دانشگاه آزاد اسلامی واحد دامغان
پایان نامه جهت دریافت کارشناسی ارشد زیست شناسی علوم جانوری (سلولی تکوین)
عنوان:
ارزیابی سمیت گوسیپول بر دو رده مشتق از سلولهای بنیادی بافت بیضه
استاد راهنما:
دکتر سید غلامعلی جورسرایی
استاد مشاور:
دکترویدا حجتی
دانشجو:
ندا مهدی نژاد
زمستان 90
Islamic Azad University Damghan Branch
Faculty Of Basic Science Department Of Animal Biology
M.Sc Thesis On Developmental Biology
Title:
Evaluation of Gossypol induced Cytotoxicty
on two Stem Cell lines derived from Testicular tissue
Thesis Advisor:
Seyyed GholamAli Joursaraei (Ph.D)
Consulting Advisor:
Vida Hojjati (Ph.D)
By:
Neda Mahdinejad
Winter 2012
سپاس خدایی را که اول و آخر وجود اوست
بی آنکه دومی بر او پیشی گیرد یا آخری پس از او باشد
از استاد راهنمای ارجمند جناب آقای دکتر جورسرایی
که با سعه صدر و صبوری، مرا راهنمایی نموده
و در پیشبرد این پایان نامه، سعی تمام را مبذول داشته اند کمال تشکر را دارم.
همچنین از جناب آقای دکتر ذبیحی
که در طول این تحقیق، با رهنمود های ارزشمند و زحمات بی دریغشان، مرا مورد لطف خود قرار دادند صمیمانه سپاسگذارم.
و از استاد مشاور گرامی سرکار خانم دکتر حجتی
که با ارائه نظرات سازنده و تشویق های خود، مرا یاری کردند
صمیمانه قدردانی می کنم.
تقدیم به پدر و مادر عزیزم:
به پاس تعبیر عظیم و انسانی شان از کلمه ایثار و از خود گذشتگی
به پاس قلب های بزرگشان که فریادرس است
و سرگردانی و ترس در پناهشان به شجاعت می گراید
و به پاس محبت های بی دریغشان که هرگز فروکش نمی کند.
و به خواهر و برادران گرامی ام:
به پاس عاطفه سرشار و گرمای امیدبخش وجودشان
که بهترین حامی ام در سخت ترین روزگار زندگی ام هستند و خواهند بود.
فهرست مطالب
چکیده فارسی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………..1.
فصل اول: مقدمه…………………………………………………………………………………………………………………………………………3.
بیضه…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..4.
سلولهای سرتولی………………………………………………………………………………………………………………………………………………….4.
سلولهای ژرمینال………………………………………………………………………………………………………………………………………………….5.
اسپرماتوسیت اولیه………………………………………………………………………………………………………………………………………………..5.
سلولهای بنیادی …………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 5.
اسپرماتوگونی(گونه ای از سلولهای بنیادی در انسان)…………………………………………………………………………………………………..8.
سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی در موش……………………………………………………………………………………………………………………9.
رده سلولی رده سلولی GC1-spg …………………………………………………………………………………………………………………………10.
محیط کشت مناسب برای GC1-spg……………………………………………………………………………………………………………………..10.
رده سلولی SFTF-PI43…………………………………………………………………………………………………………………………………….11.
محیط کشت مناسب برای SFTF-PI43…………………………………………………………………………………………………………………11.
ناباروری…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..11.
ناباروری در جنس مذکر……………………………………………………………………………………………………………………………………..12.
ناباروری در جنس مونث……………………………………………………………………………………………………………………………………. 12.
عوامل ایجاد کننده ناباروری:
الف- ژنتیکی: …………………………………………………………………………………………………………………………………………………..13.
ب- شرایط محیطی:……………………………………………………………………………………………………………………………………………13.
تاثیر سموم بر روی باروری…………………………………………………………………………………………………………………………………..14.
سموم گیاهی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………..15.
گوسیپول………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….16.
بررسی تاثیرات گوسیپول بر روی حیوانات وانسان…………………………………………………………………………………………………….20.
سمیت عمومی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………20.
اثر گوسیپول بر روی حیوانات……………………………………………………………………………………………………………………………….21.
1- نشخوارکنندگان:
الف- گاو…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………21.
ب- گوسفند……………………………………………………………………………………………………………………………………………………..22.
2- غیرنشخوارکنندگان:
الف- خوک……………………………………………………………………………………………………………………………………………………..22.
ب- خرگوش…………………………………………………………………………………………………………………………………………………….23.
ج- سگ…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..24.
د- ماهی……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………24.
جدید ترین یافته ها از اثرات گوسیپول……………………………………………………………………………………………………………………25.
تاثیر گوسیپول بر روی انسان…………………………………………………………………………………………………………………………………26.
کشت سلول………………………………………………………………………………………………………………………………………………………26.
پیشینه تحقیق……………………………………………………………………………………………………………………………………………………..27.
فصل دوم: روش کار………………………………………………………………………………………………………………………………..31.
مواد
تهیه رده های سلولی……………………………………………………………………………………………………………………………………………32.
شرایط نگهداری رده های سلولی………………………………………………………………………………………………………………………….32.
محیط کشت RPMI-1640……………………………………………………………………………………………………………………………….32.
سرم جنینی گاو (fbs)…………………………………………………………………………………………………………………………………………33.
Pbs………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..33.
Penstrep………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..34.
DMSO………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….34.
Trypsin EDTA…………………………………………………………………………………………………………………………………………….35.
Trypan Blue sain…………………………………………………………………………………………………………………………………………35.
روش کار
پاساژ سلولی………………………………………………………………………………………………………………………………………………………36.
ساخت محیط کشت کامل……………………………………………………………………………………………………………………………………38.
چگونگی تهیهBack up …………………………………………………………………………………………………………………………………….39.
احیای سلول ها…………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 39.
کاشت رده سلولی:
1- تعیین زمان دو بررابر شدن سلولی……………………………………………………………………………………………………………………..39.
2- کاشتردهسلولیدر پلیت 24 خانه…………………………………………………………………………………………………………………….41.
تهیه محلول گوسیپول………………………………………………………………………………………………………………………………………….42.
بررسی سمیت سلولی…………………………………………………………………………………………………………………………………………..43.
تعیین سمیت گوسیپول به روش آزمون MTT…………………………………………………………………………………………………………43.
آزمون MTT……………………………………………………………………………………………………………………………………………………44.
بررسی سمیت با استفاده از تریپان بلو……………………………………………………………………………………………………………………..47.
روش آماری……………………………………………………………………………………………………………………………………………………..48.
فصل سوم: یافته ها
بررسی سمیت گوسیپول در رده سلولی GC1-spg با تست MTT……………………………………………………………………………..50.
بررسی سمیت گوسیپول در رده سلولی SFTF-pI43با تست MTT……………………………………………………………………………52.
بررسی سمیت گوسیپول در رده سلولی GC1-spgو SFTF-pI43با تست تریپان بلو…………………………………………………….55.
شمارش سلولی برای تخمین زمان دو برابر شدن ………………………………………………………………………………………………………60.
IC50گوسیپول در دو رده سلولی………………………………………………………………………………………………………………………….61.
فصل چهارم: …………………………………………………………………………………………………………………………………………………62.
بحث و نتیجه گیری…………………………………………………………………………………………………………………………………………….63.
فصل پنجم……………………………………………………………………………………………………………………………………………………..70.
مشکلات…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..71.
پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………72.
تقدیر وتشکر……………………………………………………………………………………………………………………………………………………..73.
منابع……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 74.
چکیده انگلیسی………………………………………………………………………………………………………………………………………………….87.
فهرست جداول
جدول شماره 1-3 : نتایج آزمون MTT پس از مجاورت ردههای سلولی GC1-spg با غلظتهای مختلف گوسیپول……………50.
جدول شماره 2-3 : مقایسه آماری سمیت گوسیپول در با گروه کنترل در رده سلولی GC1-SPG توسط آزمونMTT……..51.
جدول شماره 3-3 : نتایج آزمون MTT پس از مجاورت ردههای سلولی SFTF-pI43 با غلظتهای مختلف گوسیپول…………53.
جدول شماره4 -3 : مقایسه آماری سمیت گوسیپول رده سلولی SFTF-pI43توسط آزمونMTT …………..54.
جدول شماره 5-3 : میانگین درصد حیات سلول های SFTF-PI43و GC1-SPG پس از مجاورت با گوسیپول به روش رنگ آمیزی تریپان بلو…………………………………………………………………………………………………………………………………………56.
جدول شماره 6-3 : مقایسه آماری سمیت گوسیپولرده سلولی GC1-SPG با استفاده از روش رنگ آمیزی تریپان بلو………………………………………………………………………………………………………………………………………………..57.
جدول شماره 7-3 : مقایسه آماری سمیت گوسیپول با گروه کنترل در رده سلولی SFTF-pI43 با استفاده از روش رنگ آمیزی تریپان بلو………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….59.
فهرست نمودارها
نمودار شماره 1-3 : درصدحیات سلولهای GC1-spg در مجاورت باغلظتهای توسط آزمون MTT…………………………………..52.
نمودار شماره 2-3 : در صد حیات سلولهای SFTF-PI43 در مجاورت با غلظتهای گوسیپول توسط آزمون MTT…………………55.
نمودار شماره 3-3 : در صد حیات سلولهای GC1-spgپس از مجاورت با غلظتهای گوسیپول به روش تریپان بلو…………………58.
نمودار شماره 4-3 : درصد حیات سلولهای SFTF-PI43 پس از مجاورت با غلضتهای گوسیپول بهروش آزمون تریپان بلو…….60.
نمودار شماره 5-3 : نحوه محاسبه زمان تقریبی دوبرابر شدن رده سلولی GC1-spg…………………………………………………………60.
نمودار شماره 6-3 : نحوه محاسبه زمان دو برابر شدن در رده سلولی SFTF-PI43…………………………………………………………..61.
نمودار شماره 7-3 : تعیین IC50گوسیپول توسط آزمون MTT در دو رده سلولی…………………………………………………………..61.
فهرست تصاویر
تصویر شماره 1-1 : طرحی از تکثیر اسپرماتوگونی ها و بازسازی سلولهای بنیادی در جوندگان……………………………………10.
تصویر شماره 2-1 :گیاه پنبه دانه……………………………………………………………………………………………………………………….16.
تصویر شماره 3-1 : ساختار گوسیپول…………………………………………………………………………………………………………………18.
تصویر شماره 1-2 : نمایی از سلولهای GS1-spg………………………………………………………………………………………………..37.
تصویر شماره 2-2 : نمایی از سلولهای، SFTF-PI43 …………………………………………………………………………………………..37.
تصویر شماره 3-2 : نحوه کشت سلولها در پلیتهای 24 خانه……………………………………………………………………………………41.
تصویر شماره 4-2 : پودر گوسیپول استیک اسید ……………………………………………………………………………………………….43.
تصویر شماره 5-2 : غلظتهای مختلف گوسیپول……………………………………………………………………………………………………43.
تصویر شماره 6-2 : غلظتهای مختلف گوسیپول برای انجام آزمون MTT ……………………………………………………………….46.
تصویر شماره 7-2 : اضافه شدن MTT بعد از24 ساعت به چاهکهای پلیت……………………………………………………………….46.
.
چکیده
ارزیابی سمیت گوسیپول بر روی دو رده سلول های بنیادی بافت بیضه
سابقه وهدف:
گوسیپول یک ترکیب پلی فنلی استخراج شده از گیاه پنبه دانه است. در حال حاضر این گیاه به عنوان مکمل غذایی برای تغذیه نشخوار کنندگان استفاده می شود. بعضی از مطالعات حاکی از آن است که مصرف بیش از اندازه گوسیپول، باعث اختلال در فرآیند اسپرماتوژنزیس می شود. با توجه به اینکه ممکن است این ماده بر روی سلولهای ژرمینال تاثیر بگذارد، لذا در این پژوهش، به بررسی اثر آن بر روی دو رده سلول بنیادی بافت بیضه موش GC1-spg (حیوان غیرنشخوار کننده ) و بافت بیضه گوسفند SFTF-PI43 (حیوان نشخوار کننده) پرداخته شد.
روش کار:
سلولهای GC1-spg و SFTF-PI43، در محیط کشت RPMI1640 به همراه 10% FBSو همچنین پنی سیلین و استرپتومایسین کشت داده شدند. سپس از هر رده سلولی، تعداد 104×5 سلول در چاهک های دو پلیت 24 خانه کاشته شد. پس از تهیه محلول گوسیپول اسید استیک در 4 غلظت 25/1، 5/2، 5 و 10 میکرومولار به مدت 24ساعت با ردههای سلولی ذکر شده مجاورت پیدا کرده و انکوبه شدند. به منظور بررسی اثر گوسیپول استیک اسید بر روی رشد سلولها، از روش MTT asseyو همچنین جهت بررسی حیات سلولی از روش رنگ آمیزی Trypan Blue استفاده گردید. آنالیز دادهها توسط آزمون یک طرفه ANOVA و T-Test با استفاده از نرم افزار SPSS انجام شد.
یافتهها:
در این مطالعه، میزان سمیت گوسیپول، در غلضتهای 5/2، 5 و 10 میکرومولار نسبت به گروه کنترل، در هر دو رده سلولی دیده شد، که از نظر آماری معنی دار بود (P<oo1). میزان سمیت گوسیپول در غلظت 25/1 میکرومولار، از نظر آماری معنی دار نبود.
نتیجه گیری:
اثر سمیت گوسیپول استیک اسید بر روی دو رده سلولی بافت بیضه GC1-spg , SFTF-PI43))، حاکی از کاهش توانایی حیات سلولهای بنیادی در روند اسپرماتوژنزیس بوده که وابسته به دوز است.
واژههایکلیدی: گوسیپول، توکسیسیتی، GC1-spg ، SFTF-PI43 ، بافت بیضه .
