll در آزادسازی عامل رونویسی Dorsal وابسته به پروتئین Pelle است و Pelle یک پروتئین کینازی مشابه فرآورده ژنی Pto در گوجه فرنگی می باشد .
و) پروتئین های LRR خارج سلولی و غیر NBS
ژنهای Cf-9 و Cf-2 گوجه فرنگی فاقد حوزه NBS می باشند و گروه سومی را درون گروه LRR از ژنهای R تشکیل می دهند ( جدول 1 ) . ژن Cf-9 ، 28 نوع LRR را رمز می کند . پیش بینی می شود این LRR ها از نوع خارج سلولی باشند . ( شکل 1 ) . توالی انتهای N پروتئین Cf-9 در انتقال پیام در عرض غشاء سلولی نقش دارد . بعلاوه این پروتئین در انتهای C دارای حوزه ای در عرض غشاء و یک دنباله کوتاه متشکل از 28 اسید آمینه در سیتوپلاسم می باشد . LRR هایی که توسط Cf-9 ( و همچنین Cf-2 ) رمز می شوند ، بیش از آنکه با گروه NBS-LRR از ژنهای R شباهت داشته باشند ، با توالی مورد توافق LRR تطابق دارند و یک واحد حفاظت شده گلیسین48 نیز در این LRR ها موجود است. این واحد گلیسین همچنین در سایر پروتئین هایی که دارای حوزه LRR خارج سلولی می باشند ، یافت می شود . فرآورده ژن Cf-2 بسیار شبیه Cf-9 است که بدیهی به نظر می رسد چراکه هر دو ژن مذکور سبب مقاومت اختصاصی در برابر Cladisporium fulvum می شوند . 9 نوع از LRR هایی که توسط CF-2 رمز می شوند بسیار شبیه LRR های Cf-9 هستند که نشاندهنده ارتباط49 نزدیک دو ژن مذکور است . جالب توجه اینکه معلوم شده است که Cf-2 شامل دو ژن متمایز می باشد که فرآورده های آنها فقط در 3 واحد اسید آمینه با هم متفاوت می باشند .
ز) گیرنده های کینازی در عرض غشاء50
آخرین گروه از ژنهای R که در اینجا مد نظر قرار می گیرد در حکم پل رابط گروه ژنهای R که پروتئین های LRR را رمز می کنند و آنهایی که پروتئین رمز می کنند و آنهایی که پروتئین های کینازی را رمز می کنند می باشد ، چراکه در این گروه هر دو حوزه مذکور در یک پروتئین رمز می شوند . تنها عضو موجود در این گروه ، Xa21 است . Xa21 تنها ژن شناخته شده گیاهان تک لپه ای است که توالی آن گزارش شده است . Xa21 یک گیرنده کینازی را رمز می کند که ناحیه LRR آن در انتهای N ( با توجه به شباهت آن با پروتئین های شناخته شده ) احتمالاً در خارج سلول قرار می گیرد . به نظر می رسد که حوزه LRR خارجی از طریق ناحیه ای که در عرض غشاء قرار می گیرد به حوزه کینازی که در داخل سیتوپلاسم قرار دارد متصل می شود . مقایسه پروتئین رمز شده توسط Xa21 و پروتئین رمز شده توسط Pto و orf در گوجه فرنگی جالب است ( جدول 1 ) . Pto ( که یک کیناز را رمز می کند ) و prf ( که یک پروتئین NBS-LRR را رمز می کند ) ، هر دو برای مقاومت در برابر عامل بیماریزای P.s.tomato که ژن avrPto را بیان می کند ، لازم می باشند . شباهت بین این دو پروتئین و Xa21 نشان می دهد که پروتئین های Pto و Prf در دریافت و انتقال پیام عامل بیماری بصورت تنگاتنگی با یکدیگر کنش نشان می دهند . این روند در قالب یک مدل فرضی ارائه شده است (شکل 2) . نمونه های Pto وPrf و Xa21 نشان می دهند که برای فرآورده های ژنی RPS2 ، Cf-9 و سایر ژنهای R واجد ناحیه LRR ، احتمالاً پروتئین های کینازی متناظر که از لحاظ عمل نیز با اهمیت باشند ، وجود دارد .
شباهت بین فرآورده ژنهای R با سایر پروتئین های گیاهی
شباهت بین فرآورده ژنهای R و سایر پروتئین های گیاهی می تواند به عنوان سرنخی برای پی بردن به نقش این پروتئین ها در انتقال پیام دفاعی باشد . برای مثال ، حوزه کینازی در Pto و Xa21 بسیار شبیه گیرنده کینازی S در جنس Brassica می باشند . پروتئین SRK در خودناسازگازی کرده – کلاله نقش دارد که سیستمی کاملاً شبیه فرآیند شناسایی – پاسخ توسط فرآورده ژنهای R است. حوزه خارج سلولی پروتئین SRK به نوبه خود بسیار شبیه گلیکوپروتئین متصل به S51 (SLG) است و بنابراین به نظر می رسد که این دو پروتئین بطور فیزیکی با یکدیگر و با پیام مختص گرده کنش نشان می دهند . Cf-9 و Cf-2 از این لحاظ که فاقد حوزه پیام رسانی هستند بسیار شبیه SLG می باشند و پیشنهاد شده است که Cf-9 و Cf-2 به منظور ایجاد پاسخ دفاعی احتمالاً با یک گیرنده کینازی LRR یا سایر پروتئین ها بر هم کنش نشان می دهند . این پروتئین ها در آینده شناسایی خواهند شد زیرا ژنهای اضافی که برای عمل Cf-9 در گوجه فرنگی ضروری می باشند از طریق تجزیه جهش52 مشخص شده اند .
شباهت جالبی نیز بین فرآورده های ژنهای R و سایر پروتئین هایی که با مولکولهای حاصل از عامل بیماری53 بر هم کنش نشان می دهند ، وجود دارد . ژن PR5K در آرابیدوپسیس یک پروتئین کینازی را کد می کند که در عرض غشاء قرار می گیرد و حوزه کینازی در آن مشابه Pto ، Xa21 و حوزه خارج سلولی آن مشابه یک پروتئین ضد قارچی با بیماریزایی54 (پروتئین PR ) به نام PR5 می باشد . PR5 و PR5K نیز مانند SLG و SRK احتمالاً با پروتئین های هدف مشترک و یا مربوط به هم بر هم کنش نشان می دهند . سیستم مشابه دیگر ، شباهت زیاد بین LRR های Cf-9 و Cf-2 و پروتئین های مهار کننده پلی گالاکتوروناز55 (PGIPs) است . پلی گالاکنورونازهای قارچی عوامل بیماریزایی هستند که هموگلاکتورونان ها56 را در دیواره سلول گیاهی هیدرولیزه می کنند . به همین ترتیب در گیاهان نیز پروتئین هایی وجود دارند که عمل پلی گالاکتورونازها را متوقف می کنند که به آنها PGIP گویند . در حقیقت PGIP ها گیرنده های با میل ترکیبی بالا57 هستند که پلی گالاکتورونازهای قارچی را مهار می کنند . پیشنهاد شده است که PGIP ها در پیام دفاعی نقش دارند . زیرا فرآورده های خرد شده حدواسط الیگو گالاکتورناید58 ( با زنجیره ای به طول 10 تا 14 واحد ) که در نتیجه مهار ناقص پلی گالاکتوروناز قارچی تجمع می یابند می تواند به عنوان ترکیبات القاء کننده دفاع عمل نمایند .
شباهت بین بسیاری از فرآورده های ژنهای R و پروتئینهایی با عمل ناشناخته از قبیل شباهت بین گیرنده کینازی LRR یا TMKl و RLK5 نیز می تواند به عنوان راهنمایی ما را در جهت درک بهتر عمل ژنهای R رهنمون سازد . به عنوان مثال کشف بر هم کنش بین RLK5 و پروتئین فسفاتازی به نام KAPP می تواند نشانه ای از این باشد که پروتئین فسفاتازها هم در انتقال پیام دفاعی نقش دارند .
