تکنیک های تهیه و تولید کشت آگار
مقدمه
هوایی که از آن تنفس می کنیم مملو از موجودات بسیار ریز است که با باد به حرکت درمی آیند. قارچ ها، باکتریها، ویروسها و گیاهان برای انتقال گرده های خود به مناطق دیگر از باد کمک می گیرند. در صورت عدم رعایت نکات بهداشتی، این ذرات می توانند چه در تهیه کشت خالص و چه در فرآیند تولید قارچ خوراکی خلل وارد نمایند.
به طور کلی منابع اصلی آلاینده محیط کشت عبارتند از
1. محیط اطراف
2. ظروف کشت
3. ادوات و ابزار کشت
4. پرورش دهنده و لباس وی
5. هاگ ها یا میسلیوم قارچ خوراکی
قارچ ها و تمامی موجودات زنده نسبت به مواد غذایی، رقابت تنگاتنگ و دائمی با یکدیگر دارند. هدف از ایجاد یک محیط استریل، حذف یا کاهش این گونه رقابت و در نهایت فراهم ساختن شرایط مناسب برای تکثیر قارچ خوراکی می باشد. اولین مرحله قبل از تهیه کشت خالص، احداث اطاقک تلقیح یا آزمایشگاه استریل است.
طراحی و احداث آزمایشگاه استریل
علت عمده شکست بیشتر پرورش دهندگان قارچ، عدم صرف وقت کافی به منظور احداث آزمایشگاه استریل است. کاری که چندان هم وقت و انرژی نمی برد، بلکه فقط یک و نیم روز کافی است تا یک انباری کوچک یا یک آبدارخانه را به یک اطاقک تلقیح مفید تبدیل نمود.
برای شروع تمام قالیچه ها، پتوها، پرده ها و دیگر مواد پارچه ای را که پناهگاه خوبی برای گرد و غبار و هاگ های مضر می باشند از محل دور کرده و تمامی دیوارها و سقف را با یک ماده ضد عفونی کننده کاملاً تمیز نمائید. اطاق را با یک رنگ روغنی براق یا اپوکسی بهداشتی رنگ زده تا شستشو های بعدی راحت تر گردد. پنجره ها یا هر منبع ورودی هوا را با یک پوشش پلاستیکی مناسب بپوشانید. محل ورودی اطاق را با پلاستیک یا هر ماده دیگر بصورت یک محفظه انتظار درآورده تا مانع جریان مستقیم هوا بدرون اطاق گردد و طراحی این محفظه باید به گونه ای باشد که هنگام ورود به آن؛ درب آزمایشگاه بسته باشد.
تجهیزات ذیل در هر آزمایشگاه ضروری است:
1- صندلی و میز محکم با سطح کاملاً صاف
2- چراغ الکلی، چراغ بنسن1 یا یک شعله معمولی گاز بوتان برای تولید حرارت
3- بطری اسپری حاوی محلول سفید کننده 10 درصد
4- تعدادی پتری دیش استریل و لوله آزمایش
5- تعدادی برچسب ، یک دفتر و خودکار
6- یک چاقوی آگار و حلقه تلقیح2
7- یک دستگاه اتوکلاو یا زودپز معمولی (بخار تحت فشار)
8- pH سنج یا کاغذ تورنسل معمولی
9- الکل 96 درصد و دیگر مواد ضد عفونی همچون وایتکس، فرمالین…
10- قفسه برای ظروف کشت، جالوله ای و…
تمامی این اجزاء بایستی درون آزمایشگاه بماند و در صورت خروج یکی از آنها به بیرون، هنگام برگشت آن به داخل آزمایشگاه باید از تمیز بودن آن، مطمئن شد.
به طور کلی برای طراحی یک آزمایشگاه باید علاوه بر تجهیزات و وسایل گفته شده اصول زیر نیز درنظر گرفته شود.