فصل اول
مقدمه
بیضه:
بیضه، دارای یک کپسول ضخیمی است، که توسط بافت همبند متراکمی به نام تونیکا آلبوژینه آ، احاطه شده است. همچنین یک کیسه سروزی از خارج آن را احاطه کرده است که تونیکا واژینالیس نام دارد. بیضه شامل 250 بخش هرمی به نام لوبول های بیضه بوده که در هر لوبول 1 تا 4 عدد لوله پیچ دار یا لوله های اسپرم ساز1 در آن وجود دارد. در بین این لوله ها بافت ظریفی وجود دارد که شامل عروق خونی، لنفاوی و اعصاب و تعدادی سلول به نام سلول بینابینی (لایدیگ) است. کار مهم این سلول ها، تولید هورمون تستوسترون یا آندرروژن می باشد (6).
سلولهای سرتولی:
سلولهای مهم دیگری در عمل کرد بیضه وجود دارند که نقش پشتیبانی،حفاظت و تغذیه اسپرماتوزوئیدهای در حال تکامل را به عهده میگیرند، این سلولها را سرتولی می نامند. این سلولها، طویل و هرمی شکل بوده که قاعده آنها بر روی غشای پایه لوله اسپرم ساز و راسشان تا مجرای لوله امتداد یافته است. سلولهای سرتولی دارای هسته ای مثلثی شکل و سیتوپلاسمی نامنظم و تعداد زیادی میتوکندری، لیزوزوم و شبکه آندوپلاسمی صاف و خشن میباشد. این سلولها به وسیله اتصالات شکافدار به هم متصل هستند که سبب ایجاد ارتباط یونی وشیمیایی بین این سلولها میشود. سلولهای سرتولی در برابر شرایط نامطلوب همانند عفونت و یا قرارگیری در معرض پرتو x نسبت به سلولهای رده اسپرماتوژن، مقاومترند (6و70).
سلولهای ژرمینال :
بر روی غشای پایه لولههای اسپرم ساز 8- 4 طبقه سلول جنسی قرار داشته که کارشان تولید اسپرماتوزوئیدها است. این روند را اسپرماتوژنزیس مینامند که شامل تقسیم میتوزی، میوزی و تمایز نهایی اسپرماتیدها است (70).
اسپرماتویست اولیه :
سلولهای زایای اولیه به سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی تبدیل شده و از اجتماع سلولهای بنیادی، سلولهایی برای ساختن اسپرماتوگونی A که ایجاد آن به طور مشخص آغازگر اسپرماتوژنز میباشد به وجود میآید. سلولهای A در ادامه با تقسیمات میتوزی خود تبدیل به اسپرماتوگونی B شده و این نوع اسپرماتوگونی به اسپرماتوسیتهای اولیه تقسیم میشوند (70).
اسپرماتویست ثانویه نیز از اسپرماتویست اولیه توسط تقسیم میوزی شکل میگیرد و در نهایت از اسپرماتوسیت ثانویه، اسپرماتید به وجود می آید (6) .
سلول بنیادی:
سلولهای بنیادی سلولهاییاند که دو ویژگی مهم یعنی توانایی تقسیم و تولید سلولها با ویژگی یکسان (خودنوزایی2) را دارند. این سلولها هنگامی که تقسیم میشوند، میتوانند سلولهای تخصصی و تمایز یافته ای را ایجاد کنند (85). خود نوزایی سلولهای بنیادی، از اساسیترین ویژگیهایی هستند، که این سلولها آن را کسب مینمایند. این سلول ها ازطریق تقسیم میتوزی تکثیر یافته و تمام سلولهای دختری به وجود آمده، دقیقا شبیه به سلولهای مادری خود هستند (4و53).
تقسیم در این نوع سلولها، به دو روش متقارن و نامتقارن صورت میپذیرد. در تقسیم متقارن شرایط به این صورت است که دو سلول دختری کاملا شبیه به سلول مادری بوده و تا زمانی که شرایط تمایز برای آن وجود داشته باشد، تقسیم ادامه مییابد. در تقسیم نامتقارن نیز هر سلول بنیادی به یک سلول بنیادی که ویژگیهای خود نوزایی دارد و همچنین یک سلول پیش ساز که به یک سلول تخصص یافته تبدیل شده است، تقسیم میشوند. با فراهم شدن شرایط تمایز، سلول پیش ساز متمایز میگردد (13 و53).
این سلولهای بنیادی را میتوان به انواع همه توان، پرتوان و چند توان تقسیم نمود. همه توان، سلولهایی هستند که قادرند همه سلول ها اعم از سلول های خود فرد و یا سلولهای برون جنینی (جفت)، و بلاستومر های یک جنین دو سلولی را بسازند. سلولهای پرتوان نیز همین توانایی را داشته ولی با این تفاوت که این سلولها قادر به ایجاد سلولهای برون جنینی یعنی جفت، نیستند (73) .
در کنار این دو حالت، اگر سلولها تعداد محدودتری از انواع سلول را تولید نمایند، سلولهای چند توان نامیده میشوند. نمونه آن سلولهای بنیادی خاصی است که در بافت بالغین وجود دارد (76). یک سری سلولهای دیگری نیز مانند unipotent, bipotent, Tripotent, ouadripoten, oligopotent وجود دارند که با توجه به توانایی شان در رشد، تبدیل به یک، دو، سه، چهار و یا چند سلول میشوند (47). سلولهای بنیادی دارای دو منشاء جنینی و بزرگسالی هستند، سلولهای بنیادی جنینی از توده سلولی داخل3 جنین در مرحله بلاستوسیت به دست میآیند و جزء سلول های پرتوان هستند (76).
دسته دیگر از سلولهای بنیادی، سلولهای بنیادی بالغین هستند. که در بسیاری از ارگانها و بافتهای بدن شناسایی شدهاند، که این بافتها شامل مغز، مغز استخوان، کبد، خون، رگها، ماهیچههای اسکلتی، پوست، پالپ دندان، قلب، قرنیه، لوله گوارش، شبکیه چشم، تخمدان و بیضه هستند. این سلولها در مکان خاصی از هر بافت که جایگاه ویژه سلول بنیادی نامیده میشوند، قرارگرفته اند(93).
اگر چه انواع مختلف سلول بنیادی در یک فرد وجود دارد، اما سلول بنیادی اسپرماتوگونی منحصر به فرد می باشد. چون تنها سلول بدن است که با تقسیم خود میتواند ژنها را به سلولهای فرزندان بعد از خود منتقل نماید (13). بیضه یکی از بافت هایی است که سلول بنیادی بالغ در آن وجود داشته و تکثیر و تمایز آن ها نقش مهمی در تداوم روند اسپرماتوژنیس ایفا می کند(2). سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی،4 (SSCS) بر روی غشای پایه لوله اسپرم ساز در انسان و یا در حیوانی مثل موش بالغ قرار داشته و اساس تولید اسپرم بوده و عمل کرد بیضه هم وابسته به تکثیر و تمایز آنها است (13).
اساس SSCS در توانایی منحصر به فرد آنها برای خود نوزایی و تولید سلولهای تمایز یافته اسپرماتوگونی است، که در نهایت اسپرماتوزوآ را شکل میدهند. این سلولها باسلولهای سرتولی و با اسپرماتوگونیهایی که در حال تمایز هستند ارتباط نزدیکی دارند (46). علت اصلی تنظیم SSCS را میتوان سلولهای ناشی از سرتولی نیز نام برد. زیرا آنها تعامل نزدیکی با اسپرماتوگونی نوع A دارند (46). خودنوزایی SSCS و تمایز و تفکیک آنها در تقویت و حمایت باروری نقش عمدهای را ایفا میکنند (75) . این عمل باعث بقای نسل در جنس مذکر میشود (67).
از آنجایی که سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی، اساس و پایه ساخته شدن اسپرم هستنند، بنابراین باعث شکلگیری اسپرم بالغ در جنس نر می شوند (75). لذا هر گونه اختلال در این فرآیند، منجر به ناباروری خواهد شد (13).
این گونه اختلالات از طریق آسیبهای مختلفی، نظیر سرطان، شیمی درمانی، رادیوتراپی، جهش های ژنتیکی، اثرات منفی ناشی از پیر شدن سلولها و سموم مختلف ایجاد می گردد. آسیب های این چنینی موجب می شود تا تقسیمات میتوزی در برخی از این سلولها متوقف شده و بر روی روند اسپرماتوژنزیس اثر منفی بگذارد و نهایتا باعث گردد تا باروری دچار اختلال شود (64).
اسپرماتوگونی (گونه ای ازسلولهای بنیادی در انسان) :
در داخل لوله های اسپرم ساز، سلول های ژرمینال اولیه (PGC)5 و همچنین سلولهای سرتولی وجود دارند. اندکی پس از بلوغ،PGC به سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی تبدیل شده و اسپرماتوگونی نوعA از مجموعه سلول های بنیادی مشتق می گردد.
اسپرماتوگونی نوعA به دودسته A Pale وA dark تقسیم می شود. سلولهای نوع A dark، سلولهای خاموش یا سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی بوده و تنها در صورت آسیب فعال می شوند. در حالی که سلولهای A Pale تنها قادر به تکثیر و تشکیل سلولهای تمایز یافته می باشند.
سلولهای A dark در ابتدا به سلولهای A Pale تبدیل شده و به دنبال آن، رده های دیگر سلول زاینده تمایز می یابند. پس از تشکیل A pale با تقسیمات میتوزی اسپرماتوگونی نوع B ایجاد شده و این نوع اسپرماتوگونی نیز با آخرین تقسیم میتوزی تبدیل به اسپرماتید اولیه می شوند. سپس با تقسیم اولین مرحله از میوز، اسپرماتوسیتهای ثانویه شکل می گیرند. سپس طی تقسیمات دومین مرحله میوز، این سلولها بلافاصله شروع به تشکیل اسپرماتید می کنند (19).
سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی در موش :
سلولهای اسپرماتوگونی، در موش و رت به سه گروه، نوع A، بینابینی و نوع B تقسیم میشوند. سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی، بر روی غشای پایه لولههای اسپرم ساز عمل تقسیم خود را انجام داده و تمایز نیز پیدا می کنند. پس از هر تقسیم، سلولهای دختری میتوانند هر کدام به صورت جداگانه، خود نوزایی کنند (سلولها AS یا A منفرد) و یا اینکه توسط پل های سیتوپلاسمی به همدیگر متصل شوند. اصطلاحا˝ اسپرماتوگونی جفت،APr نامیده می شوند. این اولین مرحله تمایز سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی است. اسپرماتوگونی APr، زنجیرهای از چهار اسپرماتوگونی به نام Aal4 و در ادامه آن زنجیرهای از Aal8 را شکل می دهند. بعد از نه تا ده بار تقسیم شدن، اسپرماتوسیت ها شکل گرفته و در انتهای این مرحله اسپرماتوگونی نوع B و نهایتا˝ اسپرماتید ها تشکیل می شوند. اسپرماتوگونی های جفت و زنجیرهای کوتاه اسپرماتوگونی نیز دارای خواص سلول بنیادی هستند. مدت زمان تقسیم سلولی اسپرماتوگونی به اسپرماتوزا در موش حدود 35 روز طول می کشد. (32و81) .
تصویر شماره1-1: طرحی از تکثیر اسپرماتوگونی ها و بازسازی سلولهای بنیادی در جوندگان
. تصویرچپ : AS با تشکیل دو سلول منفرد خود. تصویر راست AS : میتواند تفکیک شده وتشکیل AalوAprدهد.
رده سلولی GC1-spg
GC1-spg، اولین رده سلولی تایید شده در بافت بیضه است. این سلولها قادرند پس از پیوند به موش گیرنده بر روی غشای پایه لوله اسپرم ساز آن مستقر شده و شروع به تکثیر و خود نوزایی کنند. سپس در روند تقسیم به اسپرماتوزوئید تبدیل شوند (81). مطالعات نشان می دهد که سلولهای جنسی GC1-spg می توانند از اسپرماتوگونیها به اسپرماتیدها تفکیک شوند. همچنین روند رشد و تکثیر آنها حاکی از آن است که آنها ویژگی های سلولهای بنیادی جنسی را داشته و قادرند در بدن موجود زنده متمایز شوند (96). این رده سلولی، منشا اپیتلیالی داشته و از بیضه موش 10 روزه، گونه BALB/C مشتق می گردد(88).
محیط کشت مناسب برای GC1-spg:
DMEM + 1 Mm Sodium pyruvate + 10 % FBSمحیط کشت مناسبی برای آن میباشد ولی بیشتر با محیط کشت 1640RPMI سازگاری دارد. لذا از محیط کشت دیگری به نام، RPMI 1640 (supplemented with L-Glutamine) + 10% FBS استفاده می شود. شرایط نگهداری آن نیز در دمای °c37، رطوبت نسبی 99% و CO2 5٪ می باشد(62و88).
رده سلولی SFTF-PI43:
این رده سلولی منشاء فیبرو بلاستی داشته و از بافت بیضه جنین دو ماهه گوسفند تهیه می گردد(80).
محیط کشت مناسب برای SFTF-PI43:
RPMI 1640 (supplemented with L-Glutamine) + 10% FBS، محیط کشت مناسبی برای آن بوده و شرایط نگهداری آن نیز دمای °c37، رطوبت نسبی 99% وCO2 5٪ می باشد (89).
ناباروری:
ناباروری یکی از مشکلات شایعی است که حدود 15% افراد جامعه به آن دچارند. اهمیت عوامل محیطی و شغلی و به ویژه عوامل ژنتیکی در آن بسیار موثر می باشد، به طوری که میزان آن در جهان از سال 1995 تا کنون به میزان 50% افزایش یافته است. تقریبا 35% از ناباروری ها، مربوط به مشکلات سیستم تولید مثل در مردان و حدود 35% از ناباروری ها نیز مربوط به مشکلات دستگاه تولید مثل در جنس زن است. همچنین 20% باقی مانده مربوط به مشکلات وضعف های موجود در سیستم تناسلی زن و مرد و10% آن مواردی است که علت آن از نظر پزشکی تاکنون شناخته نشده است (10).
