استاندارد روش اندازهگیری اوره و ازت آمونیاکی در خوراک دام و طیور
1 ـ هدف
هدف از تدوین این استاندارد تعیین روشهای اندازهگیری اوره و ازت آمونیاکی در خوراک دام و طیور میباشد .
2 ـ دامنه کاربرد
این استاندارد جهت اندازهگیری اوره و ازت آمونیاکی در خوراک دام و طیور کاربرد دارد .
3 ـ نمونهبرداری
طبق استانداردهای روش نمونهبرداری در مواد غذائی عمل شود .
4 ـ روش کار
4-1- اندازهگیری اوره به طریق اسپکتروفتومتری
4-1-1- وسایل مورد نیاز
ـ اسپکتروفتومتر با حداکثر باند 2/4 در طول موج 420nm با سلهای یک سانتیمتری
4-1-2- معرفها و مواد مورد نیاز :
4-1-2-1- محلول پارادی متیل آمینوبنزالدئید 1
16 گرم پارادی متیل آمینو بنزالدئید را در یک لیتر الکل و 100 میلیلیتر اسید کلریدریک حل نمائید . این محلول برای یک ماده پایدار میماند .
4-1-2-2- اسید استیک
4-1-2-3- محلول استات روی : 22 گرم استات روی 2H2O 2(,OAC)Zn را در آب حل کرده و 3 میلیلیتر اسید استیک بآن اضافه نمائید سپس آن را تا حجم 100 میلیلیتر رقیق نمائید .
4-1-2-4- محلول فروسیانور پتاسیم : 10/6 گرم فروسیانور پتاسیم 6 3H2O(,CN) K2Fe را در آب حل کرده و به حجم 100 میلیلیتر برسانید .
4-1-2-5- زغال اکتیو ـ (60 – G)
4-1-2-6- محلول بافر فسفات با 7 = PH
4-1-2-7- محلولهای استاندارد اوره :
الف : محلول استاندارد اولیه با غلظت 5ml/mg
5 گرم اوره را با دقت یک میلیگرم در آب حل کرده و سپس آن را تا حجم یک لیتر برسانید .
ب : محلولهای استاندارد مورد استفاده با غلظتهای 0/2 , 0/4 , 0/6 , 0/8 , 1 , 1/2 , 1/4 , 1/6 , 1/8 و 2 میلیگرم اوره در 5 میلیلیتر : به ترتیب 2,4,6,8,10,12,14,16,18,20 میلیلیتر از محلول اولیه (5ml/mg) را برداشته و در بالن ژوژههای 50 میلیلیتری ریخته و هر کدام را با محلول بافر فسفات 7 به حجم برسانید .
ج : محلول مرجع : محلول اوره استاندارد با غلظت 1/mg5ml را که بشرح فوق تهیه گردیده بعنوان استاندارد مرجع بکار ببرید . این محلول در حرارت کمتر از 24 درجه سلسیوس به مدت یک هفته ثابت میماند .
4-1-3- رسم منحنی استاندارد اوره :
از هر یک از محلولهای استاندارد اوره ( طبق بند ب ) 5 میلیلیتر برداشته و در لولههای 25 میلیلیتری ریخته و به هر کدام 5 میلیلیتر محلول DMAB اضافه نمائید و یک محلول شاهد نیز حاوی 5 میلیلیتر محلول بافر 7 باضافه 5 میلیلیتر محلول DMAB تهیه نمائید . لولهها را کاملا تکان داده و بگذارید 10 دقیقه در بن ماری 25 درجه سلسیوس بماند . سپس جذب هر یک از محلولها را در طول موج 420nm با استفاده از سلهای یک سانتیمتری در مقابل شاهد ( با جذب صفر ) بخوانید . آنگاه میزان جذب محلولها را در مقابل غلظتها رسم نمائید . منحنی بدست آمده بایستی به صورت خط راست باشد در غیر این صورت آزمایش بایستی تکرار شده و محلول DMAB نیز تازه تهیه گردد .
4-1-4- روش اندازهگیری نمونه :
یک گرم از نمونه آسیاب شده را وزن نموده و در یک بالن ژوژه 500 میلیلیتری ریخته و بآن یک گرم زغال اکتیو و حدود 250 میلیلیتر آب , 5 میلیلیتر محلول استات روی و 5 میلیلیتر محلول فروسیانور پتاسیم اضافه نمائید . سپس مخلوط را به مدت 30 دقیقه کاملا با تکان دهنده تکان دهید و پس از آن حجم آن را با آب به 500 میلیلیتر برسانید . آنگاه بگذارید بماند تا رسوب ته نشین گردد . سپس آن را با استفاده از کاغذ صافی واتمن شماره 40 صاف کرده بطوریکه محلول صاف شده کاملاو شفاف باشد .