شکل 2 – مدل فرضی انتقال پیام توسط ژنهای مقاومت در این مدل فرآورده ژنهای Pto و Prf در سمت داخلی غشاء پلاسمایی به یکدیگر متصل می شوند . Pto پس از اتصال الیسیتور avrPto فسفریله می شود و سپس دومین کیناز در آبشار کینازی ، به نام Ptil ، را فسفریله می کند و سپس بطور مستقیم یا غیر مستقیم اجزاء حدواسط مسیر انتقال پیام ، مانند کمپلکس آنزیمی NADPH – اکسیداز ( ایجاد کننده انفجار اکسیداتیو ) و رها سازی اسید سالیسیلیک را فعال می نماید . این عوامل واکنش های دفاعی از قبیل اتصال دیواره سلولی و بیان ژنهای دفاعی مانند بتا – 3،1- گلوکاناز و فنیل آلانین آمونیا – لیاز را القاء می کنند . واکنش های دیگر عبارتند از فعال شدن کانالهای یونی و رویداد مرگ برنامه ریزی شده سلولی (HR) مسیر انتقال پیام دیگر مستقیماً از Pto به شروع شده و به سمت فعال سازی عامل رونویسی Pti5 و در نتیجه بیان ژنهای دفاعی منتهی می شود . Fen به عنوان همولوگPto در دریافت لیگاند متفاوتی ( حشره کش فنتیون ) نقش دارد و آبشار انتقال پیام متفاوتی ( اما در عین حال دارای برخی موارد مشترک ) را فعال می نماید . این مدل یکی از بسیار مدل مفروض پیشنهاد شده می باشد و مدلهای دیگری که برای فعالیت سایر فرآورده های ژنهای R پیشنهاد شده اند از بسیاری لحاظ متفاوت می باشند .
ژنهای مقاومت و انتقال پیام دفاعی
بر هم کنش P.syringae و گوجه فرنگی از طریق avrPto با Pto و Prf نمونه ای از بر هم کنش ژن در برابر ژن است که بهتر از سایر موارد بررسی شده است و می تواند سرنخهایی از طبیعت انتقال پیام دفاع گیاهی را در اختیار ما قرار دهد . یکی از این سر نخها ، شناسایی ژن Fen است که شبیه ژن Pto بوده و باعث حساسیت به حشره کشی به نام فنتیون59 می شود . وقتی ژن Pto گوجه فرنگی برای اولین بار از خویشاوند وحشی گوجه فرنگی ، Lycopersicon pimpinellifolium ، به ارقام زراعی انتقال یافت ، صفت ثانوی حساسیت به حشره کش فنتیون نیز به درون ارقام مذکور منتقل شد . این صفت با ژن مذکور پیوستگی کامل نشان می داد ، اما با مطالعاتی که از طریق جهش انجام شد معلوم گردید که عمل ژن Pto ( یعنی مقاومت اختصاصی نسبت به avrPto ) متامایز از حساسیت به فنتیون است . پس از همسانه سازی ژن Pto مشخص گردید که این ژن عضوی از یک خانواده چند ژنی می باشد و اعضای این خانواده بسیار به هم نزدیک می باشند . توالی اسید آمینه ای Fen دارای 87% شباهت با Pto می باشد و شناسایی Fen به عنوان یک همولوگ برای Pto این سوال را بوجود می آورد که نقش سایر همولوگ های Pto در این خانواده ژنی چیست ؟
اهمیت این مطالعه هنگامی آشکار شد که یک ژن از نوع LZ-NBS-LRR به نام Prf شناسایی گردید . نکته مهم این بود که حضور Prf به همراه Pto کینازی برای مقاومت به P.syringae بیان کننده avrPto الزامی می باشد ( جدول 1 ) . در حقیقت معلوم شد که Prf هم برای مقاومت اختصاصی به avrPto و هم برای حساسیت به فنتیون ضروری است . می توان یک مدل خطی برای انتقال پیام دفاعی در نظر گرفت که در آن یک پروتئین LRR ( به عنوان گیرنده پیام غیر بیماریزایی ) در بالادست مسیر تولید پیام کینازی قرار دارد . اما عمل اختصاصی Prf ، Pto و Fen ( در این حالت ، تمایز بین پیام avrPto و فنتیون ) توسط پروتئینهای کینازی متمایزی انجام می شود و نه توسط پروتئین LRR یک مدل متحمل تر برای این سیستم این است که فرض شود Prf و Fen بطور فیزیکی بر هم کنش نشان داده و کمپلکس های گیرنده ای با لیگاند اختصاصی متفاوت تشکیل می دهد . این مدل در شکل 2 ارائه شده است.
علاوه بر ژن Pto یک پروتئین کینازی ثانوی از نوع سرین – ترئونین به نام Ptil در پاسخ دفاعی در برابر avrPto شرکت دارد . طبق مطالعات انجام شده Pti به عنوان سوبسترایی برای اتوفسفوریلاسیون و فسفوریلاسیون توسط Pto عمل می نماید ، اما Pto سوسبسترای فسفوریلاسیون توسط Ptil نمی باشد بنابراین Ptil در آبشار پروتئین کینازی ، در پایین دست قرار دارد ( شکل 2 ) . بین Ptil و Fen هیگونه فسفوریلاسیونی مشاهده نمی شود که نشان دهنده این است که Ptil بخشی از آبشار کینازی بوده و به انتقال پیام Pto – avrPto اختصاص دارد . مشاهده شد که بیان Ptil در دفاع متحمل به نظر می رسد . این یافته نه تنها شاهدی مستدل از انتقال پیام توسط آبشار کینازی در پاسخهای دفاعی مربوطه است . بلکه بیانگر این است که آبشار کینازی ممکن است در سایر سیستم های ژن در برابر ژن نیز عمل نماید .
تعدادی از آلل های موتانت Pto جداسازی شده است . سطح مقاومتی که این آلل ها به گیاه اعطا می کنند حدواسط آن چه که در گیاهان Pto/Pto و گیاهانی که کاملاً فاقد ژن Pto هستند ، می باشد . این نتایج نشان دهنده طبیعت کمی پاسخ دفاعی ایجاد شده توسط بسیاری از سیستم های ژن در برابر ژن است . سایر سیستم های بیولوژیکی که از آبشار پروتئین های کینازی استفاده می نمایند نیز قابلیت مشابهی را در تغییر شدت پیام انتقالی نشان می دهند . شدت پاسخ دفاعی توسط بسیاری از اجزاء دخیل در یک سیستم دفاعی منفرد ژن در برابر ژن قابل تغییر است و تعیین خصوصیات اینگونه ژنها که تغییر دهنده شدت مقاومت هستند ، حوزه مهمی در تحقیقات آینده خواهد بود .
با مطالعه سیستم avrPto – Pto مشخص شده است که پروتئینهایی که با Pto بر هم کنش نشان می دهند به عنوان رونویسی شباهت دارند و از این طریق اطلاعات بیشتری پیرامون فرآیند انتقال پیام دفاعی به دست آمده است . پروتئین های Pti4 ، Pti5 ، Pti6 که با Pto بر هم کنش نشان می دهند به عنوان عوامل رونویسی در توتون به جعبه PR60 در توالی DNA متصل می شوند که ناحیه ای حفاظت شده در پروموتر بسیاری از ژنهای مربوط به پروتئینهای PR است . بیان پروتئینهای PR یک پاسخ معمول در کنش گیاهان با دامنه وسیع از میکروبها می باشد که بر هم کنش بین avrPto و Pto را نیز در بر می گیرد . اتصال به توالی در مورد Pti5 و Pti6 تایید گردیده است . شناسایی این عوامل رونویسی مفروض در وهله اول نشان دهنده وجود ارتباط مستقیم بین درک ( دریافت ) غیر بیماریزا و بیان جزئی از پاسخ دفاعی گیاه می باشد ( شکل 2 ) .
ژنهای غیر بیماریزا و تولید لیگاند
اکنون این سوال مطرح می شوند که لیگاندهایی که سبب ایجاد واکنش HR می شوند چه هستند ؟ اولین ژن Avr بیش از دو دهه پیش همسانه گردید و از آن موقع تا کنون تعداد زیادی از ژنهای Avr همسانه گردیده است . در اکثر موارد اطلاعات چندانی پیرامون نقش بیوشیمیایی این ژنها با استفاده از توالی نوکلئوتیدی و توالی اسید آمینه ای رمز شده توسط آنها به دست نیامده است ، اما مطالعه دقیق تعداد محدودی از فرآورده های ژنهای R اطلاعات جالبی را درباره زیست شناسی عامل بیماری و اساس مولکولی بیماریزایی حاصل نموده است . یکی از اصول مورد تایید در این زمینه این است که پروتئین رمز شده توسط ژنهای Avr به عنوان لیگاندی برای القاء پاسخ دفاعی عمل می نمایند ، بویژه دو گروه از پروتئین های غیر بیماریزا در این رابطه بطور گسترده ای مورد مطالعه قرار گرفته اند از جمله ، پروتئین پوششی ویروس موزائیک توتون ، TMV ، ( که باعث القاء مقاومت در توتونهایی که ژن N را بیان می کنند ، می شود Avr9 و پپتیدهای مشابه در C.fluvum ( که از طریق بیان Cf-9 و ژنهای R مشابه در گوجه فرنگی قابل شناسایی می باشند ) . در مورد ساختمان و عمل پروتئینهای پوششی TMV اطلاعات جالب توجهی بدست آمده است ، اما گیرنده مناظر آنها که در گیاه هنوز شناسایی نشده است . Avr9 از این جهت مورد توجه است که الیسیتور آن جداسازی شده و ژن R مربوطه نیز همسانه گردیده است. الیسیتور Avr9 یک پپتید 28 اسید آمینه ای است که از طریق تسهیم61 فرآورده بزرگ Avr9 حاصل می شود . هم لاین های مقاوم گوجه فرنگی و هم لاین های فاقد Cf-9 هر دو ، مکانهایی با میل ترکیبی بالا را برای اتصال الیسیتور Avr9 بیان می نمایند .