ناباروری در جنس مذکر:
دلایل ناباروری در مردان ممکن است مربوط به سلول های جنسی، اختلالات آناتومی، اختلال هورمونی ،بیماری های عفونی و یا ناهنجاری های ژنتیکی باشد. اختلال در روند اسپرماتوژنز ممکن است با تغییر در شکل حرکت اسپرم یا توان بارور سازی سلولهای جنسی یا تولید آنها همراه باشد، که موجب می شود شانس لقاح کاهش یابد و مرد نابارور محسوب شود. این اختلال شامل تعداد کم اسپرم (اولیگواسپرمی)، شکل غیرطبیعی (تراتواسپرمی) و اختلال در قدرت حرکتی اسپرم (آستنواسپرمی) می باشد. ناهنجاریهای دیگری که می تواند موجب ناباروری گردد، به دستگاه ادراری – تناسلی مربوط می شود.این عوامل شامل نظیر بسته بودن لوله های خروج اسپرم (دفران، اپیدیدیم) به علت مادرزادی، نقص ژنتیکی، عفونت ها یا التهاب های دستگاه تولید مثلی میباشد. همچنین واریکوسل در مردان وناتوانی جنسی و یا انزال زودرس نیز می توانداز عامل ناباروری در مردان به حساب آید (69).
ناباروری در جنس مونث:
بیش از 15 درصد زنان در طول زندگی برای باردار شدن، به مشکلاتی دچار می شوند. اختلال در تخمک گذاری، علت عمده ناباروری در زنان بوده، به طوری که 39% علل ناباروری زنان راشامل می شود. این حالت ممکن است بدلیل نقص در عمل کرد غده هیپوتالاموس و در نتیجه اختلال در تحریک غده هیپوفیز ایجاد شود. مشکلات زنان می تواند ناشی از چندین عامل مختلف باشد. اختلال در تخمک گذاری، اختلال و عفونت (درگردن رحم یا رحم) یا کیفیت نامناسب ترشحات رحم، بسته بودن لوله های رحمی به دلیل عفونت یا آندومتریوز می تواند یکی از دلایل نازایی باشد. آندومتریوز نیز حالتی است که در آن رشد سلولهای سنگفرشی رحم، لوله های رحمی را نیز تحت شعاع قرار می دهد و موجب اختلال در عمل تخمک گذاری می شود. تخمدان پلی کیستیک ( وجود کیست های ریز فراوان در تخمدانها)، بیماریهای التهابی لگن و بیماریهای مقاربتی، فیبروم (نوعی تومور خوش خیم) رحم و یا زائده های داخل رحم و همچنین مشکلات دستگاه ایمنی بدن را می توان از دیگر نمونه هایی از این اختلال برشمرد(20).
عوامل ایجاد کننده ناباروری:
الف- ژنتیکی:
غیر طبیعی بودن سلول های جنسی (تخمک و اسپرم) همگی می تواند به نوعی تحت تاثیر عوامل ژنتیکی باشد. بعضی از عوامل ژنتیکی فقط بر روی باروری مردان تاثیر می گذارند، در حالی که بعضی عوامل دیگر بر روی هر دو جنس و یا فقط بر روی جنس زن تاثیر خواهند داشت. جابجایی های کروموزومی می تواند بر روی مردان و زنان تاثیر بگذارد، اما سندروم کلاین فلتر که در آن ترکیب کروموزوم های جنسی به صورت xxy در می آید تنها مختص مردان و سندروم ترنر که در آن بیمار فقط دارای کروموزوم جنسی x است تنها مختص زنان می باشد. از اختلالات مادرزادی بیضه در مردان می توان کریپتوکیدیسم و هایپوسپدیاس را نام برد (69).
ب- شرایط محیطی:
با صنعتی شدن جوامع و تغییر شیوه زندگی، به مرور زمان بر انواع گوناگون عوامل خطر ساز محیطی افزوده شده است که منجر به بروز اختلالات در ارگانهای مختلف بدن می شود. عوامل محیطی با تاثیر مستقیم بر تمامی بافتهای بدن از جمله بافت تولید مثلی و یا به طور غیر مستقیم از طریق گیرندههای مختلفی که با سیستمهای گوناگون در ارتباط اند تاثیر میگذارند. ترکیبات زیان آوری چون سرب، آب شرب آلوده، آب و خاک کشاورزی آلوده، سموم دفع آفات و کود های شیمیایی، محصولات زراعی آلوده، استفاده از هورمونها، داروهای مختلف در پرورش دام و طیور، مصرف مواد سمی طبیعی، رژیم غذایی نامناسب و کمبود آنتی اکسیدانها، استعمال دخانیات و مشروبات الکلی و تماس با پرتوهای مضر، همه عواملی هستند که ممکن است به طور مستقیم و غیر مستقیم باعث کاهش باروری در انسان شوند (22).
تاثیر سموم بر روی باروری:
در سالهای اخیر، با توجه به رشد و توسعه و صنعتی شدن جوامع، دستیابی به سموم شیمیایی و داروها بسیار آسان گردیده و میزان شیوع مسمومیت ها به طور چشمگیری افزایش یافته است. این سموم در کبد به متابولیتهای فعال تبدیل شده و مقدار زیادی از متابولیتهای آن از بدن دفع میشوند، باقی مانده آنها در بافتهای بدن از جمله در اندامهای جنسی نر ممکن است تاثیر منفی بر جای گذاشته و باعث افزایش ناهنجاری در ساختار اسپرم شوند. از جمله سموم شیمیایی می توان به دیازینون و هینوزان اشاره کرد که موجب کاهش تعداد سلولهای اسپرماتید می شود (7)، همچنین سمومی از قبیل کپون و سم کارباریل باعث آتروفی بافت بیضه و اشکال غیر طبیعی اسپرم می گردند (14). البته باید دانست که اکثر سمومی که برای دفع آفات گیاهان مورد استفاده قرار می گیرند، سنتتیک هستند. در صورتی که سموم غیر شیمیایی، شامل روغنهای گیاهی، عناصر معدنی، اسانس های طبیعی و یا روغن های فرار و همچنین عصاره بعضی از گیاهان که در متابولیت های ثانویه به دست می آیند، جزء سموم سنتتیک نمی باشند (9).
سموم گیاهی:
گیاهان در متابولیسم اولیه خود ترکیباتی را به وجود می آورند که به طور مستقیم در رشد و نمو آنها نقش دارد. ولی در متابولیسم های ثانویه، ترکیباتی تولید می شود که، ممکن است تحت عنوان یک سم طبیعی تلقی گردند. اینگونه متابولیت ها، موجب تسهیل متابولیسم اولیه در گیاهان می شوند. مسیر متابولیکی ثانویه به حفظ تعادل پیچیده گیاهان با محیط زیست کمک میکند. برای مثال میتوان به ویژگی رنگ دادن به گیاه که موجب جذب سایر حشرات در پدیده گرده افشانی می شود، اشاره نمود. با این حال، مسیر متابولیکی ثانویه، برای گیاهان چندان ضروری نیست. نقش کلی متابولیسم ثانویه در گیاهان، بیشتر یک مکانیسم دفاعی در برابر حمله حیوانات و همچنین مبارزه با آفت ها است. نمونه های بسیاری از این گونه متابولیت ها، دارای ترکیبات سمی بوده و ضمن اینکه به عنوان یک سد دفاعی برای گیاه محسوب میشوند، برای بعضی از موجودات دیگر مضر بوده و یا باعث یک سری عوارض نا خواسته در آنها میگردند. بعضا مشاهده می گردد که اینگونه مواد و یا متابولیت های ثانویه، در چرخه زندگی حیوانات مختلف و یا انسان قرار گرفته و با ورود به داخل بدن حیوان و یا انسان، عوارضی را به دنبال داشته باشد. لذا اشکال و نمونه های بسیاری از اینگونه متابولیت ها در طبیعت وجود دارند که می توان به مواردی چون، فلاونوئیدها6، آلکالوئیدها7، ترپنوئید8ها، آتروپین9، فیتیک اسید10، فیتوستوژن11، کارتنوئید12 ها و گوسیپول13، اشاره نمود (16و86.).
تصویر شماره2-1: گیاه پنبه دانه
گوسیپول :
عده ای از محققین چینی متوجه شدند که به صورت اتفاقی، بین سالهای 1930 تا 1940، در یکی از مناطق روستایی کشور چین، به نام جیانگسو14، هیچ کودکی متولد نشده است. در صورتی که، روستائیان این منطقه، قبل و بعد از این دوره، مشکل خاصی مبنی بر ناباروری نداشتند (17). لذا توجه دانشمندان به این مساله معطوف گردید که باید علت خاصی برای آن وجود داشته باشد. یافتهها حاکی از آن است که این مشکل در افرادی که از روغن تخم پنبه دانه، همراه با ذرات گیاه مربوط به آن استفاده میکردند، بیشتر بوده است. لذا محققین، کاهش باروری در ساکنین این ناحیه، مخصوصا مردان را ناشی از استفاده بی رویه از روغن تخم پنبه دانه و تصفیه نشده، دانستند (5). در سال 1900 نیز این مشکل در حیوانات مشاهده گردید. بدین نحو که با مصرف بیش از حد محصولات پنبه دانه توسط حیوانات نشخوار کننده و غیر نشخوار کننده نشانههایی از مسمومیت از جمله تنگی نفس، کاهش میزان رشد و بی اشتهایی در آنها دیده شد (65).
بررسیهای انجام شده نشان داد که در گیاه پنبه دانه، مادهای شیمیایی خاصی وجود دارد که با مصرف زیاد آن، باعث مسمومیت در حیوانات و انسان میگردد (12، 1، 36، 48). پنبه دانه یک گیاه فیبری است که محصول همیشگی مناطق گرمسیری می باشد. این گیاه اصولا در آب و هوای خشک در دمای بین 11 و 25 درجه سانتی گراد در چین، هند، آمریکای شمالی و جنوبی، آفریقا، ترکیه و یونان رشد می کند. تولید سالانه جهانی پنبه در سالهای 2007 و 2008 در حدود 106×46 تن از 35 میلیون هکتار می باشد. در جمهوری مردمی چین و هندوستان، حدود 23% تا 31 % مصرف جهانی پنبه تولید می گردد. لازم به ذکر است که این محصول مهم در ایالات متحده آمریکا ، پاکستان، ازبکستان و برزیل به عنوان یک ثروت ملی به شمار می آید. مقادیر بسیار اندک پنبه نیز در اسپانیا و بلغارستان تولید می شود (78).
این گیاه در حدود 45% دارای پوسته و الیاف کوتاهی است که به تخم پنبه دانه چسبیده است. 55% این گیاه را مغز آن تشکیل میدهد .پتاسیم و فسفر دو ماده موجود در مغز پنبه دانه هستند. حدود %10 (1/0 الی 100 گرم بر کیلو گرم) از مغز آن را عمده ترین رنگدانه آن یعنی گوسیپول تشکیل میدهد (83). کنجاله پنبه دانه در حقیقت پس مانده روغن پنبه است که بعد از استخراج روغن، باقی می ماند و محدودیت استفاده از آن به خاطر وجود ماده سمی خاصی به نام گوسیپول می باشد. رنگ گوسیپول زرد طلایی بوده و غلظت آن، نسبت به 14 رنگدانه دیگر موجود در غده گیاه پنبه دانه بیشتر است (12 و 6). گونه های مختلفی از این گیاه از جمله، Gossypium barbadense در آمریکای جنوبی،Gossypium arboretum در هند، Gossypium hirsutum درآمریکای مرکزی و Gossypium herbaceu در آسیا و آفریقا رشد پیدا می کنند. این رنگدانه سمی طبیعی در گیاه پنبه دانه از خانواده Malvaceae به شمار می آید (36).
گوسپیول یک ترکیب آلدئیدی پلی فنلی بوده و دارای فرمول می باشد (36، 8 ، 30،). این ترکیب بلورین به شدت زرد رنگ بوده و غیر قابل حل در آب و قابل حل در حلالهای آلی و روغنی است. از آنجایی که گوسیپول به محیط قلیایی حساس است، لذا در روند تصفیه از بین می رود. ازاین رو در بین حلالهای آلی، استیک اسید نسبت به سایر حلالها قابلیت انحلال پذیری بهتری دارد و از آن به عنوان ملح گوسیپول یاد میشود(39).گوسیپول دارای وزن مولکولی 54/518 و ساختار شیمیایی بی نفتالین – دی کربوکسیل آلدهید- – 7,7 هگزا هیدروکسی- دی ا یزوپروپیل دی متیل است (74، و41). این ماده در سال 1958 توسط ادوارد سنتز شد (35).
تصویر شماره 3-1: ساختار گوسیپول
گوسیپول علاوه بر داشتن شکل آلدئیدی، دو شکل توتومری دیگر یعنی همی استال و کتونوئیدی نیز برای واکنشهای شیمیایی دارد (15).
این ماده به دو شکل آزاد و ترکیبی وجود داشته و در داخل تخم پنبه دانه، تقریبا به شکل آزاد قرار دارد. در طی عمل فرآوری تخم پنبه دانه، گوسیپول به علت وجود عامل آلدئیدی ، آمادگی زیادی برای واکنش با عامل آمین در پروتئین ها داشته و با آن باند می شود. این واکنش با ایجاد رنگ قهوهای حاصل از روغن کشی از پنبه دانه همراه است (10).