( اطاق تهیه محیط کشت که دارای تجهیزات کامل و قفسه های متعدد است (35 درصد مساحت کل)
( اطاقک شیشه ای استریل (محفظه تلقیح)(15 درصد مساحت کل)
( اتاق کشت (40 درصد مساحت کل)
( الباقی مساحت برای نگهداری وسایل، اتوکلاو، ترازوها، یخچال و انبار میسلیوم
و اسپان مادری (حدوداً 10 درصد)
با روش ساده ای می توان آزمایشگاه یا محیطی نیمه استریل بسته به حجم استفاده و دفعات کاری ایجاد نمود. درصد پاکی لازم برای اطاق استریل تابع مقدار هاگ محیط بیرون است. به عنوان مثال، در فصل زمستان با سرد شدن هوا، مقدار هاگ و آلاینده های هوا تا حد زیادی کاهش یافته، حال آن که در طول تابستان و بهار این مقدار بسیار زیاد می باشد. بنابراین لازم است در طی این دو فصل توجه کافی به استریل بودن محیط آزمایشگاه مبذول گردد. نکته مهم دیگر این که، تمامی ظروف و بطری های شیشه ای آلوده را باید به طریقی از بین برد تا ضریب آلودگی محیط آزمایشگاه به حداقل برسد.
بعد از احداث اطاق استریل باید یک سری اصول و نکات بهداشتی را کاملاً رعایت نمود. به این صورت که اطاق استریل را باید با یک محلول سفیدکننده (آب ژاول) کاملاً تمیز نمود؛ کف را طی کشیده و در پایان هوای اطاق را با یک محلول سفید کننده 10 درصد و با استفاده از یک سمپاشی پشتی یا اسپری ضدعفونی نمائیم. حداقل تا 15 دقیقه بعد از محلول پاشی نباید وارد اطاق شد. در هر مرحله از تلقیح و کشت این عملیات باید تکرار شود، چرا که همواره پیشگیری آسانتر و بهتر از درمان است.
پیش از ادامه بحث، ذکر چند نکته ضروری است. استریل نمودن و استریل نگاه داشتن محیط مستلزم توجه زیاد همراه با کمک و یاری مداوم دیگران است. این امر وقت گیر بوده و نباید سرسری و مقطعی انجام گیرد. هرگز یک چراغ الکلی یا شعله گاز را درون اطاق یا محفظه تلقیح روشن نگذارید، چرا که در یک محیط بسته اکسیژن هوا به زودی تمام می شود.
بعضی از پرورش دهندگان، بیش از نیاز لازم بهداشتی با آلودگی مقابله می نمایند. بدین ترتیب این افراد آزمایشگاه و در نهایت سلامتی خود را با مصرف وسواسی و افراطی قارچ کشها، باکتری کشها و ضدعفونی کننده های شیمیائی جهش زای خطرناک به خطر می اندازند. به طور مثال می توان به عوارضی همچون تنگی نفس، بی حسی های شدید همراه با تشنج های مداوم که گاه تا چندین روز نیز به درازا می انجامد که بر اثر کار طولانی مدت افراد، بلافاصله در اطاق هائی که مدت چندانی (کمتر از 15 دقیقه) از سمپاشی آنها بالاخص با سموم فنلی نگذشته اشاره کرد و یا از بین موارد متعدد دیگر، ابتلاء به سرطان پوست بواسطه تماس طولانی (چند سال) و مستقیم پوست (بدون پوشش ایمنی) با اشعه ماورای بنفش (uv) در حین استریل کردن نمونه ها داخل محفظه شیشه ای3 درون اطاق تلقیح اشاره نمود.
چنانچه علیرغم تلاش فراوان در جهت استریل نمودن محیط آلودگی باز هم در محیط باقی بماند در آن صورت می توان از راه کارهای ذیل استفاده نمود.
1. بخوردادن روغن استریل کننده مانند تری اتیلن گلایکول با گرم کن فتیله ای در فضای اطاق که ابری از قطرات بسیار ریز و نسبتاً سنگین در هوا ایجاد شده که ضمن پائین آمدن ذرات آلاینده معلق در هوا را جذب کرده و از بین می برند. ذرات این روغن نسبتاً ریز و فرار بوده و هیچ گونه لایه قابل مشاهده ای در فضا ایجاد نمی نماید. این روش ارزان و آسان می باشد.
2. احداث نوعی محفظه شیشه ای کاملاً مسدود و نیمه استریل برای نقل و انتقال و کارهای کشت بافت که می توان آنها را از چوب و پنجره ای کوچک برای نگاه کردن درون آن ساخت که در یک طرف آن دو سوراخ لاستیکی مخصوص تعبیه می نمایند تا هنگام کار، فرد بتواند دستان خود را داخل محفظه کرده و در صورت عدم استفاده، ورودی سوراخ ها با لفافه ای پوشیده می شود. مزیت عمده این محفظه ارزان، بودن استریل کردن آسان محیط داخل آن و عدم جریان مستقیم هوا به درون آن در ضمن کار می باشد.