ژنهای Avr بطور غیر مستقیم نیز در تولید الیسیتورهای اختصاصی ژنهای R نقش دارند . به عنوان مثال ، نژادهایی از که P.s.tomato که ژن avrD را بیان می کنند ، خانواده ای از الیسیتورها را تولید می کنند که از لحاظ شیمیایی مشابه بوده و ترکیباتی آلی با وزن مولکولی پائین می باشند که به نام سرینگولید62 نامیده می شوند . ژن avrD یک الیسیتور پروتئینی را رمز نمی نماید ، اما در عوض آنزیمی را رمز می کند که در سنتز سرینگولید نقش دارد . یکی از اهداف تحقیقاتی آینده در سیستم avrD و سایر سیستم های ژن در برابر ژن مورد مطالعه ، عبارتست از بررسی بر هم کنش فیزیکی بین الیسیتورهای نژاد – اختصاصی و گیرنده های متناظر آنها .
اصطلاح ژن در برابر ژن ، بر جور شدن اختصاصی ژنهای Avr وR دلالت دارد ، اما بدین معنی نیست که برای هر ژن avr الزاماً یک ژن R وجود دارد . بطور مثال فرآورده ژنهای Pto و Prf که از لحاظ بیوشیمیایی کاملاً متمایز از یکدیگر هستند ( ولی در مسیر مشابهی سنتز می شوند ) ، تنها نونه ای از موارد متعددی است که چندین ژن R در شناسایی یک ژنوتیپ Avr نقش دارند . یک مثال دیگر در این رابطه مکان ژنی Cf-2 می باشد . در این حالت دو ژن متمایز R نقش مشابهی را ایفاء می کنند . مورد دیگر حالتی است که یک ژن R سبب مقاومت اختصاصی گندم به دو لیگاند متفاوت می شود . ژن PRMl در آربیدوپسیس سبب مقاومت به P.syringae با ژن avrB یا avrRpml می شود . مشخص شده است که خصوصیات این دو ژن Avr کاملاً متفاوت از یکدیگر می باشد . هرچند که ساختمان مولکولی دو ژن Avr مذکور هنوز تعیین نگردیده است ، اما معلوم شده که ژن avrB الیسیتورهایی را رمز می کند که متمایز از الیسیتورهای رمز شده توسط avrRpml می باشد ؛ در سویا گیاهانی شناسایی شده اند که به عوامل بیماری بیان کننده avrB مقاوم ، ولی در برابر عوامل بیماری بیان کننده avrRpml حساس می باشند و بالعکس . همانطور که در بالا نیز اشاره شده ، وجود اختصاصیت در برابر چندین لیگاند برای ژن Prf نیز گزارش شده است .
در رابطه با گیرنده های بالقوه برای الیسیتورهای حاصل از ژنهای Avr ، محل استقرار الیسیتور و مکان فرآورده ژن R رانیز باید مد نظر قرار داد . به عنوان مثال C.fluvum در خارج از سلول رشد می کند در صورتیکه TMV در درون سیتوپلاسم سلول گیاهی تکثیر می شود . بنابراین استقرار پروتئین Cf-9 در خارج از سلول و قرار گرفتن فرآورده ژن N در داخل سلول منطقی به نظر می رسد . اما P.syringae pv tomato و P.syringae pv maculicola عوامل بیماری باکتریایی خارج سلولی هستند ، با این وجود توالی ژنهای Pto ، Prf ، PRS2 و PRMl نشان می دهد که فرآورده های آنها از نوع سیتوپلاسمی می باشند . برای توجیه این تناقص می توان فرض کرد فرآورده ژن Avr در این حالت به داخل سلول گیاهی ترشح می شود . ژن xa21 در برنج یک گیرنده کینازی را کد می کند که در عرض غشاء قرار می گیرد ( جدول 1 ) و بنابراین جالب است که مشخص شود آیا پیام غیر بیماریزایی حاصل از X.campestris pv oryzae از طریق سیستم ترشح نوع سوم63 که مورد استفاده عوامل بیماری باکتریایی مربوطه می باشد ، به درون سلول گیاهی انتقال می یابد و یا خیر .
اگر فقدان ژن Avr با کاهش شایستگی در عامل بیماری همراه باشد ، در اینصورت ژن مذکور همواره مورد هدف مقاومت گیاه به بیماری خواهد بود ( همانطور که در بالا اشاره شد ) ، برخی از ژنهای Avr ممکن است حذف شوند بدون اینکه اثر سوئی برای عامل بیماری مترتب بر فقدان آنها باشد ، اما در مقابل برخی دیگر از ژنهای Avr نیز در ایجاد بیماری توسط عامل بیماری در گیاهی که فاقد مقاومت است نقش دارند . عدم تولید الیسیتور توسط عامل بیماری بر وضعیت کشاورزی تاثیر گذار است : با تغییر ساختار جمعیت عامل بیماری به نفع افرادی که دارای قابلیت ایجاد بیماری می باشند ، اثر ژنهای مقاومت (R) در جلوگیری از بیماری خنثی می شود ، به عبارت دیگر عامل بیماری به منظور بی تاثیر نمودن نقش ژنهای مقاومت در پی ایجاد بیماریزایی بر می آید . یکی از مکانیسم ها به منظور حذف ویژگی عدم بیماریزایی ( و ایجاد بیماریزایی ) ، تغییر در ساختمان الیسیتور است به نحوی که گیرنده گیاهی نتواند با آن پیوند برقرار نماید . پروتئین پوششی TMV نمونه ای از ژنهای Avr است که وجود آن برای بیماریزایی الزامی است . اشکال متفاوتی از این پروتئین مشاهده شده است که با تغییر در یک اسید آمینه ، خاصیت عدم بیماریزایی از بین رفته و پروتئین های مذکور قابلیت پیدا کرده اند . پدیده از بین رفتن خاصیت عدم بیماریزایی و ایجاد قابلیت بیماریزایی در پپتید مربوط به C.fluvum نیز مشاهده شده است . در مورد سایر ژنهای Avr باکتریایی و قارچی ، از بین رفتن کامل خاصیت عدم بیماریزایی از طریق نوترتیبی ژنی64 ، جایگزینی ترانسپوزون های مخفی65 ، حذف کروموزومی و یا حذف پلاسمیدهای خارج کروموزومی صورت می گیرد . یک مثال جالب در رابطه با تکامل ژنهای Avr ، خانواده avrBs3 از ژنهای Avr باکتریایی است . این ژنها ، تکرارهای 34 اسید آمینه ای بسیار مشابهی با تعداد تکرار متفاوت رمز می نمایند . تعداد تکرارها و یا توالی هر یک از تکرارها به تنهایی شبب از بین رفتن خاصیت عدم بیماریزایی نمی شود ، ولی آللهای Avr جدیدی را ایجاد می کند که قبلاً در مقاومت اختصاصی گیاه ناشناخته بودند .
رویدادهای پائین دست در انتقال پیام دفاعی
اکنون این سوال مطرح است که پس از آنکه عامل بیماری پیام القاء کننده دفاع را تولید کرد و گیاه آن را دریافت نمود ، چه وقایعی رخ می دهد ؟ و به عبارت دیگر رویدادهای پائین دست پس از دریافت پیام چه هستند ؟ در حقیقت بر هم کنش ژن در برابر ژن باعث القاء یکسری از پاسخ ها ، از قبیل فعال شدن پروتئین های کینازی ، تحریک انفجار اکسیداتیو و القاء جریانهای یونی در غشاء سلول می گردد . این قبیل رویدادها و سایر وقایع به نوبه خود پاسخ های دفاعی همچون اتصال دیواره سلولی66 و بیان ژنهای مربوط به دفاع را موجب می شوند . در مورد ژنهای Xa21 و Prf-Pto به نظر می رسد که پروتئین های کینازی بلافاصله در پی شناسایی عامل بیماری فعال می شوند . اما پیامهایی که توسط سایر فرآورده های ژنهای R ایجاد می شود و اجزاء پائین دست که این پیام را دریافت می نمایند ، هنوز شناخته نشده اند .