گوسیپول در شکل باند شده خود، خاصیت سمی ندارد. زیرا جذب آن در لوله های گوارش پایین است . هر چند بعضی از تحقیقات نشان داده که گوسیپول باند شده نیز ممکن است در طی عمل هضم رها شده و با جذب در لوله های گوارشی، به گوسیپول سمی تبدیل شود. این پیگمانتاسیون به طور طبیعی به دو شکل انانتیومر، (+) و (-) وجود دارد که فعالیت بیولوژیکی بالایی داشته و برای مدت زمان بیشتری در بدن باقی می مانند. فعالیت بیولوژیکی ایزومر (-) و میزان آن در تخم پنبه در مقایسه با نوع (+) بیشتر است (42،39 ). غلظت گوسیپول تحت تاثیر روش استخراج روغن آن میباشد. در این روش که شامل پرس کردن و روغن کشی از طریق حلال به شکل مستقیم می باشد، میزان دما، فشار و حرارت متفاوت است. روش جدید استخراج روغن از گیاه پنبه دانه، از طریق استخراج حلال به شکل مستقیم بوده که به روش شیمیایی معروف است. در این روش، محصول بیشتری تولید میشود که با صرفه تر است و سریعتر هم انجام می پذیرد. روش دیگری نیز برای استخراج روغن از گیاه پنبه دانه، بدون استفاده از حلال صورت می پذیرد که به استخراج فیزیکی معروف است. در این روش، روغن گیاه را با روش های مکانیکی مثل فشردن، استخراج می نمایند و معمولاً نیز برای تهیه روغن های خوراکی استفاده می شود .امروزه سعی می شود که گوسیپول در طی عمل فرآوری تخم پنبه از محصولات پروتئینی آن جدا گردد(8) .متخصصان ژنتیک نیز تلاش کردند که با دست کاری ژنتیکی گیاه پنبه، بدون گوسیپول تولید کنند. ولی از آنجایی که فقدان گوسیپول در گیاه پنبه دانه، سیستم دفاعی آن را نسبت به آفتها از بین می برد و از نظر تجاری این مساله باعث لطمه زدن به زمین های زیر کشت این گیاه می شود، لذا این کار امکان پذیر نمی باشد (16).
بررسی تاثیرات گوسیپول بر روی حیوانات و انسان:
امروزه پنبه دانه به دلیل داشتن کیفیت بسیار بالا و اینکه 40% آن را پروتئین تشکیل میدهد، و همچنین قیمت مناسب آن، سهم بسزایی در جیره غذایی (مکمل غذایی ) جانوران و علی الخصوص نشخوار کنندگان داشته که به صورت کنترل شده مورد استفاده قرارمی گیرد(18).
سمیت عمومی:
علائم عمومی سمیت گوسیپول در جانوران، به صورت تنگی نفس، بی اشتهایی، ضعف و بی حالی مشاهده می شود. سمیت حاد مربوط به آن نیز در قلب، شش، کبد و سلولهای خونی گزارش شده است. همچنین، دوز بالای آن باعث شکسته شدن گلبولهای قرمز می شود. یافته های کالبد شکافی نیز حاکی از ورم بافتی، احتقان ریه و کبد، جمع شدن مایع در بافتهای بدن و نقصان در قلب می باشد. اثر سمیت آن بر روی دستگاه تناسلی و تولید مثل، نیز بیشتر متوجه نرها بوده و بر اساس میزان و مدت زمان مصرف، باعث کاهش در حرکت و تعداد اسپرم، اختلال در فرایند اسپرماتوژنزیس می گردد(34). تحقیقات دیگری نیز موید همین موضوع است که یکی از علائم شگرف مسمومیت گوسیپول، در اثر مصرف بالای آن می تواند باشد. گرچه گوسیپول دارای خاصیت ضد باروری است، ولی تحقیقات زیادی اشاره به این دارد که، به علت ایجاد اختلال در روند اسپرماتوژنزیس، باعث کاهش تعداد اسپرم می شود(15؛ 65). همچنین تاثیر بر روی میتوکندری سلولهای سرتولی (54)، ایجاد واکوئلهای سیتوپلاسمی (97)، کاهش انتقال اسپرم در داخل اپیدیدیم (37) از جمله مواردی است که دربعضی از حیوانات نشخوارکننده و جوندگان گزارش شده است. البته باید در نظر داشت که گوسیپول در جنس نر بیشتر موثر بوده و در واقع وابسته به میزان مصرف و مدت زمان سپری شده می باشد (65). در جنس ماده غیر نشخوار کننده نیز به مانند جنس نر، مصرف زیاد این ماده باعث ناباروری می شود. در صورتیکه جنس ماده نشخوار کننده نسبت به تاثیر ضد باروری گوسیپول مقاومتر است. همچنین ممکن است گوسیپول، باروری و رشد اولیه جنین را در جانوران تک معده ایی ( غیر نشخوار کننده ) مختل نماید (65).
اثر گوسیپول بر روی حیوانات:
1) نشخوار کنندگان :
الف) گاو: در سال 2004 ،عده ای از محققین، به بررسی دستگاه تولید مثلی گاوهای نر یازده ماههای پرداختند که در طی 56 روز از پنبه دانه به عنوان جیره غذایی ( یعنی معادل 8 میلی گرم بر کیلوگرم گوسیپول آزاد بر وزن بدن) استفاده کردند. بعد از گذشت 28 و 56 روز، ساختار کیسه بیضه و همچنین مایع منی آنها برای تعیین میزان حرکت و مورفولوژی اسپرم، مورد ارزیابی قرار گرفت. در ادامه، به مدت 210 روز رژیم غذایی فاقد گوسیپول مصرف کردند. اگرچه پس ازگذشت 4 هفته از انجام آزمایش، هنوز ناهنجاری های اسپرم کم و بیش مشاهده میشد ولی این تفاوت نسبت به گروه کنترل تفاوت چندانی نداشت. آنان دریافتندکه اثر زیان آور گوسیپول بر روی ویژگی های مورفولوژیک اسپرم در این حیوانات، برگشت پذیر است (43). برای جلوگیری از علائم بالینی ناشی از گوسیپول در نشخوار کنندگان، میزان حداکثر دوزی که جانور میتواند تغذیه کند، نباید از 5/0% وزن بدن آن در هر روز برای گاوهای بالغ و33/0% وزن بدن برای گوساله های جوان باشد. گوسیپول آزاد نیز برروی حیوانات تک معده ای (غیر نشخوار کننده)، اثر سمی بیشتری دارد و استفاده ازاین ماده در رژیم های غذایی آنها باید با احتیاط لازم انجام پذیرد(18). حیواناتی مثل گاو و گوسفند، بعد از سن بلوغ، به دلیل باند شدن گوسیپول با پروتئین های آزاد در داخل شکم خود قادر به تحمل مقدار بیشتری از این ماده در قیاس با تک معده ای ها میباشند(1). دستگاه گوارش گوساله و بره ها با وجود اینکه ساختار آناتومیکی لازم را دارد، ولی به دلیل اینکه هنوز شرایط فیزیولوژیکی آن فراهم نگردیده، لذا به این ماده حساس ترند و تنها از سن 4 تا 10 ماهگی به بعد، قادر به تحمل بیشتری از این سم می باشند (18).
ب) گوسفند: در یک مطالعه، بره های نر 6 هفتهای، به مدت 62 روز از رژیم غذایی که شامل، 15% و یا 30% پنبه دانه بوده است، تغذیه کردند. این میزان، معادل 360 میلی گرم در هر کیلوگرم و یا به طور طبیعی، به ترتیب، معادل تقریبا 5/2 و 5 میلی گرم گوسیپول آزاد در هر کیلوگرم وزن بدن در هر روز بر آورد شده است، که هیچ تاثیر سوئی بر روی سلامت بالینی آنها نداشت (45). بعضی از محققین دیگر نیز در یافتند که اگر بره های 48 روزه، یک رژیم غذایی شامل،10%،20% و یا 30% از پنبه دانه کامل دریافت کنند (معادل تغذیه 6،5/12، 20 میلی گرم گوسیپول آزاد در هر کیلوگرم از وزن بدن به صورت روزانه) میزان مصرف چربی روده در بالاترین سطح خود به طور چشمگیری افزایش یافته و غلظت اوره در پلاسما خون نیز بیشتر می شود مطالعه دیگر ی نیز حاکی از آن بوده است که، در سطح 2، 3 و 5 و یا 9، 16و 26 میلی گرم گوسیپول آزاد در روزهای 19و 30، در بعضی از حیوانات، با تنگی نفس و یا گاهی اوقات با مرگ ناگهانی همراه بوده است(56).
2) غیر نشخوارکنندگان:
الف) خوک: یکی از مطالعاتی که در سال 2004، انجام گرفت، محققین، به میزان 146، 206 و 348 میلی گرم گوسیپول به میزان هر کیلوگرم وزن بدن، در داخل جیره غذایی خوک ها قرار داده و با گروه کنترل که هیچ گونه گوسیپولی دریافت نکرده بودند، مقایسه کردند. خوکهای نابالغ و در حال رشد که وزن آنها حدود 20-24 کیلوگرم بود، با مصرف گوسیپول در غلظت های پایین به وزنی حدود 75 کیلوگرم رسیدند. ولی خوکهایی که گوسیپول را در دوز بالا دریافت کرده بودند، دچار کاهش وزن شده و به وزن طبیعی خود دست نیافتند. همچنین مشاهده گردید که با مصرف گوسیپول، وزن کبد و قلب نیز بطور چشمگیری مخصوصا در دوز بالا افزایش می یابد(38). کلاسون واسمیت نیز از جمله محققینی بودند که در سال 1966، بر روی خوکهای نابالغی که وزنشان در ابتدای آزمایش حدود 25 کیلوگرم بود، مطالعاتی انجام دادند که در آن میزان گوسیپول در وعده های غذایی آنها، 80، 244 و 400 میلی گرم برکیلوگرم تخمین زده شد. به دنبال این جیره غذایی، وزن خوکها به 100 کیلوگرم افزایش یافت. مشاهده شد که از روز 37 به بعد، چندین خوک در طول آزمایش مردند و این در حالی بود، که تا غلظت 80 میلی گرم بر کیلوگرم گوسیپول در رژیم غذایی خوکها، اثرات نامطلوبی برای آنها به همراه نداشت. برجسته ترین علائم مسمومیت توسط مصرف بالای این ماده تنگی نفس، رنگ بنفش بینی و گوش ها بودند. با توجه به اینکه گوسیپول با عنصر آهن، کمپلمانی را تشکیل می دهد که تا حدودی موجب کاهش سمیت گوسیپول کنجاله پنبه دانه می گردد. لذا این محققین برای کاهش تاثیر سوء آن در اثر مصرف بالای گوسیپول، پیشنهاد کردند تا در رژیم غذایی حیوانات، مکملی از ترکیبات آهن نیز قرار داده شود (29).
ب) خرگوش: بعضی از محققین، تاثیر گوسیپول را بر روی کیفیت منی ،چرخه تستوسترون و باروری، در خرگوش های نر هلندی مورد مطالعه قرار دادند. میزان مصرف 80،40،20 میلی گرم برکیلو گرم گوسیپول در روزهای 35 و 48 بعد از مصرف، بی اشتهایی و مشکلات تنفسی و گاهی اوقات نیز از کار افتادن قلب را به همراه داشت. خرگوش هایی که از 10 میلی گرم برکیلوگرم گوسیپول تغذیه می کردند، دامنه بقای آنها بین 77 تا 250 روز بود. علاوه بر مسمومیت های ذکر شده، نمونه هایی از منی آنها نیز مورد ارزیابی قرار گرفت که تغییری در مورفولوژی، تعداد و حرکت اسپرم مشاهده نشد. مقدار مصرف 10 میلی گرم برکیلوگرم گوسیپول بیشتر از 35 هفته نتوانست بر روی باروری موثر باشد (68 ). برخی از پژوهشگران نیز در سال 2008 تحقیقاتی را بر روی خرگوش های سفید نیوزلندی که از غلظت های 4 و 20 میلی گرم برکیلو گرم گوسیپول برای 8 هفته تغذیه کرده بودند، انجام دادند. در این تحقیق، پارامترهای شیمیایی خاصی از جمله پروتئین، آلبومین، کلسترول، آنزیم لاکتات دهیدروژناز15 و آلانین آمینو ترانسفراز16 و غلظت +NA به+ K، در پلاسمای مایع منی بررسی شد. نتایج حاکی از آن بود، که گوسیپول در هر دو دوز کم و زیاد خود بر روی پارامترهای اسپرم، تاثیر سوء داشته است. همچنین مشاهده کردند که بعد از حذف گوسیپول از جیره غذایی آنها، با گذشت زمان، پارامترهای اسپرم به حالت طبیعی خود نزدیک شده است ) 25 (.
ج) سگ: یوزال مطالعه ای را بر روی شش سگ که بعد از خوردن تصادفی پوسته پنبه دانه مرده بودند، انجام دادو دریافت که این جاندارن، قبل از مرگ هیچگونه علائم بالینی خاصی نداشتند. نتایج بررسی های هیستوپاتولوژیک انجام شده بر روی آنها، ورم شدید ریوی، احتقان مزمن قلب و کلیه را نشان داد. در بررسی هایی که توسط میکروسکوپ الکترونی انجام پذیرفت، اختلال در میوفیبریل عضله قلب و متراکم شدن کروماتین واختلال در عملکرد میتوکندری گزارش گردید. مصرف پوسته پنبه دانه توسط این جانوران شامل 1600میلی گرم بر کیلوگرم گوسیپول آزاد بود که در محتویات معده مشاهده شد (80).