3. استفاده از صافی های بسیار ریز که قطر چشمه های آن 3/0-1/0 میکرون بوده و از قطر هاگهای مضر بعضی قارچ ها و حتی از باکتری ها نیز کوچکتر است. از این صافی ها در سامانه های مخصوصی بنام هود تهویه ملایم استفاده می نمایند. در برخی از آزمایشگاه های پیشرفته تمام استریل، درون دیوارها یا سقف نیز از این نوع صافی ها استفاده شده و هوای ورودی اطاق با عبور از میان آنها تصفیه می شود.
برای کسب اطلاعات بیشتر به ضمیمه چهارم مراجعه شود
آلودگی، ممکن است در یک محل کم و در جای دیگر زیاد باشد و یا در یک مرحله از پرورش طغیان نماید یا این که علی رغم چند سال فعالیت، اثری از آن دیده نشود. از طرفی باید توجه داشت که نوع آلودگی، در مراحل و مکان های مختلف یکسان است، اما شدت و ضعف آن بسته به یک سری عوامل مختلف داخلی یا محیطی متفاوت است که با اعمال یک سری تمهیدات و اصول بهداشتی تا حدی می توان آن را کنترل نمود.
شکل 19- دستگاه تصفیه کننده هوا برای کاهش شکل 20- هود تهویه ملایم هوا
میزان هاگ آلاینده درون آزمایشگاه
آماده کردن محیط کشت
پس از تکمیل آزمایشگاه نوبت به تهیه محیط کشت مغذی آگار می رسد. آگار، محصولی است که از نوعی جلبک دریایی بدست آمده و برای سفت کردن محیط کشت بکار می رود و از نظر ظاهری بسیار شبیه ژلاتین است اما از نظر کارکرد، به مراتب از آن سودمندتر است. در زمینه تولید محیط کشت آگار غنی شده که مناسب قارچ های خوراکی باشد، فرمول های متعددی وجود دارد که از این میان می توان به فرمول های استاندارد PDA 4وMEA 5همراه با مکمل خمیرمایه6 اشاره نمود. در بسیاری از مجلات قارچ شناسی، فهرستی از انواع محیط های کشت آگار حاوی پپتن7 و نئوپپتن8 (دو منبع سرشار از پروتئین مورد نیاز میسلیوم) ارائه شده است. محیط کشتی که مولفان توصیه می نمایند، مخلوطی از دانه های جوشانده شده گندم یا چاودار غنی شده با شیره مالت است. برای افزایش رشد می توان به محیط کشت زایلوز و 1- آرابینوز (از قندهای پنج کربنه پنتوزی متبلور) اضافه کرد. از جمله مواد لازم دیگر برای محیط کشت می توان کلسیم، بیوتین، تیامین9، اسیدهای آمینه اسپاراژین، آلانین و گلایزین را نام برد.
آنچه در ادامه می بینید سه نوع فرمول مغذی آگار است که هر کدام از آنها برای رشد میسلیومهای انواع مختلف قارچ خوراکی همچون دکمه ای، صدفی، شی تاکه، استروفاریا، چینی، پانالوس و سیلوسب استفاده می شود که از بین آنها؛ 2 محیط PDY10 و MPG11 مورد توجه مولفان این کتاب می باشند. توصیه می شود برای افزایش رشد میسلیوم ها به هر محیط، مقداری پودر چاودار و یا عصاره آن افزوده شود. بعد از انتخاب هر یک از فرمول های زیر ترکیبات آن را بصورت خشک با هم مخلوط کرده، درون یک فلاسک ریخته و درنهایت با افزودن آب، حجم مخلوط را به یک لیتر برسانید.
شکل 21- محفظه شیشه ای استاندارد.
الف) آگار PDY (مخمر دکستروز سیب زمینی)
ـ عصاره صاف شده 300 گرم خلال سیب زمینی که در یک لیتر آب تا یک ساعت جوشیده باشد.