روشهای گوناگون بیوشیمیایی ، ژنتیکی و زیست شناسی مولکولی در تشریح روند انتقال پیام دفاعی می توانند سودمند واقع گردند . اهمیت وقایع پائین دست از قبیل انفجار اکسیداتیو پژوهشگران را به تمرکز بر روی اجزاء سلولس که این وقایع را به انجام می رسانند رهنمون ساخته است . اما مشاهده این که یک محرک بیوشیمیایی می تواند باعث القاء پاسخ دفاعی شود ، الزام وجود آن محرک را برای فرآیند مربوطه اثبات نمی نماید . به عنوان مثال اتیلن سبب القاء بیان ژن PR می شود ، اما برای ظهور مقاومت موثر به بیماری از نوع ژن در برابر ژن ، داشتن قابلیت پاسخ به اتیلن الزامی نیست . روش همسانه سازی بر هم کنشی67 که در آن از یک پروتئین برای شناسایی پروتئین دیگری که با آن به طور فیزیکی بر هم کنش نشان می دهد و در نتیجه شناسایی ژن متناظر آن استفاده می شود ، مسیری نوید بخش برای پژوهش در این زمینه است زیرا از این طریق می توان نقش فیزیکی و مستقیم اجزاء سیستم ژن در برابر ژن را مشخص نمود . اما این امر نیز مهم است که نقش زیست شناختی اجزاء دخیل در انتقال پیام از قبیل pti نیز مشخص شود . این کار از طریق فرونشانی آنتی سنس68 یا فرابیانی تراریختی69 ژن مربوط به ترکیب مورد نظر قابل انجام است . تجزیه و تحلیل جهش روش بسیار قابل اطمینانی برای شناسایی ژنهایی است که احتمال می رود در کنترل وقایع پائین دست طی مسیر ژن در برابر ژن دخیل باشد . مطالعه مکانهای ژنی کمی که مقاومت ژن در برابر ژن را تحت تاثیر قرار می دهند نیز در پیشرفت این زمینه نقش دارند . یکی از اجزاء دخیل در انتقال پیام دفاعی که شایان توجه ویژه است ، اسید سالیسیلیک می باشد . اسید سالیسیلیک از واسطه های کلیدی در انتقال پیام است که سبب مقاومت اکتسابی سیتمیک70 می شود ؛ فرآیندی که طی آن آلودگی موضعی باعث تشدید مقاومت بصورت کمی چه در مکان آلودگی و چه در بافتهای دور از منطقه آلوده شده می گردد . اسید سالیسیلیک واسط مهمی در پاسخهای دفاعی است و در مقاومت ژن در برابر علیه بیماری نقش کلیدی دارد .
اکنون این سوال مطرح است که هنگام آلودگی گیاه توسط عوامل بیماری گوناگون با ژنهای Avr متفاوت ، آیا پاسخ های پائین دست یکسان هستند و یا متفاوت می باشند ؟ بررسی ظاهری بافتهای آلوده شده نشان می دهد که ارتباط ژن در برابر ژن در موارد مختلف ممکن است پاسخهای مقاومت متفاوتی را سبب شود . با مطالعه سطح بیان ژن القاء شده در گیاه آرابیدوپسیس و از طریق استفاده از سیستم ایزوژنیک که در آن گیاهان دارای RPMl و / یا RPS2 با P.stringae pv maculicola بیان کننده avrRpt1 و / یا avrRpt2 آلوده شدند ، این امر به اثبات رسید . هم در زمان ظهور واکنش HR و هم در RNA پیامبر PR های القاء شده تفاوتهایی مشاهده شد . نکته جالب این بود که مشاهده شد حضور یک عامل بیماری مانع پاسخ دفاعی گیاه ناشی از آلودگی توسط عامل بیماری دیگر می شود . این تداخل به در عامل بیماری بستگی داشت و با تغییر غلظت نسبی دز عامل بیماری از بین می رفت . به نظر نمی رسد که الیسیتورهای avrRpm1 و avrRpt2 با گیرنده یکسانی پیوند برقرار کنند ، زیرا این الیسیتورها در برابر ژنهای R متفاوتی اختصاصیت نشان می دهند و پاسخهای دفاعی متفاوتی را القاء می کنند . اما ممکن است این الیسیتورها برای اجزاء مشابهی از گیرنده های هتروژن که واحدهای فرعی چندگانه دارند71 و یا اجزای پائین دست مسیر بیوشیمیایی پیام به رقابت بپردازند . فرض دیگر این است که فرآورده های دو ژن Avr مذکور آنزیم هایی هستند که در تغییر ترکیبات الیسیتور نهایی به رقابت می پردازند .
علاوه بر مطالعه مکانیسم هایی که منجر به القاء پاسخ های دفاعی می شود ، درک اینکه گیاهان چگونه مانع گسترش بیش از حد پاسخهای مذکور می شوند نیز اهمیت دارد . یکی از راههای بررسی این موضوع عبارتست از مطالعه موتانت های دارای زخم های مشابه علائم بیماری72 . در این گیاهان موتانت ، بدون اینکه عامل بیماری حضور داشته باشد و یا در حضور ساپروفیت هایی که به طور طبیعی سبب بیماری نمی شوند زخمهایی شبیه اثر بیماری به وجود می آید . انواع زیادی از این گونه زخم های ژنتیکی وجود دارد که می تواند سبب بروز فنوتیپ هایی شبیه زخم های ناشی از بیماری شود . انتظار این بود که با مطالعه برخی از این موتانت ها ، ژنهای مهم در توسعه بیماری و مقاومت مشخص شوند، اما نتایجی که تاکنون از این طریق بدست آمده در بسیاری موارد با نتایج مطالعات مربوط به ژنهای R دخیل در دفاع همپوشانی داشته است . به عنوان مثال برای نشانمند کردن LlSl در ذرت ، ژنی که در ایجاد محدودیت برای مرگ برنامه ریزی سلول یا عدم رویداد آن نقش دارد ، از موتاژن ترانسپوزونی استفاده شده است . در گیاهانی که از لحاظ این ژن جهش یافته بودند ، بافتهای مرده ای بطور پراکنده ظاهر گردید که گسترش یافته و به تدریج تمام برگ را فرا می گرفت . انجام تجزیه و تحلیل پیرامون این قبیل ژنها بایستی به درک بهتر مکانیسم های هموستاتیک که شدت و گسترش پاسخهای دفاعی را محدود می کنند منجر گردد .
خانواده ژنهای مقاومت و ایجاد مقاومت های اختصاصی جدید
ژنهای R چگونه بوجود می آیند ؟ اکثر ژنهای R علیرغم شباهت زیاد در مواردی از قبیل نواحی کد کننده LRR در سطح DNA ، بسیار متفاوت از یکدیگر می باشند . با این حال برای ژنهای همسانه شده خانواده های ژنی شناسایی شده است که چندین ژن با توالی مشابه را در بر می گیرند . اعضای این خانواده ژنی در ژنوم یک لاین گیاهی ممکن است به شدت پیوسته ، کاملاً ناپیوسته یا به هر دو صورت پیوسته و نا پیوسته باشند . این موضوع چندان عجیب نیست چراکه در مطالعات ژنتیک کلاسیک موارد بسیاری مشاهده شده است که ژنهای R بصورت خوشه های ژنی اغلب سبب مقاومت به نژرادهای متفاوت از یک گونه بیماری می شوند .
متحمل ترین منبع ایجاد مقاومت های اختصاصی جدید ، چه در مورد ژنهای پیوسته و چه در مورد ژنهای ناپیوسته ولی مرتبط به یکدیگر ، پدیده های مضاعف شدن و در پی آن رویداد افتراق73 می باشد . و به عنوان مثال در مورد مکان ژنی Rpl در ذرت ، وقوع کراسینگ اوور نا مساوی در درون خوشه هایی از توالی های مشابه ، ظهور آللهای جدید ژن R را سرعت می بخشد . در خوشه M از ژنهای R در کتان نیز تبادلات نامساوی توالی های رمز کننده LRR در بین و درون ژنهای M مجاور مشاهده شده است . جالب توجه این که نوترکیبی و ایجاد مقاومت های اختصاصی جدید در گیاهان شبیه مکانیسم های ایجاد تنوع ایمونولوژیکی در پستانداران می باشد . شایان ذکر است که نوترکیبی همچنین ممکن است سبب ایجاد اختصاصیت های غیر بیماریزا74 در عامل بیماری شود ، چنانچه در مورد خانواده AvrBs3 از xantahamonas مشاهده شده است . یک مکانیسم دیگر که ممکن است در ایجاد تنوع در مقاومت نقش داشته باشد پردازش گوناگون75 نسخه های رونویسی شده76 از ژن R است .