د) ماهی: در یک رژیم غذایی، گوسیپول به عنوان یک مکمل غذایی و با دوزهای صفر ،300، 600، 900 ، 1200، 1500 میلی گرم بر کیلوگرم برای 2 بار در طول روز و به مدت 12 هفته به گربه ماهی داده شد. این ماده موجب افزایش رطوبت و وزن نهایی ماهی گردید که با غلظت گوسیپول رابطه عکس داشت. این در حالی است که لیپید وپروتئین های بدن وتعداد گلبول قرمز خون با افزایش جذب گوسیپول در وعده غذایی کاهش یافته بود(95) . مطالعاتی که به بررسی اثر گوسیپول برروی اسپرم ماهی خاردار در آزمایشگاه صورت گرفت حاکی از آن بود که افزایش غلظت گوسیپول در رژیم های شامل پنبه دانه و در محیطهای آبی (که به عنوان بارورکننده آلی در مخزنهای پرورش به کار میرود) بر روی باروری ماهی های نر خاردار زرد (پرچ زرد) تاثیر گذار بوده و کاهش باروری را به همراه داشته است. در حالی که این تاثیر پذیری و عدم باروری تا حدودی برگشت پذیر بوده و به غلظت گوسیپول بستگی دارد (28).
جدیدترین یافته ها از اثرات گوسیپول :
با توجه به مطالعات اخیر انجام شده در این زمینه، یافتهها نشان می دهند که گوسیپول دارای فعالیت ضد تکثیری بر روی سلولهای تومری است. عقیده بر این است که میتواند به عنوان یک عامل ضد سرطانی نیز عمل کند. علت آن هم وجود حلقه فنولی در گوسیپول است که به آن خاصیت آنتی اکسیدانی میدهد (74 ، 83 ،20، 48 ، 34).در برخی از مقالات نیز به خاصیت ضد ویروسی گوسیپول نیز اشاره شده است. گزارشات حاکی از آن است که گوسیپول میتواند در محیط آزمایشگاهی، ویروس HIV را غیر فعال کند (64، 23). علاوه بر ویژگیهای یاد شده، گوسیپول میتواند به عنوان عامل ضد باروری در مردان عمل نماید (54).
تاثیر گوسیپول بر روی انسان:
علاوه بر تحقیقات وسیعی که بر روی حیوانات مختلف صورت پذیرفته است، عده زیادی از محققین، تاثیر آن را بر روی انسانها نیز مورد ارزیابی قرار داده اند. همچنان که قبلا اشاره شد، بعضی از دانشمندان چینی دریافتند که در منطقه استان های هیوبی17 و هبی18، کشاورزان روستا نشین، در اثر مصرف زیاد روغن پنبه دانه، دچار خستگی مفرطی می شوند(18). همچنین، مطالعات وسیعی که بر روی 8000 مرد چینی که از گوسیپول به عنوان یک عامل ضد باروری استفاده می کردند، حاکی از تاثیر دراز مدت آن بوده است. البته در اینگونه افراد، به جزء کاهش پتاسیم که تنها در 10% افراد دیده شده، هیچگونه تغییری در مارکرهای خونی و یا تغییر در میزان فشار خون آنها دیده نشد. در آزمایشهای دیگری نیز مصرف گوسیپول در دوز پایین به عنوان یک عامل ضد باروری در مردان مورد بررسی قرار گرفت که در 151 نفر افراد تحت آزمایش،81 نفر آنها دچار اختلال در روند اسپرماتوژنزیس شده بودند، البته پس از پایان آزمایش، باروری آنها به تدریج در حال بر گشت بود (30).
کشت سلول:
سلول هایی که از بافت حیوانی جدا میشوند، اگر با مواد غذایی و فاکتورهای رشد همراه گردند به رشد خود در شرایط آزمایشگاه ادامه میدهند،این فرآیند راکشت سلول می نامند. کشت سلول دلالت بر این داردکه بافت یا تکه رشد کرده حاصل از اکسپلنت اولیه به سوسپانسیون سلولی تفکیک شده (به صورت مکانیکی یا آنزیمی) و سپس این سوسپانسیون سلولی را میتوان به صورت یک لایه چسبیده بر روی بستر جامد یا به صورت شناور در داخل یک محیط مخصوص، کشت داد (40و3).
امروزه، فناوری کشت سلول حیوانی در زمینههایی چون تحقیق بر روی مسیرهای متابولیکی با به کار بردن پیش مادههای نشاندار، تولید بافت های مصنوعی به وسیله ترکیبات ویژه از سلولها، ایجاد محصولات بیولوژیکی با ارزش و آزمایش ترکیبات سرطان زا و یا بررسی سمیت بر روی رده های سلولی مختلف، بسیار گسترده شده است. آزمایش ها جهت بررسی سمیت سلولی در حالت invitro ساده تر بوده و به دلیل قابلیت تکرار پذیری آن، بسیار مقرون به صرفه است و برای ارزیابی جنبه های اساسی بیولوژیک مخصوصا برای سازگاری نسجی، مناسب می باشد(3).
پیشینه تحقیق:
تحقیقات انجام شده در خصوص گوسیپول
در سال 2011، یکی از محققین به نام Jiahung، به بررسی فعالیتهای ضد سرطانی گوسیپول پرداخت. او بیان داشت که گوسیپول از طریق تنظیم پروتئین های تنظیم کننده چرخه سلولی، از رشد سلولهای سرطانی پروستات در انسان جلوگیری کرده و تاثیر بالقوهای در درمان سرطان پروستات دارد (44).
در سال 2010 نیز Chang و همکارانش در تحقیق خود تحت عنوان تاثیر ترکیبی (هم افزایی) گوسیپول با دوز پایین و به همراه هورمون استروئیدی، در مرحله میتوزی اسپرم، در رت پرداختند. نتایج حاکی از آن بود که در رژیمهای ترکیبی، مراحل تقسیم میتوز برای تشکیل اسپرم در موشهای صحرایی متوقف شده و اسپرماتوگونی نوع A کاهش می یابد (25).
در سالهای اخیر مطالعات گسترده ای در زمینه تاثیر گوسیپول برای باز داری از تکثیر سلولهای سرطانی مختلف انجام شده است. یکی از این مطالعات را LU وهمکارانش در سال 2008 انجام دادند، که به بررسی اثر گوسیپول استیک اسید بر روی تکثیر رده سلولی سرطانی CNE2، بینی و گلوی انسان پرداختند. آنها دریافتند که19GAA از تکثیر سلولهای سرطانی CNE2 جلوگیری میکند و موجب آپوپتوز سلولها می گردد. همچنین به این مطلب اشاره داشتند که مکانیزم آن ممکن است به تنظیم بیان ژنBCL-2 ارتباط داشته باشد (52).
عده ای از محققین در سال 2007، دو گروه موشهای سفید صحرایی را تحت رژیم غذایی روزانه گوسیپول با متیل تستوسترون و همچنین گوسیپول با اتیل استرادیول قرار دادند. سپس سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی آنها را در داخل بافت بیضه گروهی از موشهای گیرنده پیوند زده و نتایج آن را با گروه کنترل و همچنین گروهی از موشها، که تنها گوسیپول را در رژیم غذایی خود داشتند، مقایسه کردند. نتایج حاکی از آن بود که تستوسترون و استرادیول نقش حمایتی داشته، لذا تاثیر خاصی بر روی پارامترهای اسپرم و روند اسپرماتوژنزیس نداشتند. اما در گروهی که تنها گوسیپول را دریافت کرده بودند، نتایج نشان دهنده کاهش پارامترهای اسپرم و نقص در رونداسپرماتوژنزیس بوده است ( 30).
در سال 2006، محققی به نام Falonide Andrade وهمکارانش در بررسی موشهایی که از دوران نوزادی تا بلوغ در معرض گوسیپول قرار گرفته بودند، مشاهده نمودند که گوسیپول باعث اختلال در ساختار و عملکرد اپیدیدیم می شود. همچنین حرکت اسپرم را متوقف ساخته و تعداد آن نیز کاهش پیدا می کند (37).
در سال 2005، امینی و کامکار طی پژوهشی به بررسی اثر گوسیپول بر روی اسپرماتوژنزیس در موشهای NMRI پرداختند و مشاهده کردند که گوسیپول استیک اسید باعث کم شدن تعداد اسپرم و کاهش وزن اپیدیدیم و تغییر در ساختار بافتی بیضه میگردد (15).
در سال 2003، محققین چینی به بررسی کانالهای یونی در غشای اسپرم انسان پرداختند و چندین نوع کانال نفوذپذیر را شناسایی کردند. آنها تاثیر گوسیپول و چندین ترکیب جدا شده از گونهTripterygium wilfordii را روی کانالهای کلسیم مورد مطالعه قرار داده و عنوان کردند که گوسیپول می تواند موجب مهار کانالهای کلسیمی شود. لذا امکان اینکه یکی از مکانیسمهای ضد باروری گوسیپول، ناشی از مهار کانالهای یونی کلسیم باشد، چندان بعید نیست (51).
وانگ و همکارانش نیز در سال 2000 در مورد مکانیسم تاثیر گوسیپول بر روی رده های سلولی سرطانی روده بزرگ به تحقیق پرداختند. آنها دریافتند که گوسیپول از شکل گیری کلونی سلولهای توموری جلوگیری میکند. همچنین مشاهده کردند که DNA نوکلئوزوم ، در سلولهای آغشته به گوسیپول دچار شکستگی شده که با پدیده آپوپتوزی سلولها نیز همراه بوده است (84 ) .
Monses و همکارانش طی تحقیقی در سال 1998 به بررسی تاثیر گوسیپول بر روی عمل کرد ترشحی سلولهای سرتولی کشت داده شده پرداختند. آنها مشاهده کردند که گوسیپول باعث از بین رفتن سلولهای سرتولی و کاهش حیات این سلولها می شود (54). در مطالعه ای که توسط Zuang و همکارانش در سال 1983 انجام پذیرفت، به بررسی تاثیرات گوسیپول بر روی سلولهای سرتولی و لایدیگ موش صحرایی در کشت اولیه و ردههای سلولی مشتق شده از آنها پرداختند. در این بررسی نیز تغییرات چشمگیری در مورفولوژی سلولهای سرتولی با ایجاد واکوئولهای بزرگ ودانههای متراکم در سیتوپلاسم آنها بعد از گذشت 5 روز از آغشته شدن به گوسیپول مشاهده گردید. اما هیچ تغییری در بقای سلولی و مرفولوژی لایدیگ و تولید تستوسترون مشاهده نشد. ولی با افزایش غلظت گوسیپول، تعداد اسپرم ها کاهش پیدا کرد (97). با توجه به مطالعات انجام شده و نظر به اینکه ممکن است گوسیپول به عنوان یک سم طبیعی، بر روی سلول های بنیادی تاثیر گذاشته و لاجرم به رده های بعدی سلولها انتقال می یابد، لذا در این تحقیق بر آن شدیم تا اثر سمی گوسیپول استیک اسید را بر روی دو رد ه سلولی GC1-spg (مربوط به حیوان غیر نشخوار کننده) و SFTF-PI43 (مربوط به حیوان نشخوار کننده) بررسی نماییم.
فصل دوم
مواد و روشها
تهیه رده های سلولی:
برای انجام آزمایش و تاثیر گوسیپول بر روی سلول های بنیادی، دو رده سلولی SFTF-PI43 و GS1-spg از بانک سلولی انستیتو پاستور ایران تهیه گردید. رده های سلولی تهیه شده تحت شرایط اپتیموم و رعایت استاندارد، با استفاده از فلاسک مخصوص به مرکز سلولی و مولکولی دانشگاه علوم پزشکی بابل انتقال داده شدند.
شرایط نگهداری رده های سلولی :
برای جلوگیری از هرگونه آلودگی، رده های سلولی در داخل انکوباتور قرار گرفتند. قبل از قرار گیری سلول ها در داخل انکوباتور، محیط کشت اضافی داخل فلاسک ها خارج گردیده و در شرایط انکوباسیون نگهداری شدند. از محیط کشت اضافی برای ادامه کشت رده های سلولی تا رسیدن به یک شرایط مطلوب استفاده گردید. بعد از گذشت حدود دو روز، از محیط RPMI-1640 (محیط کشت کامل)، جهت ادامه کشت، استفاده شد.
RPMI-1640:
این محیط کشت، شامل مقادیر زیادی از آمینو اسید ها، ویتامین ها و قند های ضروری است، که به صورت یک محلول بافری بیکربنات موجود است. RPMI-1640به عنوان یک محیط کشت استاندارد جهت رشد و تکثیر رده های مختلف سلولی از نوع انسانی و حیوانی مورد استفاده قرار می گیرد در این آزمایش RPMI-1640 از شرکت ( , A15-840 PAA, Astrulia) خریداری شد (87).
سرم جنینی گاو (FBS):
FBS یا FCS بخشی از پلاسمای خونی است که پس از انعقاد آن باقی می ماند. در طی این فرآیند، پروتئین پلاسمایی فیبرینوژن تبدیل به فیبرین شده و در لخته خون باقی می ماند. FBS از سیستم جریان خون بسته سیاهرگی جنین گاو تهیه می شود. این سرم پر مصرف ترین نوع سرم در کشت سلولی است. چون میزان آنتی بادی های آن در پایین ترین سطح خود قرار داشته و میزان فاکتور های رشد آن نیز بسیار زیاد است، لذا انعطاف پذیری لازم را برای استفاده در زمینه های مختلف را به آن می دهد. پروتئین های گلوبولار و آلبومین سرم گاوی (BSA)، اصلی ترین ترکیبات FBS را تشکیل می دهند. محیط غنی از پروتئین در FBS باعث حفظ و دوام سلول های کشت شده و باعث افزایش رشد، تقسیم و بقاء سلول ها می گردد. سرم جنینی گاو در این سری آزمایشات از شرکت(, A15_104 PAA, Astrulia ( خریداری گردید (90).