5 میلیلیتر از محلول صاف شده را در یک لوله آزمایش ریخته و بآن 5 میلیلیتر محلول DMAB اضافه کرده و کاملا تکان دهید . همراه با نمونه یک محلول استاندارد مرجع ( طبق بند ج ) و یک محلول شاهد نیز تهیه نموده و آنها را در بنماری با حرارت 25 درجه سلسیوس به مدت 10 دقیقه قرار دهید سپس میزان جذب نمونه و استاندارد را در مقابل شاهد در طول موج 420nm قرائت نموده و درصد اوره را طبق فرمول زیر محاسبه نمائید .
= درصد اوره
A1 = میزان جذب استاندارد مرجع
W = وزن نمونه بر حسب میلیگرم در حجم مورد آزمایش میباشد .
4-2- روش اندازهگیری ازت اورهای و آمونیاکی در خوراک دام و طیور
4-2-1- وسایل مورد نیاز
ـ بالنهای کجدال با ظرفیت 500 میلیلیتر
4-2-2- معرفها و مواد مورد نیاز
4-2-2-1- محلول ضد کف
4-2-2-2- محلول کلرور کلسیم :
25 گرم کلرور کلسیم ( CaCl2 ) را در 100 میلیلیتر آب حل نمائید .
4-2-2-3- معرف متیل رد :
یک گرم متیل رد را در 200 میلیلیتر الکل حل نمائید .
4-2-2-4- اسید کلریدریک نرمال
4-2-2-5- محلول سود نرمال
4-2-2-6- اوره خالص به فرمول شیمیائی 2(NH2)Co)
4-2-2-7- محلول اوره آز :
محلول تازه اوره آز در آب را با غلظتی تهیه کنید که هر 10 میلیلیتر محلول خنثی اوره آز , ازت موجود در 0/1 گرم یا بیشتر اوره خالص را تغییر دهد . برای این منظور باید ابتدا میزان قلیائیت و همچنین فعالیت آنزیم اوره آز تعیین گردد .
الف : تعیین قلیائیت محلول اوره آز
میزان قلیائیت اوره آز تجارتی را بشرح زیر تعیین نمائید .
0/1 گرم از اوره آز را در 50 میلیلیتر آب حل کرده و با محلول 0/1 نرمال اسید کلریدریک در مقابل معرف متیل رد تیتره نمائید . پس از بدست آوردن حجم اسید کلریدریک 0/1 نرمال مصرف شده یعنی میزان قلیائیت آنزیم , در موقع تهیه محلول اوره آز به ازاء هر 0/1 گرم اوره آز حل شده در آب , همان حجم اسید کلریدریک 0/1 نرمال که در بالا بدست آوردهاید , اضافه نمائید و بدین ترتیب محلول خنثی تهیه شده است .
ب : تعیین میزان فعالیت آنزیم اوره آز
ابتدا یک محلول یک درصد خنثی اوره آز تهیه کنید ( حدود 50 میلیلیتر ) سپس چند نمونه 0/1 گرمی اوره خالص توزین نموده و به بالن کجدال منتقل نمائید و به هر کدام از بالنهای محتوی 0/1 گرم اوره خالص حجمهای متفاوتی از محلول یک درصد اوره آز خنثی اضافه کنید و مانند آنچه که در روش آزمایش شرح داده میشود مراحل هضم و تقطیر را ادامه دهید .
میزان فعالیت اوره آز را از روی مقدار محلول اوره آزی که اوره را به طور کامل تبدیل کرده است محاسبه کنید . تبدیل کامل اوره آز از طریق بازیابی کامل ازت به وسیله تقطیر تعیین میگردد .
4-2-3- روش اندازهگیری نمونه مورد آزمایش
2 گرم نمونه را در بالن کجدال ریخته و حدود 250 میلیلیتر آب و 100 میلیلیتر محلول اوره آز بآن اضافه نمائید . در بالن را کاملا بسته و بگذارید یکساعت در حرارت آزمایشگاه و یا 20 دقیقه در حرارت 40 درجه سلسیوس باقی بماند . سپس خنک نمائید .
( اگر نمونه بیش از 5 درصد اوره داشته باشد مقداری محلول اوره آز به آن اضافه کنید .) سپس درب و گردن بالن را با چند میلیلیتر آب شسته و حدود 2 گرم اکسید منیزیم و 5 میلیلیتر محلول کلرورکلسیم و 3 میلیلیتر ضد کف اضافه نمائید . و عمل تقطیر را در بالن کجدال انجام دهید و در قسمت گیرنده حجم معینی اسید کلریدریک نرمال قرار دهید و عمل تقطیر را ادامه داده تا حجم ظرف محتوی اسید کلریدریک به 100 میلیلیتر برسد آنگاه محلول اسید را در مقابل متیل رد با سود نرمال تیتر نمائید و میزان ازت را طبق فرمول زیر محاسبه نمائید .
= درصد ازت اوره ای و آمونیاکی
که در آن :
A = حجم اسید کلریدریک نرمال بکار برده شده
B = حجم سود مصرفی
8