طبق شواهد موجود در گونه های متفاوت نه فقط توالی DNA مربوط به ژنهای R بسیار مشابه و حفاظت شده هستند بلکه عمل مقاومت اختصاصی نسبت به ژن Avr مربوط نیز حفاظت شده می باشد . به عنوان مثال می توان به تحقیقات مربوط به عامل بیماری X.campestris بیان کننده AvrRxv اشاره نمود که برای اولین بار از عامل بیماری گوچه فرنگی X.c.resicatoria جداسازی شد مشاهده شد AvrRxv همسانه شده ، در سایر نژادهای X.campestris که ابتدائاً روی گیاهانی دیگر مانند کلم و ذرت بیماریزا بوده اند بین می شود که این نشان دهنده حضور مقاومت اختصاصی مربوطه در این گونه های گیاهی است . موارد زیادی از این گونه مقاومت اختصاصی در برابر ژن Avr یکسان ، از سوی گونه های گیاهی متفاوت مشاهده شده است که از آن جمله می توان به ژنهای AvrRpt2 ، AvrRpm1 و AvrPto ( ژنهای Avr که ژنهای R متناظر آنها همسانه شده است ) اشاره نمود . وجود مقاومت مشابه بین آرابیدوپسیس و گیاهان زراعی عمده مانند سویا نشان می دهد که آرابیدوپسیس می تواند به عنوان منبع ژنهای R برای گیاهان مذکور بکار رود اما این موضوع تا کنون بطور کامل مورد بهره برداری قرار نگرفته است . به نظر می رسد که اساس مولکولی شباهت بین انواع مقاومت از لحاظ نحوه عمل ، ریشه در شباهت ساختمانی ژنهای R مربوطه دارد هرچند که این موضوع نیز بطور تجربی و در عمل به اثبات نرسیده است .
پروتئین های مرتبط با بیماریزایی77
گیاهان عالی در جریان تکامل و سازگاری با فشار عوامل بیماری در محیط ، دیوار سلولی ضخیمی متشکل از سلولز78 ، پکتین79 ، لگنین80 و غیره توسعه داده اند که به عنوان مانع فیزیکی در برابر عوامل بیماری مهاجم عمل می نماید . دومین مکانیسم دفاعی در گیاهان عبارتست از تولید متابولیت های ثانویه ( مانند فنولیک ها81 ، آلکالوئیدها82 و ساپونین ها83 ) که بخشی از دفاع شیمیایی را تشکیل می دهند . اما واکنش دفاعی دیگری نیز وجود دارد مه بسیار پیچیده تر است و عبارتست از فعال شدن آبشاری از ژنهای دخیل در بر هم کنش گیاه – عامل بیماری می باشد . برخی از واکنشهای دفاعی القاء شونده عبارتند از گونه های اکسیژن واکنشی84 (ROS) فینوآلکسین ها85 ، اجزاء دیواره سلولی86 (کالوس87 و پروتئینهای غنی از هیدروکسیل پرولین88 ، و غیره ) و گروه دیگری از پروتئین ها که تحت عنوان پروتئینهای مرتبط با بیماریزایی (PR) نامیده می شوند . مطالعات گسترده ای که در زمینه واکنش فوق حساسیت گیاه توتون آلوده به ویروس موزائیک89 (TMV) انجام گرفت منجر به کشف پروتئین های PR گردید . این پروتئینها برای اولین بار به عنوان پروتئینهای القاء شونده از عصاره برگ گیاهانی که در برابر TMV واکنش فوق حساسیت نشان داده بودند استخراج گردید . سپس مشخص گردید که پروتئین های مذکور فقط به آلودگی ویروسی اختصاص ندارند ، بلکه در حضور بسیاری از عوامل بیماری قارچی و باکتریایی و خصوصاً در گیاهانی که واکنش فوق حساسیت نشان می دهند مشاهده می شوند . این پروتئینها اکثراً دارای وزن مولکولی پایینی بوده و ترجیحاً در PH پائین استخراج می شوند . پروتئین های مذکور در برابر پروتئولیز90 مقاوم بوده و اغلب در داخل سلولهای برگی حضور دارند . اصطلاح پروتئینهای مرتبط با بیماریزایی به صورت PR مخفف گردید و به مفهوم پروتئین هایی است که توسط گیاه میزبان رمز می شوند اما فقط در حضور عامل بیماری یا وضعیت های مربوط القاء می شوند . منظور از عامل بیماری یا وضعیت های مربوط تمام انواع عوامل بیماری و حتی تهاجم انگلی توسط حشرات ، نماتدها و سایر فرمهای عالی جانوران است . گزارشهای اخیر نشان می دهد که پروتئین های PR حتی در حضور قارچها و باکتری های غیر بیماریزا و سودمند نیز القاء می شوند . تنشها و اختلالات غیر زنده در چهارچوب این تعریف نمی گنجند هرچند که علائم غیر عفونی از قبیل کلروسیس91 و نکروسیس92 ناشی از سموم اغلب توسط پروتئینهای PR معینی القاء می شوند . پروتئین های PR همچنین تخت تنشهای محیطی توسط الیسیتورهای شیمیایی و در مراحل تکوینی متفاوت گیاه نیز القاء می شوند . معیار اصلی برای اینکه پروتئینی در زمره پروتئینهای PR قرار گیرد این است که آن پروتئین باید نوظهور93 بوده و در صورت آلودگی القاء گردد و مانع پیشرفت عامل بیماری ( اما نه الزاماً در تمام شرایط بیماریزایی ) شود . این حقیقت که پروتئینهای PR فقط در شرایط بیماری القاء می شوند نشان دهنده نقش آنها در دفاع گیاهی است (هر چند که آن را ثابت نمی کند ) .
آلودگی موضعی در گیاه یا واکنش فوق حساسیت در گیاه می تواند منجر به کسب مقاومت سیستمیک نسبت به آلودگی بعدی ناشی از عامل بیماری متفاوتی شود . این نوع مقاومت اکتسابی سیستمیک94 (SAR) به القاء پروتئینهای PR در بافتهای گیاهی نسبت داده می شود که دور از موضع آلودگی می باشند . شرایط دیگری که پروتئین های PR القاء می شوند عبارتست از به کار بردن مواد شیمیایی با تاثیری مشابه عامل بیماری ، و ایجاد زخم می باشد . مشاهده شده است که به کار بردن اسید سالیسیلیک ( که یک واسط ضروری در مسیرهای پیام رسانی است) منجر به تجمع پروتئین های PR در توتون می شود . ایجاد زخم بصورت مکانیکی یا در اثر تغذیه حشرات از بافت گیاه نیز منجر به تجمع پروتئین های PR می شود .
گروه بندی پروتئینهای PR
پروتئین های PR در مجموع به 17 گروه تقسیم می شوند . گروه بندی که در گذشته انجام گرفت مختص به توتون و گوجه فرنگی بود ، اما سیستم طبقه بندی فعلی پروتئین های PR سایر گونه های گیاهی را نیز در بر می گیرد . به خانواده های مختلف شماره های متفاوتی اختصاص داده می شود و اعضا درون یک خانواده با حروف از یکدیگر متمایز می گردند . برای تعیین این که یک پروتئین PR به کدام گروه تعلق دارد لازم است که هم در سطح اسید نوکلئیک و هم در سطح پروتئین اطلاعاتی کسب شود . همین مطلب در مورد پروتئین های مرتبط با تنش95 که در چهارچوب تعریف پروتئینهای PR قرار می گیرند نیز صادق است .
خانواده PR-1
خانواده PR-1 رایج ترین گروه پروتئینها بوده و در شرایط آلودگی به میزان زیادی القاء شده به طوری که مقدار آنها تا یک الی دو درصد پروتئین کل برگ می رسد . این پروتئین ها که از تمام گونه های گیاهی مورد مطالعه استخراج شده اند به طور معمول به اندازه 160 اسید آمینه طول دارند . خانواده PR-1 در توتون متشکل از 3 پلی پپتید اسیدی (PR-1a ، PR-1b و PR-1c ) است که توالی آنها بیش از 90 % به یکدیگر شباهت دارند می باشد . PR-1 شامل دو گروه اسیدی و بازی می باشند و شباهت بین توالی این دو گروه حدود 65% است . ژنهای PR-1 اسیدی فاقد اینتروم هستند و پروتئین های رمز شده توسط آنها در PH اسیدی ( PH=3 ) محلول می باشند . PR-1 های اسیدی اغلب در فضای خارج سلولی و عناصر آوند چوبی گیاهان آلوده شده با TMV یافت می شوند اما در واکوئل برخی از سلولهای برگی مشاهده نشده اند . پروتئین های PR-1 بازی هم در فضای خارج سلولی و هم در واکوئل گیاهان یافت می شوند .