PBS:
PBS یک محلول نمکی، شامل سدیم کلراید و سدیم فسفات است. نوع دیگر آن با فرمول، پتاسیم کلراید و پتاسیم فسفات نیز قابل استفاده است. این بافر موجب حفظ pH محیط می گردد. اسمولاریته وغلظت یونی این محلول برای سلول های پستانداران کاملاً مناسب بوده و یک محیط ایزوتونیک را برای آنها فراهم می سازد. PBS، یک محلول غیر سمی است و کاربردهای متعددی در آزمایش کشت سلولی دارد. یکی از موارد استفاده آن، شستشو و یا حذف عوامل باقیمانده از محیط کشت سلولی است. . از PBS نیزمی توان برای رقیق نمودن مواد استفاده کرد(91).
فرمول ساخت PBS (یک لیتر):
8 gr NaCL + 0.2gr KCL + 1.44gr Na2 HPO4 + 0.24 gr KH2 PO4باید در ml800 آب مقطر حل گردد. PH آن را به کمک HCL و یا NaOH 0.1 N)) به 4/7 می رسانیم، سپس تا ml200 دیگر آب مقطر اضافه کرده تا حجم نهایی به یک لیتر برسد
Pen Strep:
برای کاهش خطر آلودگی های باکتریایی به محیط کشت آنتیبیوتیک اضافه میگردد. آنتیبیوتیکی که انتخاب میشود، باید فاقد اثرات سمی برای سلول کشت شده باشد. در صورت مشاهده آلودگی بسته به نوع آن، آنتیبیوتیک انتخاب میشود . غلضت بهینه آنتیبیوتیکها بطور تجربی تعیین میگردد. Pen Strep به مخلوط پنی سیلین و استرپتومایسین گفته میشود. این ماده یک ترکیب آنتی بیوتیکی قوی و استاندارد است که جهت مقابله با انواع باکتری های گرم مثبت و گرم منفی به کار رفته، ولی در مقابله با قارچ ها بی اثر هستند PAA-Australia, A11-504))) 40 و 3 (.
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) :
یک ترکیب شیمیایی، با فرمول(CH3)2SO می باشد. این ماده یک محلول بی رنگ بوده و در واقع یک حلال قوی محسوب می شود. ترکیبات قطبی و غیرقطبی را حل نموده و همانند آب، در یک طیف وسیعی با حلال های ارگانیک، قابل ترکیب است. این ترکیب کاربردهای متعددی در پزشکی، شیمی و علم ژنتیک داشته و نیز می توان آن را به عنوان ضد یخ، به محیط کشت سلول ها اضافه کرد. البته مقادیر بالای آن سمی است و می بایست حدوداً 10٪ حجم ماده ای را تشکیل دهد که برای فریز کردن آماده گردیده است. خریداری شده از (SIGMA -Aldrich, Germany) (63،87) .
Trypsin EDTA :
EDTA محلولی است که برای کشت سلول، جهت جدا کردن آنها ها از یکدیگر و یا برداشتن آنها از کف فلاسک مخصوص به خود، کاربرد دارد. تریپسین باعث می گردد تا اتصالات پروتئینی بین غشاء سلولی از بین رفته و سلول ها از یکدیگر جدا شوند. EDTA نیز با کلسیم موجود در محیط کشت، واکنش داده و از طریق عملکرد اینتگرین ها باعث از هم گسیختن اتصالات سلولی می شود. غلظت های مختلفی از این دو ترکیب بسته به نوع رده سلولی مورد استفاده قرار می گیرند. در این تحقیق برای انجام آزمایش های مختلف از محلول 0.25% Trypsin EDTA با فرمول ((Trypsin/EDTA, 0.25%,0.1% استفاده شده است. خریداری شده از (GIBCO,GERMANY,15400) (3).
Trypan blue stain:
تریپان بلو، یک رنگ اسیدی با زمینه آبی است که در رنگ آمیزی حیاتی بافت های مختلف به منظور محاسبه ی تعداد سلول های زنده در یک جمعیت سلولی به کار می رود. سلول های زنده ای که دارای غشایی سالم باشند، اجازه ی ورود رنگ را به داخل سلول نمی دهند. در حالی که سلول های مرده، رنگ را پذیرفته و در زیر میکروسکوپ به رنگ آبی دیده می شوند (1و6). این ماده به صورت پودر از شرکت (SIGMA -, Germany)، Aldrich خریداری شده و محلول آن [0.04% (w/v)] به کمک PBS تهیه شد (92).
پاساژ و کاشت سلول:
ابتدا میزان تراکم رده های سلولی که در داخل فلاسک و در کف آن قرار گرفته اند،با استفاده از میکروسکوپ اینورت مشخص می شوند. تراکم باید بیش از 70 درصد تعیین گردد تا برای پاساژ مناسب باشد. سپس توسط ساکشن، محیط کشت را از اطراف سلول ها خارج کرده و بلافاصله سلول ها با 3 تا 7 میلی لیتر PBS و در دو مرحله شستشو می شوند. بعد از آن، 2 میلی لیترTrypsin EDTA (برای فلاسک 150میلی لیتری به میزان ml4، برای فلاسک 75 از ml2 و فلاسک 25 از ml 1 استفاده می گردد) را در داخل فلاسک ریخته و فلاسک به داخل انکوباتور 37 درجه Co2 دار انتقال داده می شود. به طور متوسط بین 3 تا 5 دقیقه طول می کشد تا سلول ها از کف فلاسک جدا شده و در داخل محیط کشت شناور شوند. در این حالت بلافاصله حدود 5 میلی لیتر محیط کشت RPMI-1640به محتویات فلاسک اضافه می گردد. سپس حرکت دادن محلول داخل فلاسک که همراه با عمل پیپتاژ است، باعث می گردد تا تمام سلول ها از کف فلاسک و همچنین از یکدیگر، جدا شوند. محتویات فلاسک را به داخل لوله فالکون 15 میلی لیتری انتقال داده و با دورRPM 1700 و به مدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ می شوند. با رسوب پیدا کردن سلولها در ته لوله فالکون، مایع رویی آن ساکشن شده و پلت تشکیل یافته در ته لوله با یک میلی لیتر محیط کشت RPMI-1640 مخلوط می گردد. اضافه شدن محیط کشت بر روی پلت باید همراه با پیپتاژ باشد تا سوسپانسیون یکنواختی به دست آید. در صورتیکه غلظت سلول ها در داخل محیط کشت زیاد باشد می توان با اضافه کردن محیط کشت بیشتر، تراکم سلول ها را کاهش داد تا شمارش سلولها آسانتر صورت پذیرد. سپس به میزان 10 میکرو لیتر از پلت برداشته شده تا توسط لام نئوبار شمارش شوند.
تصویر شماره1-2 : نمایی از سلولهای GS1-spg
تصویر شماره2-2 : نمایی از سلولهای SFTF-PI43
فرمول محاسبه تعداد کل سلول های موجود در فلاسک:
x A ضریب رقت X 104 X V (ml) حجم سوسپانسیون سلولی
ساخت محیط کشت کامل:
برای ادامه یافتن کشت سلولها در فرآیند پاساژ، حدود ג500 پنیسیلین استرپتو مایسین و 5 میلی لیتر FBS به 5/44 میلی لیتر محیط کشت RPMI-1640 اضافه می گردد. این محیط کشت، کامل بوده و برای ادامه رشد رده های سلولی و سایر مراحل کشت مورد نیاز می باشد. در ادامه کشت، دو رده سلولی SFTF-PI43 و GS1-spg با استفاده از محیط کشت کامل و در داخل فلاسک های بعدی کشت داده می شوند. در این مرحله، حدود 300 تا 400 هزار سلول از رده GS1-spg و 500 هزار سلول از رده SFTF-PI43 در مرحله دوم کشت داده می شوند. مقدار پلتی که باید از داخل فلاسک اول به فلاسک دوم 75 میلی لیتری انتقال پیدا کند، تا اینکه حاوی تعداد معینی از سلول های تعیین شده باشند، بر اساس تراکم سلولها مشخص می گردد. فلاسک های حاوی رده های سلولی، در داخل انکوباتور با شرایط دمای c◦37، رطوبت نسبی 99% و CO2 5٪ نگهداری می شوند. ادامه یافتن کشت سلول ها، کمک می کند تا تراکم آنها به یک حد قابل قبولی برسد تا بتوان آنها را برای پاساژ بعدی آماده نمود. یکی از شرایط تعیین کننده در کشت سلول ها گرفتن Back Up از مجموعه سلول هایی است که ممکن بود در یک شرایط پیش بینی نشده منجر به حذف رده های سلولی گردد. میزان مازاد بر سلول های مورد استفاده در داخل تانک نیتروژن نگهداری می شدند.
چگونگی تهیهBack up :
ابتدا محیط کشت فلاسک ها به نحوی که به سلول ها آسیبی نرسد،خارج می گردد. سپس سلول ها در طی دو مرحله و هر بار با 5 تا 10 میلی لیتر PBS شستشو می شوند. بعد از این مرحله، برای تریپسینه کردن محیط، حدود ml2 محلول Trypsin/EDTA، به آن اضافه می شود. پس از جدا شدن سلول ها از کف فلاسک، بار دیگر،ml 5 محیط کشت به آن اضافه شده تا تحت شرایط مناسب، دمای C°4 و دور RPM 1500، به مدت 7 دقیقه سانتریوفیوژ شوند. بعد از سانتریفیوژ و تشکیل پلت، مایع بالای آن خارج شده تا تریپسین از محیط حذف گردد. با رقیق نمودن پلت، اقدام به شمارش سلول ها با استفاده از لام نئوبار می گردد. بر حسب تعداد سلولها در واحد حجم، رده های سلولی برای فریز آماده می شوند. در این مرحله میزان حجمی از سلول ها که در داخل ویال مخصوص قرار می گیرند، حدود 50% حجم آنرا تشکیل می دهند. برای فراهم نمودن شرایط فریز از DMSO 10% و 40% FBS استفاده می گردد. به صورت تقریبی تعداد 1 تا 2 میلیون سلول در داخل هر ویال قرار می گیرد. ویال ها در فریزر c◦80- نگهداری و پس از 24 ساعت به تانک ازت و دمای C◦196- منتقل می شوند.
Thawing (احیای سلول ها):
برای برگشت دادن سلولها از حالت انجماد، ابتدا ویالها را در شرایط استریل از تانک ازت خارج کرده و بعد از چند ثانیه که در هوای آزد قرار گرفته اند، بلافاصله به داخل بن ماری که دارای دمای 37 درجه سانتیگراد می باشد، انتقال پیدا می کنند. مدت زمان نگهداری ویال در داخل بن ماری باید کمتر از 10 ثانیه باشد تا DMSO که کمی حالت سمی دارد بر روی سلول ها اثر منفی بر جای نگذارد. بعد از ذوب شدن سلولها و مشاهده اینکه سلولها از دیواره ویال کنده شده اند، به داخل لوله فالکون که حاوی 5 میلی لیتر محیط کشت کامل می باشد، انتقال داده می شوند. سپس محلول را سانتریوفیوژ (4° C به مدت 5 دقیقه و با دور 1700) کرده تا سلول ها رسوب داده شوند. محیط روی پلت خارج شده و مجددا با محیط کشت جدید رقیق می گردد. شمارش و بر رسی سلول ها در واحد حجم کمک می کند تا زنده بودن و تعداد اولیه سلول ها بعد از ذوب شدن تایید گردد. Over night سلول ها در داخل فلاسکی که حاوی 15 میلی لیتر محیط کشت کامل می باشد، انکوبه خواهند شد تا شرایط اپتیموم برای سلولها و ادامه کشت فراهم گردد.
کاشت رده های سلولی:
1- تعیین زمان دو برابر شدن رده های سلولی:
برای تعیین افزایش رده های سلولی و میزان تکثیر آنها در یک واحد زمانی مشخص از فرمول Dt=3/0×24÷Log Nt/N0 استفاده گردید. برای بدست آوردن زمان دو برابر شدن سلولها، تعداد معینی از رده های سلولی در یک پلیت شش خانه ای (هرخانه 150 هزار سلول) کاشته شدند. خانه شماره 1 و 2 بعد از 24 ساعت مورد شمارش قرار گرفت تا میانگین تعداد سلولها مشخص شود. همین عمل برای خانه های شماره 3 و 4 بعد از 48 ساعت و برای خانه های شماره 5 و 6 بعد از 72 ساعت تکرار گردید. تعیین افزایش تعداد سلولها در زمانهای مختلف و ترسیم نمودار نیمه لگاریتمی از آن، مبین افزایش تقریبی دو برابر شدن رده سلولی GS1-spg بعد از 22 ساعت و رده سلولی SFTF-PI43 بعد از 23 ساعت بوده است. استفاده از این روش کمک می کند تا با تعیین تکثیر سلولها در فواصل زمانی مختلف و در حالت طبیعی، شرایطی را فراهم می سازد تا میزان مرگ سلولی و یا عدم تکثیر آنها در مواجهه با گوسیپول مشخص گردد. البته برای جلو گیری از تراکم بیش از حد سلولها که ممکن بود باعث اشتباه در شمارش سلولها گردد، لذا با انجام مطالعه اولیه (Pilot Study) در هر چاهک، تعداد 50 هزار سلول کاشته شدند. در این حالت تراکم سلولها در بهترین وضعیت خود، یعنی به تراکم 70 تا 80 درصد در داخل پلیت رسیده و آماده برای آزمایش می باشند.
2- کاشت رده های سلولی در پلیت 24 خانه:
تعداد 50 هزار سلول، از دو رده سلولی GS1-spg و SFTF-PI43 به صورت جداگانه و به همراه یک میلی لیتر محیط کشت، 24ساعت قبل از مجاورت با عصاره گوسیپول، در چاهک های پلیت کاشته شده و در داخل انکوباتور نگهدای شدند. گروهها بر اساس غلظت عصاره گوسیپول (M µ10،M µ5، M µ5/2 وM µ 25/1) برای هر رده سلولی تعیین گردید. برای هر رده سلولی، یک گروه هم به عنوان کنترل در نظر گرفته شد. در مجموع هشت گروه آزمایشی و دو گروه کنترل تعریف شدند. برای به حداقل رساندن میزان خطا، گروههای آزمایشی و همچنین گروههای کنترل، در طی سه مرحله تکرار گردیدند.