ـ 10 گرم قند (گلوکز راست گرد) (قند دکستروز)
ـ 2 گرم مخمر (اختیاری)
– 20 گرم آگار
ب) آگار MPG (مخلوط بذرـ پپتین ـ مالت)
ـ 20 گرم مالت عسلی رنگ12
ـ 5 گرم پودر بذر چاودار
ـ 5 گرم پپتین یا نئوپپتن
ـ 2 گرم مخمر (اختیاری)
ـ 20 گرم آگار
ج) آگار MEA (آگار عصاره مالت)
ـ 20 گرم مالت عسلی رنگ
ـ 2 گرم مخمر
ـ 20 گرم آگار
در تهیه محیط کشت، رعایت نکات زیر ضروری است
1. pH محیط کشت: گونه های متفاوت قارچ برای رشد و نمو در محیط کشت، pH خاص خود را می طلبند. بطوری که pH مطلوب برای گونه های سیلوب 7-6 می باشد؛ در حالی که این مقدار برای نوع دکمه ای 7-5/6 می باشد. اکثر گونه ها، نسبتاً مقاوم بوده و بخوبی در دامنه 5/7 -5/5 رشد می نمایند. pH کمتر از 5/4 و بالاتر از 7 باعث توقف رشد و نمو (هاگ ها و میسلیومها) می گردد و چنانچه pH محیط خیلی پائین باشد. محیط کشت رقیق می شود و باید محیط تازه با pH مطلوب آماده شود. pH ، بعد از اتوکلاو کردن تا 4/0 واحد کاهش می یابد.
چنانچه در حین تهیه محیط کشت، pH خیلی پائین یا بالا رود، می توان بترتیب آن را با Naoh یا Hcl (1 تا 1/0 مولار) رقیق، تعدیل کرده سپس محیط کشت را کاملاً هم زده و سپس pH آن را با یک pH سنج یا کاغذ تورنسل معمولی می سنجیم ( pH یک مول Hcl ، صفر؛ یک مول Naoh =12 و یک مول آب مقطر= 7 است).
2.ضدعفونی محیط کشت: این کار معمولاً به دو روش صورت می گیرد.
الف: با مواد شیمیائی: مانند الکل 70درصد؛ هیپوکلریت سدیم (وایتکس) 1درصد و بالاخص آنتی بیوتیکها. در هر صورت ساده ترین راه، استفاده از مواد گیاهی غیر آلوده است. جهت کنترل باکتریها در محیط کشت، 1/0 گرم از محلول سولفات جنتامایسین 80-60درصد را قبل از عمل اتوکلاو کردن باید به هر لیتر از این محیط ها اضافه نمود. همچنین می توان از نوع دیگر آنتی بیوتیک بنام استرپتومایسین بعد از استریل کردن محیط کشت استفاده کرد. در مجموع باید از آنتی بیوتیکها بصورت موقتی و به مقدار بسیار اندک بهره جست چون غلظت بالای آنها، مانع رشد و نمو بعضی گونه ها و از طرف دیگر ایجاد مقاومت در باکتریها می شود.
ب) با بخار: بعد از اختلاط کامل ترکیبات محیط کشت و در صورت باقی ماندن اثرات باکتری بعد از ضدعفونیِ شیمیائی (آنتی بیوتیکها) می توان برای رفع هر گونه آلودگی با بخار تحت فشار، محیط کشت را استریل و یا به اصطلاح اتوکلاو نمود. استریل کردن صحیح، بستگی به زمان، فشار، درجه حرارت و حجم ماده مورد استریل دارد. در شرایط عادی می توان محیط کشت آماده را داخل ارلن پیرکس (به علت دهانه تنگ آن میزان تهویه، خشک شدن و ضریب آلودگی کاهش می یابد) ریخته درب آن را با یک فویل آلومینیومی پوشاند. دقت کنید که حجم آگار درون ارلن نباید از تا حجم کل ظرف بیشتر شود.
ظرف کشت را داخل اتوکلاو یا زودپز معمولی13 قرار داده و ته زود پز را یک سانتی متر آب مقطر بریزید تا بخار لازم تامین شود. طبق دستورالعمل شرکت سازنده، درب زودپز را کاملاً بسته آن را حرارت دهید تا بخار فراوان تولید نماید. قبل از بستن سوپاپ اطمینان بخار، بگذارید تا بخار آن به مدت 4 تا 5 دقیقه خارج شود. به آرامی فشار را به 15 پوند14 رسانده و 30 دقیقه در همین فشار نگهدارید. توجه کنید دمای ظرف از 121 درجه سانتی گراد فراتر نرود، چه در غیر این صورت قند موجود در محیط کشت، سوخته و به اصطلاح کارامل می شود که در نتیجه آن؛ رشد میسلیوم متوقف شده، یکسری جهش های ناخواسته ژنتیکی پدیدار می شود. از طرفی اتوکلاو کردن بیش از 30 دقیقه باعث ته نشین شدن املاح مفید (بخصوص k+ ) و تجزیه آگار می شود. هم چنین باید ظروف خالی شیشه ای و کاغذها را بطور جداگانه به مدت 30 دقیقه در دمای 130 سانتی گراد (بصورت خشک) استریل نمود.