بتا – 3،1- گلوکانازها96 ( خانواده PR-2 )
خانواده PR-2 شامل بتا – 3،1- گلوکانازها می شود که بطور گسترده ای در بین گونه های گیاهی توزیع شده اند . چندین پروتئین PR با فعالیت بتا – 3،1- گلوکاناز در توتون شناسایی شده ناد که بر اساس شباهت بین توالی هایشان به 4 گروه تقسیم می شوند . گروه I دارای چندین ایزوفرم97 بازی مربوط می باشند که اغلب در واکوئل ها تجمع می یابند . در مقابل گروه II (PR-2a ، PR-2b و PR-2c ) و گروه III ( PR-24 ) اسیدی بوده و به درون فضای خارج سلولی ترشح می شوند . در گروه چهارم نیز یک گلوکاناز مختص بساک98 قرار دارد .
کیتینازها99 ( خانواده های PR-3 ، PR-4 ، PR-8 و PR-11 )
خانواده های PR-3 ، PR-4 ، PR-8 و PR-11 عمدتاً متشکل از کیتینازهای و پروتئین های مختلف می باشد . کیتیناز ها لینکاژهای بتا – 4،1 بین باقی مانده های N-acetylglucosamine در کیتین100 را هیدرولیز می کنند . کیتین پلی ساکارید ساختمانی دیواره سلولی بسیاری از قارچها و همچنین کوتیکول حشرات و سلول تخم نماتدها می باشد . کیتیناز ها اولین پروتئین های القاء شونده توسط عامل بیماری بودند که شناسایی شدند و بیش از سایر گروه ها مورد مطالعه قرار گرفته اند . مشخص شده است که ترکیب کیتیناز و بتا – 3،1- گلوکاناز ( در مقایسه با هر یک از دو آنزیم به تنهایی ) علیه بسیاری از قارچها موثرتر است . اما برخی از کیتینازها ضد قارچی101 نیستند . به عنوان مثال گروه کیتانازهای IIa توتون ضد قارچی نمی باشند . اما اعضاء گروه I ضد قارچهای قدرتمندی هستند . مقاومت Lr35 در برابر زنگ برگ گندم به میزان بالای کیتیناز و فعالیت بتا – 1،3- گلوکاناز ناشی از دفاع فوق حساسیت نسبت داده می شود .
پروتئین های شبه تاماتین102 ( خانواده PR-5 )
توالی پروتئین های PR-5 یا شبه تاماتین (TLPs) دارای شباهت زیادی با یکدیگر بوده و با پروتئین شیرین مزه تاماتین در میوه درختچه های Thaumatococcus daniehhii غرب آفریقا ارتباط ایمونولوژیکی103 دارند . TLP ها اغلب در برگهای گیاهان جوان سالم یافت نمی شوند ، اما در پاسخ به تنشهای زنده و غیر زنده به سرعت تا مقادیر زیادی تجمع می یابند . این پروتئین ها معمولاً بسیار محلول بوده ، تا PH بسیار پایین پایدار باقی مانده و در برابر پروتئولیز مقاوم می باشند . TLP های خارج سلولی همیشه اسیدی هستند در صورتیکه TLP های واکوئلی ، بازی می باشند . مانند سایر پروتئین های PR دو گروه از TLP ها موجود است . گروه بزرگتر شامل پروتئین هایی با اندازه حدود KDa23 تا KDa26 می باشد و اعضای گروه کوچکتر دارای اندازه ای در حدود KDa 16 تا KDa17 می باشند . بطور مثال در برنج دو نوع TLP وجود دارد ؛ یکی TLP از نوع KDa16 است که توسط Pseudomonas syringae القاء می شود و دیگری TLP از نوع KDa24 و KDa25 است که یک یا دو روز پس از آلودگی توسط Rhizoctonia solani القاء می شود . گرچه بسیاری از TLP ها ضد قارچی هستند ، اما فعالیت ضد قارچی آنها بسته به جنس قارچ متغییر می باشد . TLP ها در غلظت بالا غشاء سلولی قارچ را تجزیه می کنند ولی در غلظت پایین بر نفوذ پذیری غشاء تاثیر می گذارند که منجر به تراوش اجزاء سلولی و یا جذب سایر ترکیبات ضد قارچی می شود . TLP ها در پاسخ به آلودگی های ویروسی ، قارچی و باکتریایی القاء می شوند . TLPها همچنین در شرایط تنش غیر بیماری مانند تنش اسمزی و توسط هورمانها و مولکولهای پیام مانند آبسیسک اسید104 (ABA) ، اتیلن105 ، سالیسیلیک اسید (SA) ، جاسمونیک اسید106 (JA) و همچنین با ایجاد زخم القاء می شوند .
مهار کننده های پروتئیناز107 (خانواده PR-6 )
مهار کننده پروتئیناز (PIs) پروتئین های دفاعی پایدارای هستند که در بذرهای تحت تنظیم تکوینی108 و همچنین در برگهای در پی تهاجم آفات یا عوامل بیماری یافت می شوند . گرچه بیش از 10 زیر گروه نامربوط مهار کننده پروتئیناز در گیاهان شناسایی شده اند ، اما فقط برخی از آنها نقش دفاعی در گیاهان بر عهده دارند . خانواده PR-6 متشکل از PI هایی است که دارای نقش دفاعی در گیاهان می باشند . عوامل بیماری و آفات مهاجم به بافت های گیاهان به یکسری از پروتئیناز ها به عنوان عوامل بیماریزایی109 متکی می باشند . این پروتئیناز ها به 4 گروه پروتئنازهای سرینی110 ، پروتئینازهای سیستئینی111 ، پروتئینازی های آسپاراتیک112 ، و پروتئینازی فلزی113 تقسیم می شوند . گیاهان بطور موازی ژن هایی را رمز می کنند که این پروتینازها را غیر فعال می سازد و از این رو باعث کاهش توانایی عامل بیماری یا آفت در هضم پروتئین های میزبان شده و آنها با کمبود منبع نیتروژن مواجه می سازند .
پروکسیدازها114 ( خانواده PR-9)
پراکسیدازها آنزیمهای کلیدی در فرآیند تشکیل دیواره سلولی می باشند . باور بر این است که پراکسیدازهای خارج سلولی با متصل به دیواره سلولی115 از طریق تشکیل موانع دیواره سلولی116 از نفوذ و گسترش عوامل بیماری جلوگیری می کنند . افزایش فعالیت پراکسیداز با مقاومت گیاهان به عوامل بیماری گوناگون همبستگی دارد . در مقابل ، فعالیت پراکسیداز در حالت حساسیت گیاه به تاخیر افتاده و یا اصلاً القاء نمی شود و در نتیجه عامل بیماری فرصت می یابد که در میزبان گسترش یابد . پراکسیدازها علاوه بر نقشی که در تقویت دیواره سلولی دارند ، در تشکیل گونه های اکسیژن واکنشی (ROS) نیز نقش دارند . گونه های اکسیژن واکنشی هم در حکم سم برای عامل بیماری می باشند و هم به عنوان پیغامبر117 عمل کرده و پاسخ دفاعی گیاه را فعال می سازند .
دفنسین ها118 ، نیوتین ها119 ، پروتئین های ناقل لیپید120 و اکسالات اکسیدازها121 ( خانواده های PR-12 ، PR-13 ، PR-14 ، PR-15 و PR-16 )
دفنسین ها (PR-12) ، تیونین ها (PR-13) ، پروتئین های ناقل لیپید (LTP،PR-14) و اکسالات اکسیدازها و پروتئین های مرتبط (PR-15 و PR-13) همگی پیتیدهایی هستند که فعالیت ضد میکروبی دارند . اکسالات اکسیدازهای (OxO) گندم و جو بطور گسترده ای مطالعه شده اند . این ژنهای برای اولین بار در دیواره سلولی بذرهای در حال جوانه زدن شناسایی شدند و سپس معلوم شد که در اثر تهاجم قارچی القاء می شوند . هر چند که مکانیسم دقیق فعالیت ضد میکروبی این آنزیم هنوز بخوبی درک نشده است ، اما به نظر می رسد که این آنزیمها در تولید گونه های اکسیژن واکنشی (ROS) نقش دارند .