تصویر شماره 3-2: نحوه کشت سلولها در پلیتهای 24 خانه
تهیه محلول گوسیپول:
گوسیپول یا گوسیپول استیک اسید به صورت پودر بوده و در آب نامحلول است. برای تهیه محلول آن باید از استون، متانول ویا اتانل استفاده نمود. در این مطالعه از اتانول 96% (merk germany) به عنوان حلال گوسیپول استفاده گردید. محلول به دست آمده دارای رنگی زرد مات، متمایل به قهوه ای می باشد. گوسیپول استیک اسید با فرمول C30H30O8,C2H4O2 دارای وزن مولکولی g/m578.61 می باشد. mg/ml65/0 گوسیپول را در 20میلی لیتر اتانول حل کردیم. گروه شم با توجه به رقیق شدن اتانول در یک مقیاس 6-10 که تاثیر آن را بی اثر می سازد، حذف گردید. محلول را الیکوت کرده و در دمای 20- در تاریکی نگهداری شدند. استوک شامل lµ980 محیط کشت کامل و lµ20 محلول گوسیپول بوده است. از محلول استوک به میزان لازم محلولهای Mµ10،M µ5، M µ5/2 وM µ25/1 ساخته شد.
فرمول تهیه غلظت های مختلف گوسیپول:
100ג Gossypol + 9.9 ml Media = µ10M
50 ג Gossypol + 9.950 ml Media = µ5M
25 ג Gossypol + 9.975 ml Media = µ5/2M
12/5 ג Gossypol + 9.980 ml Media = µ25/1M
تصویر شماره 4-2: پودر گوسیپول استیک اسید تصویر شماره 5-2: غلظتهای مختلف گوسیپول
بررسی سمیت سلولی:
پس از 24 ساعت از مجاورت سلول ها با محلول گوسیپول استیک اسیدو کنترل (محیط کشت کامل فاقد هر گونه عصاره سمی)، تعداد سلول های زنده به روش آزمون MTT اندازه گیری شد. MTT به صورت پودر از شرکت SIGMA -Aldrich, Germany)) خریداری شده و با غلظت mg/ml5 در PBS حل گردید.
تعیین سمیت گوسیپول به روش آزمون MTT:
با استفاده ازMTT که یک روش رنگ سنجی آنزیمی است و توسط آن میتوان پاسخ سلولهای مختلف به فاکتورهای خارجی، از جمله فاکتورهای رشد، داروهای سایتوتوکسیک وسایر عوامل شیمییایی را بدست آورد. با انجام این آزمون، فعالیت و سرعت تکثیر سلولها که ممکن است تحت تاثیر هورمونها، فاکتورهای رشد و یا عوامل سمی وسرطانزا افزایش یا کاهش پیدا کرده و یا بی اثر بودن آن به دست می آید. در این مطالعه از روش MTT، برای ارزیابی میزان سمیت گوسیپول جهت اندازه گیری حیات، رشد وتکثیر دو رده سلولی مورد استفاده قرار گرفت. تترازولیوم 3-(4, 5 – Dimethy thiazol -2 – YL) – 2, 5- Diphenye Tetrazolium bromide (MTT)}} ، بر اساس احیا و اکسید شدن کریستالهای زرد رنگی که در آن وجود دارد عمل می کند. سلولهای زنده که دارای میتوکندری سالم می باشند ، به وسیله آنزیم سوکسینات دهیدروژناز ، که یکی از آنزیم های چرخه تنفسی میتوکندری هاست با حلقه تترازولیوم واکنش نشان می دهند. آنزیم سوکسینات دهیدروژناز آنها حلقه زرد رنگ تترازولیوم را شکسته، لذا سلول هایی که از نظر متابولیکی فعال ترند بیشتر این واکنش را انجام می دهند. احیا واکسید شدن حلقه تترازولیوم موجب تشکیل کریستال های آبی رنگ (بنفش رنگ) نامحلول فورمازان میگردد. میزان رنگ تولید شده با تعداد سلول هایی که از نظر متابولیک فعال هستند رابطه مستقیم دارد. کریستال های فورمازان که در آب نامحلول هستند بایستی قبل از قرائت با فتومتر با یک ماده ی حلال آلی به حالت محلول درآیند. در نهایت جذب نوری محلول بدست آمده را در طول موج مشخص قرائت کرده و به کمک منحنی استاندارد، تعداد سلول ها را محاسبه می نماییم. در این روش بر خلاف سایر روش ها مراحل شستشو و جداسازی سلول ها که اغلب باعث از دست رفتن تعدادی از سلول ها می شوند حذف گردیده است. تمامی مراحل آزمایش از ابتدا تا انتها در یک میکروپلیت انجام می شود، لذا تکرار، دقت و حساسیت پذیری آن بسیاربالا است)15) .
آزمون MTT :
برای هر رده سلولی، 4 غلظت مختلف گوسیپول در نظر گرفته شد. تعداد 50 هزار سلول از هر رده برای مجاورت با گوسیپول در داخل چاهک قرار گرفت. برای کاهش خطا، برای مجاورت با هر غلظت 3 چاهک در نظر گرفته شد. ابتدا سلول ها به مدت 24 ساعت در داخل انکوباتور بدون مجاورت با گوسیپول نگهداری شدند. بعد از سپری شدن مدت زمان تعیین شده، محیط کشت روی سلول ها خارج گردید. سپس به میزان یک میلی لیتر گوسیپول در غلظت هایM µ10،M µ5، Mµ5/2 وM µ25/1 در مجاورت سلولها و در داخل چاهک قرار گرفتند. همین عمل برای گروه کنترل تنها به صورت تعویض محیط کشت انجام شد، تمامی گروه های آزمایشی و گروه کنترل به داخل انکوباتور انتقال یافتند. 24 ساعت بعد از گذشت زمان، مایع روی سلول ها خارج شده و سلول ها با PBS شستشو داده شدند. سپس به میزان µl 200 محلول MTT در مجاورت سلولهای گروههای آزمایشی و گروه کنترل و در داخل چاهک قرار گرفتند. برای تست دستگاه اسپکتروفوتومتر و کالیبره کردن آن µl 200 محلول MTT خالص در داخل یکی از چاهک های خالی قرار داده شد. در این چاهک مورد نظر هیچگونه سلول و یا محیط کشت دیگری وجود نداشت. مدت زمانی که MTT باید در مجاورت سلول ها قرار داشته باشد، 4 ساعت تعیین گردید. در این مدت تمام گروههای آزمایشی، کنترل و چاهک حاوی MTT خالص، در داخل انکوباتور نگهداری شدند. بعد از گذشت 4 ساعت، نمونه ها از انکوباتور خارج شده و به هر یک از چاهک، حدودµl 800 ایزوپروپیل الکل اسیدی 04/0 نرمال HCL جهت حل رسوب ارغوانی-آبی، به آنها اضافه گردید. برای حل شدن کامل رسوب بدست آمده، اقدام به پیپتاژ محتویات داخل چاهک قبل از اضافه شدن ایزوپروپیل گردید. برای کالیبره کردن دستگاه، ابتدا MTT خالصی را که در داخل یکی از چاهک ها برای تست قرار گرفته بود را بعد از اضاغه شدن ایزوپروپیل، در داخل Cuvette دستگاه اسپکتروفوتومتر قرار می دهیم تا نقطه صفر جذب دستگاه را به دست آوریم. سپس بعد از شستشوی Cuvette، محتویات داخل چاهک های مربوط به گروههای آزمایشی وگروه کنترل را به ترتیب در داخل آن قرار داده تا از طریق دستگاه اسپکتروفوتومتر و در دو طول موج nm570 و nm630 خوانده شود. انتخاب طول موج های یاد شده، به دلیل بیشترین حالت جذب چگالی نور ((Optical Density کریستالهای فورمازان در این محدوده می باشد. هر چه میزان جذب (OD) محلول بالاتر باشد نشان دهنده تعداد سلول زنده بیشتری است. تفاضل OD ها در دو طول موج nm570 و nm630 برای هر چاهک مشخص می شود. سپس میانگین جذب نوری سلولهای زنده با احتساب سه چاهک در هر گروه آزمایشی تعیین گردیده و با گروه کنترل مقایسه شد.
تصویر شماره 6-2: غلظتهای مختلف گوسیپول برای انجام آزمون MTT
تصویر شماره 7-2: اضافه شدن MTT بعد از24 ساعت به چاهکهای پلیت
بررسی سمیت با استفاده از تریپان بلو:
تعداد 150000 هزار سلول از دو رده SFTF-PI43 و GS1-spg، را به صورت جداگانه با حجمی حدود 5/2 تا 3 میلی لیتر محیط کشت کامل در داخل پلیت های شش خانه کاشته شدند. به مدت 24 ساعت اجازه داده شد تا در داخل انکوباتور، سلول ها در ته چاهک بچسبند. بعد از سپری شدن 24 ساعت پلیت ها از انکوباتور خارج شده و محیط روی سلول ها خارج گردید. در این مرحله، گوسیپول در غلظت های تعیین شده، به داخل چاهک اضافه می گردد تا در مجاورت سلول ها قرار گیرد. بعد از گذشت 24 ساعت، ابتدا گوسیپول را از چاهک خارج کرده سپس با استفاده از PBS، سلول ها شسته شدند. در هر چاهک به میزان 500 میلی لیتر Trypsin-EDTA اضافه شده و پلیت ها در داخل انکوباتور به مدت زمان 3-5 دقیقه نگهداری شدند تا سلول ها از کف چاهک جدا شوند. سپس به میزان 5/1 تا 2 میلیتر محیط کشت کامل، بر روی سلولها و در داخل چاهک قرار گرفت. محیط کشت باعث می گردد تا اثر Trypsin-EDTA حذف گردد. با پیپتاژ کردن محیط داخل چاهک تمام سلولها از کف چاهک کنده شده و در داخل محیط کشت شناور می شوند. مرحله شمارش تعداد سلولهای داخل چاهک در واحد حجم می باشد. به این منظور به میزان µl 20 سوسپانسیون داخل چاهک را برداشته و با µl 20 تریپان بلو مخلوط کرده و با کشیدن بر روی لام اقدام به شمارش سلول ها می گردد. سلول هایی که رنگ را پذیرفته باشند دچار مرگ سلولی شده اند. نهایتا داده ها در گروههای آزمایشی با گروه کنترل مقایسه شدند.
روش آماری:
مقادیر خام به دست آمده از آزمون MTT به صورت نسبت درصدهر گروه به گروه کنترل مربوطه در آمده است .همچنین این کار برای آزمون تریپان بلو نیز انجام گرفت . مقادیر خام به دست آمده از رنگ آمیزی تریپان بلو وآزمون MTTتوسط One Way ANOVA وT-Test آنالیز شدند. مقادیر p<0.05 از لحاظ آماری معنادار در نظر گرفته شد. همچنین نمودار مربوط به دو برابر شدن سلولی توسط نمودار لگاریتمی رسم گردید وبر اساس داده های به دست آمده از آزمونMTT ، نمودار IC50 (غلظت میانه بازدارنده) نیز رسم شد.
فصل سوم
یافته ها
بررسی سمیت گوسیپول در رده سلولی GC1-spg:
با استفاده از تستMTT و بر اساس جذب نوری که در دو طول موج 570 و630 صورت می پذیرد، غلظت های مختلف گوسیپول مورد ارزیابی قرار گرفت. سپس چهار غلظت تعیین شده با گروه کنترل مقایسه شدند. اعداد ذکر شده در جدول (3-1)، نمایانگر نسبت میانگین جذب نوری غلظت های عصاره سمی گوسیپول با گروه کنترل در هر چاهک می باشد. میزان جذب نوری در غلظت های µM/ml25/1، µM/ml5/2، µM/ml5 و µM/ml10 ، به ترتیب 85±0/4، 56±9/2، 46±3 و 39±6/7 به دست آمد. با استفاده از روشهای آماری مشخص گردید که جذب نوری در غلظت های بالا نسبت به گروه کنترل، کمتر صورت پذیرفته و از نظر آماری معنی دار می باشد. میزان جذب نوری در غلظت 25/1، نسبت به گروه کنترل معنی دار نبوده است (جدول1-3 و نمودار 3-3).
غلظتهای مختلف گوسیپول درمحیط کشت
(µM)
رده سلولی
0 (CTL)
1.25
2.5
5
10
GC1-SPG
100±0/6
85±0/4
56±9/2*
46±3*
39±6/7*
P-Value
_
17/0
006/0*
008/0*
003/0*
جدول شماره 1-3: نتایج آزمون MTT پس از مجاورت ردههای سلولی GC1-spg
با غلظتهای مختلف گوسیپول. *) : تفاوت معنی دار با گروه کنترل)
در مقایسه بین گروهی، مشخص گردید که تمام گروههای آزمایشی که شامل چهار غلظت متفاوت می باشند، از نظر آماری با گروه کنترل، دارای اختلاف معنی داری هستند. این اختلاف در دوز µM/ml25/1، معنی دار نبود. همچنین دوزهای µM/ml5/2، µM/ml5 و µM/ml10 گوسیپول با دوز µM/ml25/1، گوسیپول از نظر آماری اختلاف معنی دار را نشان داد. این حالت بین دوز µM/ml 2.5 گوسیپول، تنها با دوز µM/ml25/1، و گروه کنترل معنی دار بود. بین غلظت µM/ml 2.5 گوسیپول و دو غلظت µM/ml 5 و µM/ml10 اختلاف معنی داری از نظر آماری مشاهده نگردید. همچنین دو غلظت µM/ml 5 و µM/ml 10 گوسیپول، با دوز µM/ml25/1، و گروه کنترل دارای اختلاف معنی داری بودند (جدول 2-3).