نکته حائز اهمیت دیگر در مورد اتوکلاو کردن، این که زمان لازم برای این عمل بسته به ارتفاع از سطح دریا، متفاوت است. طبق قانون بویل ـ ماریوت؛ در حجم ثابت، دما و فشار رابطه مستقیمی با یکدیگر دارند. فشار هوا را معمولاً نسبت به سطح استاندارد دریا محاسبه نموده و هر چه از سطح دریا بالاتر می رویم فشار هوا کمتر می شود. لذا در ارتفاعات بالاتر، متناسب با مقدار ارتفاع از سطح دریا، باید فشار اتوکلاو یا زودپز را افزایش دهیم تا خللی در عمل استریلیزاسیون وارد نشود. ذیلاً نسبت های بین پارامترهای دما، فشار هوا، و تغییرات نقطه جوش آب در ارتفاعات مختلف را در جدول ذیل می بینید. بعنوان مثال در ارتفاع حدوداً 1500 متری از سطح دریا، نقطه جوش آب نسبت به سطح دریا تقریباً 5/4 -5 درجه سانتی گراد کاهش می یابد (C˚95) و از طرفی در این ارتفاع؛ فشار هوا 5 پوند یا تقریباً 4/0 اتمسفر نسبت به سطح دریا افزایش می یابد (4/1 اتمسفر) در نتیجه با توجه با این که نباید دمای داخل اتوکلاو را (به سبب بروز تغییرات شیمیائی مواد داخل آن) افزایش دهیم، بناچار مجبوریم، فشار را به میزان 4/0 آتمسفر (5 پوند) بالا ببریم تا جبران 5 اختلاف دما را در این ارتفاع با توجه به حجم ثابت مواد درون اتوکلاو بنماید.
جدول1-2- رابطه بین ارتفاع و نقطه جوش و نیز فشار و دما
رابطه ارتفاع و نقطه جوش
رابطه فشار- دما در حجم ثابت
نقطه جوش
ارتفاع ازسطح دریا(متر)
فشارKg/cm2
(سانتی گراد) دما
100
در سطح دریا
07/0
100
99
307
2/0
104
98
619
3/0
108
97
5/934
7/0
115
96
1250
=1atm05/1
121
95
1567
5/1
126
93
1892
75/1
130
توجه کنید استریلیزاسیون در فشار 05/1 kg/cm2 به مدت یک ساعت دارای نتایج مشابهی با استریلیزاسیون در فشار kg/cm22 به مدت 30 دقیقه (یعنی دوبرابر کردن فشار و نصف کردن مدت زمان) دارد؛ منتها مساله مهم در این جا این است که اکثر زودپزها تحمل این فشار را ندارند که باید حتماً قبل از استفاده به برچسب کنترل کیفی روی هر زودپز توجه شود.
بعد از اتمام استریل کردن؛ زودپز را در آزمایشگاه یا یک اطاق نیمه استریل قرار داده، اجازه دهید تا قبل از باز کردن درب آن، فشار به یک پوند (07/0kg/cm2) کاهش یابد. سپس درب آن را باز نمائید و اقدام به ریختن آگار در پتری دیش ها نمائید. باید دانست با هر لیتر از محلول آگار بدست آمده می توان 30 پتری دیش 15×100 میلی متر را پر نمود. چنانچه با محدودیت فضای میزکار مواجه هستید، می توانید پتری دیش ها را پس از پر نمودن یک به یک روی هم بگذارید اما در غیر این صورت می توانید هر یک از پتری دیش ها را در کنار هم قرار دهید و دامنه کار خود را توسعه دهید (شکل 22و23).
شکل 22 و 23- نحوه ریختن آگار در پتری دیش ها – سمت چپ: روش چیدن عمودی پتری دیشهای پر شده (میز کار کوچک)؛ در سمت راست چیدن پتری دیشهای پر شده در کنار هم دیگر (میز کار بزرگ).