تیوتین ها ، دفنسین ها و پروتئین های ناقل لیپید ، پپتیدهای ضد میکروبی غنی از سیستئین می باشند . نقش بیولوژیکی تیونین ها به عنوان ژنهای دفاعی بخوبی شناخته نشده است . مشاهده شده است که در گیاهان تراریخته با افزایش تیونین ها و ویسکوتوکسین ها122 ، مقاومت به عوامل بیماری افزایش یافته است . دفنسین ها از لحاظ ساختمانی متمایز از تیونین ها می باشند . برخی از دفنسین ها بر ریخت زدایی123 تاثیر می گذارند و سبب ایجاد انشعابات124 در هیف قارچ می شوند ، در صورتیکه برخی دیگر از رشد هیف جلوگیری می کنند . بنظر می رسد که دفنسین ها از طریق القاء جذب سریع Ca++ و دفع K+ در غشاء سلولی قارچ عمل می نمایند . پروتئین های ناقل لیپید ، پلی پپتیدهای طویلی هستند که به درون دیواره سلولی یا سایر سطوحی که در معرض عامل بیماری می باشند ترشح شده و در آنجا تجمع می یابند . علت نامگذاری این پروتئین ها به عنوان ناقل لیپید توانایی آنها در القاء انتقال دامنه وسیعی از لیپیدها در شرایط درون شیشه ای (in vitro ) است . نقش ضد میکروبی LTP ها در برابر T.viride و R.solani از طریق بیان این پروتئین ها در توتون و آرابیدوپسیس تراریخته به اثبات رسیده است .
مهندسی مقاومت به بیماری ها
به نژادگران سالهای زیادی از خویشاوندان وحشی گیاهان زراعی به عنوان منبع ژنهای جدید استفاده نموده و در اینکار تبحر یافته اند . اکنون با دسترسی به ژنهای R همسانه شده ، امکان جدیدی برای انتقال ژنهای R جدید به گیاهان از طریق تراریختی ژنیتیکی فرآهم آمده است . تا زمانیکه این روش ها از لحاظ قابلیت اعتماد ، انعطاف پذیری و هزینه با روشهای اصلاح نباتات سنتی قابل مقایسه نباشند و یا برتری نداشته باشند ، نمی توان انتظار داشت که بطور گسترده مورد استفاده قرارگیرند . با توجه به ظرفیت قوی این روش ها در عبور از موانعی همچون تفاوت گونه ای و صف آرایی ژنهای R به فرم دلخواه ، بنظر می رسد که تراریختی در آینده ای نزدیک در برنامه های اصلاحی وارد شود .
برای اینکه بتوان از ژنهای R در تراریختی گیاهان استفاده کرد ، باید ابتدا آنها را همسانه نمود . یکی از روشهای جداسازی ژنهای R مورد نظر ، استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) است . هر چند که توالی ژنهای مندرج در جدول 1 بسیار متفاوت به نظر می رسند . اما نواحی کوچکی با مشابهت زیاد را می توان در توالی های اسید آمینه مربوطه شناسایی نمود . در برخی از آزمایشگاهها از آغازگرهای PCR که بر اساس این نواحی بسیار حفاظت شده طراحی شده اند به منظور شناسایی ژنهای R استفاده می شود . از آغازگرهای مبتنی بر توالی های بسیار حفاظت شده بین RPS2 و N به منظور شناسایی برخی از فرآورده های PCR از جمله ژنی که دارای پیوستگی بسیار شدیدی با Grol در سیب زمینی است ، استفاده شده است . نتایج این تحقیق بویژه از این لحاظ جالب توجه است که ژن Grol نژاد – اختصاصی است که مقاومت در برابر عامل بیماری نماتد سیستی ریشه سیب زمینی را رمز می نماید و هیچ نوع ژن R مربوط به نماتد تا کنون همسانه نگردیده است . اما در حال حاضر نمی توان با استفاده از اطلاعات مربوط به توالی اسیدهای آمینه ، پیرامون اختصاصیت ژن Avr مربوط به همولوگ یک ژن R اظهار نظر نمود . بررسی لینکاژ ژنتیکی یک ناحیه DNA با مکان ژنی که فنوتیپ مقاومت مربوطه را رمز می نماید در درجه اول اهمیت قرار دارد ، اما ژنهای R اغلب بصورت دسته جات بسیار نزدیک به هم125 وجود دارند . بنابراین تنها هنگامی می توان با اطمینان بیان نمود که یک ژن R ، اختصاصیت مفروض را رمز می نماید که ژن مربوطه به یک ژنوتیپ حساس منتقل شود و فنوتیپ مقاوم ظاهر گردد ( تکمیل عملکردی126 ) .
گرچه تکنیک PCR که در فوق اشاره گردید روش بسیار مهمی در جداسازی ژنهای R جدید می باشد ، اما تمامی ژنهای R تایید شده که تا کنون همسانه گردیده اند ، با استفاده از روشهای همسانه سازی موضعی127 و با از طریق نشانمند کردن توسط ترانسپوزون ها128 جداسازی شده اند . گرچه روش های مذکور از لحاظ تکنیکی مشکل می باشند ، اما پروتکل ها و منابع بیولوژیکی در این زمینه رو به بهبود می باشند . با کسب دانش بیشتر ، سایر روشهای همسانه سازی برای ژنهای R امکان پذیر خواهد شد . یکی از روشهای استاندارد در بیولوژی مولکولی که هم اکنون قابل بکارگیری است عبارتست از غربالگری کتابخانه های ژنومی یا cDNA با استفاده از توالی ژنهای R به عنوان کاوشگر129 . همچنین می توان با استفاده از آنتی بادی ها برای ژنهای R اختصاصی کلونهایی را از ژنهای همولوگ جداسازی نمود . راه دیگر ، جستجوی کامپیوتری پایگاه داده ها به منظور شناسایی کلون های واجد توالی های نشانمند بیان شده و دارای شباهت با ژنهای R شناخته شده می باشد و همسانه سازی بیان130 ( تکمیل عملکردی از طریق تراریختی موقت131 با کتابخانه های ژنومی یا cDNA تصادفی ) نیز احتمال دارد امکان پذیر باشد . تمام روش های فوق الذکر مزایا و معایب مخصوص به خود را دارند ، اما برای اینکه همسانه سازی ژنهای R بصورت اکری روزمره و معمول درآید لازم است توانایی ما در انجام این روش ها بهبود یابد .
یکی از اهداف مهم مهندسی گیاهان در جهت بهبود مقاومت به بیماری ، انتقال مقاومت بین گونه ها از طریق تراریختی ژنتیکی توسط ژن R بوده است . این کار با انتقال ژن Pto به توتون انجام گرفت . بدیهی است برای اینکه فرآورده ژن R بتواند در گیاه جدید عمل نماید لازم است که با سایر اجزاء دخیل در مکانیسم دفاعی گیاه سازگار باشد . بنابراین نمی توان انتظار داشت که انتقال ژنهای R بین گونه ها در همه حالات سبب ایجاد مقاومت گردد . به عنوان مثال انتقال Pro و Rfs2 بین گوجه فرنگی و آرابیدوپسیس منجر به افزایش مقاومت نگردید . گوجه فرنگی و توتون دارای خویشاوندی نزدیکی هستند و علاوه بر انتقال موفقیت آمیز مقاومت ناشی از Pto به توتون ، حالت عکس آن نیز صادق بوده است بطوریکه مقاومت به ویروس ناشی از N در توتون با موفقیت به گوجه فرنگی منتقل گردید .