پیش از پر نمودن پتری دیش ها، محلول کشت را به شدت تکان دهید تا محتویات آن خوب پخش شده مخلوطی همگن بدست آید. سپس بگذارید تا آگار خنک شده و یکنواخت گردد و سپس اقدام به پر نمودن پتری دیش ها نمائید تا بدین وسیله از تعریق جدار داخلی ظروف که از ریختن محلول آگار گرم ناشی می شود، جلوگیری شود.
حال، این محلول آماده کشت هاگ یا بافت زنده می باشد که در ادامه روش آنرا خواهیم دید.
کشت هاگ15
کشت خالص به منظور تهیه اسپان مورد نیاز برای تکثیر قارچ خوراکی را به دو روش می توان تهیه نمود. کشت هاگ، که به نوعی می توان آن را تکثیر جنسی نامید و دارای تفریق صفات و تنوع بالای نتاج حاصله از نظر کیفیت و کمیت محصول می باشد. از این روش بیشتر برای تهیه بذر قارچ استفاده می شود. روش دوم کشت بافت زنده16 یا به اصطلاح تکثیر غیرجنسی17 و یا کلونینگ18 می باشد. این روش به علت شباهت بالای نتاج تولیدی با والدین؛ بیشتر در تکثیر قارچ هائی که از نظر کیفیت و کمیت محصول در حد مطلوبی هستند استفاده می شود.
پرورش دهندگان قارچ، کشت هاگ را بدلیل راحتی اجرا و ماندگاری بالای هاگ ها حتی تا ماهها بعد از تجزیه کلاهکها ترجیح می دهند. اما ماندگاری کلاهکها یا بافت زنده بسیار کم است (1 تا 2 روز) و باید بلافاصله بعد از چیدن بافت، اقدام به کشت نمود.
گرفتن نقش هاگ19
مرحله اول در کشت هاگ؛ جمع آوری مقداری هاگ (نقش اسپور) از قارچ های سالم و مناسب می باشد. بدین منظور کلاهک سالم، تازه و کاملاً تمیزی را از ساقه جدا نموده و بطور واژگون روی یک کاغذ سفید یا سطح شیشه ای تمیز (اسلاید میکروسکوپ) یک تا دو ساعت می گذاریم. چنان چه کلاهک موردنظر خشک باشد، جهت رهاسازی آسانتر هاگ یکی دو قطره آب مقطر به آن زده و برای جلوگیری از کاهش تبخیر و جریان هوای مستقیم، یک بشر بر روی آن می گذاریم. پس از چند ساعت که هاگ ها، کاملاً رها شد و نقش تیغه ها روی کاغذ افتاد؛ کاغذ هاگ ها را بریده از وسط تا می زنیم و دریک ظرف کاملاً در بسته گذاشته وروی آن را بر چسبی حاوی زمان جمع آوری؛ گونه قارچ و شماره جمع آوری می زنیم. در صورت جمع آوری هاگ ها روی لامل میکروسکوپ، کافیست هاگ ها را ما بین دو لامل قرار داده دور تا دور لبه این دو لامل را با نوار چسب بچسبانیم تا از نفوذ هاگ های آلاینده، ایمن شود. در صورتی که در جمع آوری و نگهداری هاگ ها دقت کافی نشود، محیط کشت هاگ آلوده شده و امکان به دست آوردن یک کشت خالص کاهش می یابد. (شکل 24 الف)
شکل 24 الف- جمع آوری هاگ ها بر روی کاغذ سفید تایپ (نقش هاگ).
شکل 24 ب- گرفتن نقش هاگ برروی پتری دیش و لامل میکروسکوپ.
Bunsen burner .1
inoculating .2
glove box .3
P.D.A= Potato Dextrose agar .4
MEA= Malt Extract Agar .5
yeast .6
(نوعی ماده آلیومینی سهل الهضم) Peptone .7
Neopeptone .8
ویتامین ب کمپلکس Thiamine .9
مخفف Potato Dextrose Yeast .10
مخفف Malt Peptone Grain .11
1. توجه شود که از مالتهای تیره رنگ آبجو سازی استفاده نکنید، بلکه باید از مالتهای روشن و عسلی و پودر مانند استفاده نمایید.
Pressure cooker .13
2 . معادل با.kg/cm2. 05/1..یا تقریباً.1 آتمسفر( atm)
Spore culture .15
Tissue culture .16
Asexual propagation . 17
clonning .18
Spore print .19
—————
————————————————————
—————
————————————————————
14