یکی از موارد استفاده سهل و معمول از ژنهای R عبارتست از تراریختی ارقام مربوط به یک گونه . در حقیقت افزودن مقاومت به گیاهی از گونه مشابه در برخی از حالات با موفقیت توام بوده است . بر اساس تاریخچه طولانی موفقیت در افزودن ژنهای R از طریق روشهای سنتی اصلاح نباتات ، انتقال ژنهای R به گونه مشابه احتمالاً در اکثر حالات موفقیت آمیز خواهد بود . اما ، همانطور که در فوق اشاره گردید ، استفاده از ترایختی ژنتیکی به منظور صف آرایی ژنهای R تنها وقتی نسبت به اصلاح نباتات سنتی قابل ترجیح خواهد بود که به مقدار قابل توجهی سبب صرفه جویی در زمان ، کار و تلاش و هزینه گردد و یا به عنوان وسیله ای برای اجتناب از ایجاد اختلال در ژنوتیپ های توسعه یافته و مطلوب تجاری مد نظر قرار گیرد . هیجان انگیزترین موضوع در زمینه مهندسی مقاومت به بیماری ، ایجاد ژنهای R جدید در آزمایشگاه است . این امر در مورد ژنهایی بسیار مشابه Pto و Fen به انجام رسیده و از طریق تعویض حوزه ها ، ژنهایی با اختصاصیت لیگاندی متضاد حاصل شده است . با کسب دانش بیشتر پیرامون اساس مولکولی شناسایی عامل بیماری و در پی آن ، فعال شدن آبشارهای دفاعی راهبردهای معقولتری رواج خواهد یافت . چالش اصلی در این حالت ایجاد مقاومت اختصاصی جدید نیست بلکه تولید ژنهای R است که بتوانند دامنه وسیعی از ژنوتیپ های عامل بیماری را شناسایی نمایند و باید به سمت صفات پایدار عامل بیماری هدف گیری شوند ، یعنی صفاتی که حتی در صورت وجود گزینش شدید برای ایزوله هایی که غیر بیماریزایی نشان نمی دهند (ایزوله هایی که بیماریزا هستند ) حاضر باقی می مانند .
در زمینه استفاده از ژنهای R به منظور مهندسی دامنه وسیع تر و پایدارتر مقاومت به بیماری دو راهبرد اساسی وجود دارد ؛ یکی شناسایی صفاتی از عامل بیماری است که در ایجاد بیماریزایی سهیم می باشند و در پی آن ، تمرکز بر روی همسانه سازی یا طراحی ژنهای R که بر اساس این صفات ، قابلیت شناسایی را به گیاه اعطاء می نمایند . راهبرد دیگر که پیچیده تر است عبارت است از ایجاد گیاهانی که ژن Avr عامل بیماری ( مانند Avr9 ) را تحت کنترل یک پروموتر هترولوگ القاء شونده در اثر بیماری132 بیان می کنند . اگر گیاه نیز حامل ژن R مربوطه ( مانند Cf-9 ) باشد ، در ناحیه ای که ژن Avr بیان گردیده است واکنش بروز خواهد نمود . این راهبرد بصورت تجربی به اثبات رسیده است و دارای چندین مزیت می باشد . اول اینکه اختصاصیت عامل بیماری بسیار گسترده است ( مقاومت در برابر هر عامل بیماری که سبب بیان پروموتر انتخابی می شود ، موثر است ) . دوم اینکه پاسخ دفاعی چند عاملی ناشی از ژنهای R موثرتر از بیان یک ژن دفاعی منفرد مانند کیتیناز است . سوم اینکه از لحاظ تنوری ، دفاع فقط در بافت های آلوده تظاهر می یابد . این نکته یک چالش لاینحل است ولی لازم است از یک پروموتر مختص آلودگی133 که شدیداً تحت تنظیم است، استفاده شود وگرنه پاسخ دفاعی در بافت نامناسب و یا در مرحله تکوینی نامناسب تظاهر خواهد یافت .
همچنانکه ژنهای R جدیداً طراحی شده ، رها گردیده و وارد مزرعه می شوند ضروری است راهبردهای قدیمی تر اصلاح نباتات و رها سازی ارقام که موجب افزایش پایدارای کنترل بیماری می شود مد نظر قرار گیرند . از جمله این روشها می توان به هرمی کردن چندین ژن R مختص یک عامل بیماری ( به منظور بهره برداری از این واقعیت که احتمال وجود تمامی ژنهای Avr مربوطه در عامل بیماری بطور همزمان اندک است ) ، رهاسازی ارقامی با ژنهای R متفاوت در فصول کشت متناوب ، یا کشت مخلوط بذور مقاوم و حساس یا لحاظ کردن کردتهای حساس بطوریکه ژنوتیپهای غیر بیماریزا در جمعیت عامل بیماری ، نسبت به استرین های بیماریزا غالب باقی بمانند ، اشاره نمود .
فهرست منابع:
1- محمدرضا قنات ها، مهدی زهراوی، مقاله حوزه های ساختمانی عمل و مهندسی ژنهای مقاومت به بیماریها در گیاهان نهمین کنگره علوم زراعت و اصلاح نباتات ایران.
2- جزوه اصلاح نباتات تکمیلی، استاد محترم جناب آقای دکتر بی همتا.
3- سایتهای اینترنتی:
www. FAO.org
www. Nal . usda.gov
www. Cigar.org
www. Biochem.vt.edu
4- Alfano, J.R., and Colher, A. (1996). Bacterial pathogens in plants: Life up against the wall. Plant Cell 8, 41683-1698.
5- Crute, IR., and Pink, D.A.C. (1996). Genetics and utilization of pathogen resistance in plants. Plant Cell 8, 1747-1755.
6- Dangl, J.L., Dietrich, R.A., and Richberg, M.H. (1996). Death don't have no mercy: Cell death programs in plant-microbe interactions . Plant Cell 8, 1793-1807.
7- Delaney, T.P. Uknes, S., Vernoolj, B., Friedrich, L., Weymann, K,cNegrotto, D., Gaffney, T., Gut-Rella, M., Kessmann, H., Ward, E., and Ryals, J. (1994) . A ventral role pf salicylic acid in plant disease resistance . Science 266, 1247-1250.
1 Necrotrophy
2 Biotrophy
3 Hemibiotrophy
4 Host – selective toxin
5 HC – toxin
6 Avirulence
7 Gene – for – gene relationship
8 Signal transduction
9 Programmed cell death
10 Phytoalexin
11 Chitinase
12 Glucanase
13 Reactive oxygen species
14 Salicylic acid
15 Race – specific elicitor
16 Race non – specific elicitor
17 Ligand
18 Receptor
19 NADPH-dependent reductase
20 Toxin-degrading
21 Positional clining
22 Chromosome walking
23 Heterologous transposon tagging
24 Serine-threonine protein kinase
25 Leucine-rich repeat
26 Phosphorylatiin
27 In vitro
28 Myristoylation
29 Hydrophilic
30 Hydrophobic
31 β-helical array
32 Degeneracy
33 Follicle
34 P-loop
35 Ribosomal elongation factor
36 Kinetic analysis
37 Consensus
38 Site specific
39 DeFense Signal transduction cascade
40 Leucin Zippers
41 Coil-coil
42 Homo-and heterodimerization
43 Myosins
44 Oxidative burst
45 Aspirin
46 Downstream
47 Antimicrobial
48 Glycine
49 Relatedness
50 Transmembrane receptor kinases
51 S-linked glycoprotein
52 Mutational analysis
53 Pathogen-derived molecules
54 Pathogen-related protein
55 Polygalacturonase inhibitor protein
56 Homogalacturonan
57 High affinity
58 Oligogalacturonide
59 Fenthion
60 PR-Box
61 Cleavage
62 Syringolide
63 Type III secretion apparatus
64 Gene rearrengement
65 Cryptic transposon
66 Cell wall cross-linking
67 Intraction-cloning
68 Anti-sense suppression
69 Transgenic overexpression
70 Systemic Acquired Resistance
71 Heterogenus multisubunit teceptors
72 Disease lesion mimic mutants
73 Divergence
74 Avirulence specifities
75 Alternative splicing
76 Transcript
77 Pathogenesis-related proteins
78 Cellilose
79 Pectin
80 Lignin
81 Phenolics
82 Alkaloids
83 Saponins
84 Reactive oxygen species
85 Phytoalexins
86 Cell wall components
87 Callose
88 Hydroxylproline-rich proteins
89 Tobacco mosaic virus
90 Proteolysis
91 Chlorosis
92 Necrosis
93 Novel
94 Systemic acquired resistance
95 Stress-related proteins
96 β-1,3-Glucancanase
97 Isoforms
98 Anther-specific
99 Chitinase
100 Chitin
101 Antifungal
102 Thaumatin-like proteins
103 Immunological relationship
104 Abscisic acid
105 Ethylene
106 Jasmonic acid
107 Proteinase inhibitor
108 Developmentally regulated
109 Vilrulence factor
110 Serine-proteinase
111 Cysteine-proteinase
112 Asparatic-proteinase
113 Metallo-proteinase
114 Peroxixase
115 Wall-bound
116 Cell Wall barrier
117 Messenger
118 Defensin
119 Thionin
120 Lipid transfer proteins
121 Oxalate oxidase
122 Viscotoxin
123 Morphogenesis
124 Branching
125 Tight clusters
126 Functional complementation
127 Positional cloning
128 Transposon tagging
129 Probe
130 Expression cloning
131 Transient transformation
132 Heterogous , infection-inducible promoter
133 Infection-specific promoter
—————
————————————————————
—————
————————————————————
1