MTT ASSEY
مورد آزمایش
گروه مورد مقایسه
P value
CTRL
1.25 µM/ml
0.17
2.5 µM/ml
0.006*
5 µM/ml
0.008*
10 µM/ml
0.003*
1.25µM/ml
CTRL
0.17
2.5 µM/ml
0.05*
5 µM/ml
0.035*
10 µM/ml
0.007*
2.5 µM/ml
CTRL
0.006*
1.25 µM/ml
0.05*
5 µM/ml
0.84
10 µM/ml
0.055
5 µM/ml
CTRL
0.008*
1.25 µM/ml
0.035*
2.5 µM/ml
0.84
10 µM/ml
0.367
10 µM/ml
CTRL
0.003*
1.25 µM/ml
0.007*
2.5 µM/ml
0.055
5 µM/ml
0.367
جدول شمار ه 2-3: مقایسه آماری سمیت گوسیپول در غلظتهای 10 و 5 و 2.5 میکرومولار نسبت به گروه کنترل
در رده سلولی GC1-SPG توسط آزمونMTT ( * : تفاوت معنی دار با گروه کنترل)
نمودار (1-3) : درصدحیات سلولهایGC1-spg در مجاورت باغلظتهای 10،5و5/ 2 میکرومولار
توسط آزمون MTT
بررسی سمیت گوسیپول در رده سلولی SFTF-PI43:
جهت بررسی سمیت گوسیپول در رده سلولی SFTF-PI43 نیز از تستMTT و بر اساس جذب نوری در دو طول موج 570 و 630 استفاده گردید. سپس چهار غلظت µM/ml25/1، µM/ml5/2، µM/ml5 وµM/ml10 در گروههای آزمایشی با گروه کنترل مقایسه شدند. اعداد به دست آمده، نمایانگر نسبت میانگین جذب نوری غلظت های عصاره سمی گوسیپول با گروه کنترل در هر چاهک می باشد. میزان جذب نوری در غلظت های µM/ml25/1، µM/ml5/2، µM/ml5 و µM/ml10، به ترتیب 67±5، 47±6، 38±4 و 22±1 به دست آمد. با استفاده از روشهای آماری مشخص گردید که جذب نوری در دوزهای بالا کاهش بیشتری یافته است. این اعداد در غلظت های 5/2، 5 و10، نسبت ها به گروه کنترل، از نظر آماری معنی دار بودند. میزان جذب نوری در غلظت 25/1،نسبت به گروه کنترل، معنی دار نبوده است (جدول3-3 و نمودار 2-3).
غلظتهای مختلف گوسیپول درمحیط کشت
µM) )
رده سلولی
0 (CTL)
1.25
2.5
5
10
SFTF-PI43
100±5
67±5
47±6*
38±4*
22±1*
P-Value
_
/0142
00/03*
0/001*
0/001*
جدول شماره (3-3) : . نتایج آزمون MTT پس از مجاورت ردههای سلولی SFTF-pI43
با غلظتهای مختلف گوسیپول ( *: تفاوت معنی دار با گروه کنترل)
در مقایسه بین گروهی، در رده سلولی SFTF-pI43، و چهار غلظت متفاوت µM/ml25/1، µM/ml5/2، µM/ml5 وµM/ml10، مشخص گردید که تمام گروههای آزمایشی، از نظر آماری با گروه کنترل، دارای اختلاف معنی داری هستند. این اختلاف در دوز µM/ml25/1، با گروه کنترل معنی دار نبود. همچنین دوزهای µM/ml5/2، µM/ml5 و µM/ml10 گوسیپول با دوز µM/ml25/1، گوسیپول از نظر آماری اختلاف معنی دار را نشان دادند. این حالت بین دوز µM/ml 2.5 گوسیپول، تنها با دوز µM/ml25/1، و گروه کنترل معنی دار بود. بین غلظت µM/ml2.5 گوسیپول و دو غلظت µM/ml 5 و µM/ml 10 اختلاف معنی داری از نظر آماری مشاهده نگردید. همچنین دو غلظت µM/ml 5 و µM/ml 10 گوسیپول، با دوز µM/ml25/1، و گروه کنترل دارای اختلاف معنی داری بودند. (جدول 4-3 و نمودار 2-3)
MTT ASSEY – SFTF-pI43
مورد آزمایش
گروه مورد مقایسه
P value
CTRL
1.25 µM/ml
0.142
2.5 µM/ml
0.003*
5 µM/ml
0.001*
10 µM/ml
0.001*
1.25µM/ml
CTRL
0.142
2.5 µM/ml
0.001*
5 µM/ml
0.029*
10 µM/ml
0.011*
2.5 µM/ml
CTRL
0.003*
1.25 µM/ml
0.001*
5 µM/ml
0.442
10 µM/ml
0.054
5 µM/ml
CTRL
0.001*
1.25 µM/ml
0.029*
2.5 µM/ml
0.442
10 µM/ml
0.593
10 µM/ml
CTRL
0.001*
1.25 µM/ml
0.011*
2.5 µM/ml
0.054
5 µM/ml
0.593
جدول شماره 4 -3: مقایسه آماری سمیت گوسیپول در غلظتهای 10 و 5 و 2.5 میکرومولار نسبت به گروه کنترل
در رده سلولی SFTF-pI43 توسط آزمونMTT ( * : تفاوت معنی دار با گروه کنترل)
نمودار 2-3 :در صد حیات سلولهای SFTF-PI43در مجاورت با غلظتهای
10،5و5/2 میکرومولار توسط آزمون MTT
بررسی سمیت گوسیپول در رده سلولی GC1-spg و SFTF-pI43 با تریپان بلو
در مرحله دوم، برای تعیین میزان سمیت گوسیپول بر روی دو رده سلولی، از روش رنگ آمیزی تریپان بلو و بر اساس شمارش سلولها کمک گرفته شد. در این روش، تعداد سلول ها در رده GC1-spg، در تمام چهار غلظت تعیین شده، که سلول های زنده رنگ تریپان بلو را به خود نگرفته بودند، نسبت به گروه کنترل کاهش پیدا کردند. تعداد سلول های زنده در غلظت های µM/ml25/1، µM/ml5/2، µM/ml5و µM/ml10، به ترتیب 82%، 56%، 48% و 41% به دست آمد. این تفاوت بین غلظت های µM/ml5/2، µM/ml5 و µM/ml10 و گروه کنترل از نظرآماری معنی دار بود. ولی بین دوز µM/ml25/1 و گروه کنترل اختلاف معنی داری مشاهده نگردید. همچنین تعداد سلول ها در رده SFTF-pI43، نیز در چهار غلظت تعیین شده، که در این روش نیز سلول های زنده رنگ تریپان بلو را به خود نگرفته بودند، نسبت به گروه کنترل کاهش نشان دادند. اعداد حاصل از شمارش سلول ها به این صورت بود که، تعداد سلول های زنده در غلظت های µM/ml25/1، µM/ml5/2، µM/ml5 و µM/ml10، به ترتیب 80%، 51%، 46% و43% به دست آمد. اختلاف بین غلظت های µM/ml5/2، µM/ml5 و µM/ml10 و گروه کنترل از نظرآماری معنی دار بود. ولی بین غلظت µM/ml25/1 و گروه کنترل تفاوت معنی داری دیده نشد. (جدول 5-3 و نمودار 3-3)
غلظتهای مختلف گوسیپول
در محیط کشت
µM) )
رده سلولی
0 (CTRL)
1.25
2.5
5
10
GC1-SPG
100%
82%
56%*
48%*
41%*
P Value
–
0.575
0.045*
0.032*
0.009*
SFTF-PI43
100%
80%
51%*
46%*
43%
P Value
–
0.365
0.034*
0.008*
0.005*
جدول شماره 5-3 : میانگین درصد حیات (viability) سلول های SFTF-PI43و GC1-SPG پس از مجاورت با گوسیپول به روش رنگ آمیزی تریپان بلو
در مقایسه بین گروهی، در رده سلولی GC1-spg و چهار غلظت متفاوت µM/ml25/1، µM/ml5/2، µM/ml5 و µM/ml10، مشخص گردید که گروههای آزمایشی،µM/ml 5/2، µM/ml5 وµM/ml10، از نظر آماری با گروه کنترل، دارای اختلاف معنی داری هستند. این اختلاف در دوز µM/ml25/1، با گروه کنترل معنی دار نبود. همچنین مشاهده گردید که بین دو گروه آزمایشی دوز µM/ml25/1 و µM/ml10 اختلاف معنی داری از نظر آماری وجود داشت. (جدول : 6-3)
TRIPAN BLUE (GC1-spg)
مورد آزمایش
گروه مورد مقایسه
P value
CTRL
1.25 µM/ml
0.575
2.5 µM/ml
0.045*
5 µM/ml
0.032*
10 µM/ml
0.009*
1.25µM/ml
CTRL
0.575
2.5 µM/ml
0.639
5 µM/ml
0.085
10 µM/ml
0.025*
2.5 µM/ml
CTRL
0.045*
1.25 µM/ml
0.639
5 µM/ml
0.183
10 µM/ml
0.057
5 µM/ml
CTRL
0.032*
1.25 µM/ml
0.085
2.5 µM/ml
0.183
10 µM/ml
0.486
10 µM/ml
CTRL
0.009*
1.25 µM/ml
0.025*
2.5 µM/ml
0.057
5 µM/ml
0.486
جدول شماره6-3: مقایسه آماری سمیت گوسیپول در غلظتهای 10و 5و 2.5 میکرومولار نسبت به گروه کنترل
در رده سلولی GC1-SPG با استفاده از روش رنگ آمیزی تریپان بلو
نمودار 3 -3 : در صد حیات سلولهای GC1-SPG پس از مجاورت با غلظت های گوسیپول به روش آزمون تریپان بلو
همچنین در مقایسه بین گروهی، در رده سلولی SFTF-PI43 و چهار غلظت متفاوت µM/ml25/1، µM/ml5/2، µM/ml5 وµM/ml10، مشاهده گردید که بین گروههای آزمایشی،µM/ml 5/2،µM/ml5 و µM/ml10 و گروه کنترل، از نظر آماری اختلاف معنی داری وجود دارد. این اختلاف در دوز µM/ml25/1، با گروه کنترل معنی دار نبود. همچنین تفاوت بین گروه آزمایشی دوز µM/ml25/1 با دو گروه آزمایشی دوزهای µM/ml5 و µM/ml10 اختلاف معنی داری از نظر آماری وجود داشت. (جدول 7-3 و نمودار 4 -3)
TRIPAN BLUE (SFTF-pI43)
مورد آزمایش
گروه مورد مقایسه
P value
CTRL
1.25 µM/ml
0.365
2.5 µM/ml
0.034*
5 µM/ml
0.008*
10 µM/ml
0.005*
1.25µM/ml
CTRL
0.365
2.5
0.116
5
0.024*
10
0.012*
2.5 µM/ml
CTRL
0.034*
1.25
0.116
5
0.247
10
0.108
5 µM/ml
CTRL
0.008*
1.25
0.024*
2.5
0.247
10
0.519
10 µM/ml
CTRL
0.005*
1.25
0.012*
2.5
0.108
5
0.549
جدول شماره 7-3 : مقایسه آماری سمیت گوسیپول با گروه کنترل با غلظتهای 10،5 و5/2 میکرومولار
در رده سلولیSFTF-pI43 با استفاده از روش رنگ آمیزی تریپان بلو
نمودار 4 -3 : در صد حیات سلولهای SFTF-pI43 پس از مجاورت با غلظت های گوسیپول به روش آزمون تریپان بلو
شمارش سلولی برای تخمین زمان دو برابر شدن :
بعد سپری شدن 22 ساعت از کشت اولیه و رعایت شرایط اپتیموم، تعداد سلول ها در رده GC1-SPG و همچنین بعد از گذشت 23 ساعت، تعداد سلول ها در رده SFTF-PI43 به دو برابر افزایش پیدا کرد. نمودار لگاریتمی زمان دو برابر شدن رده های سلولی در نمودارهای ذیل قابل مشاهده هستند.
نمودار5-3 : نحوه محاسبه زمان تقریبی دوبرابر شدن در رده سلولی GS1-SPG
نمودار6-3 : نحوه محاسبه زمان دو برابر شدن در رده سلولی SFTF-PI43
IC50 گوسیپول در دو رده سلولی:
جهت تعیین IC50 که نشانگر مهار شدن حدود 50% رشد سلولها در یک محیط کشت خاص می باشد، برای دو رده سلولیGC1-SPG و SFTF-PI43 ، با استفاده از درصدتوکسیسیتی در آزمون MTT به میزانM/ml µ2/3 وM/ml µ2/2 به دست آمد.
نمودار شماره 7-3 : تعیین IC50گوسیپول توسط آزمون MTT در دو رده سلولی
فصل چهارم
بحث
و نتیجه گیری
در بیضه تولید مداوم اسپرم بالغ در ضمن حیات به وسیله جمعیت کوچکی از سلولهای بنیادی رده ژرمینال انجام میپذیرد این سلولها پس از بلوغ تکثیر شده وفراینداسپرماتوژنزرا شکل میدهند (2).
در عین حال برخی مواد طبیعی یا صنعتی احتمالا با آسیب به سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی میتوانند منجر به ناباروری یا عقیمی برگشت ناپذیر گردند. به خاطر تغیییرات در شیوه وسبک زندگی و مجاورت با آلودگی محیطی یا صنعتی کاهش در کیفیت عملکرد اندام تولید مثلی مردان توسط محققین به اثبات رسیده است (99 ).
گوسیپول نیزیکی از موادی طبیعی سمی است که تاثیرات ضد باروری آن اززمانی مشخص شد که در یکی از روستاهای چین با استفاده از روغن پنبه دانه خام سرعت ناباروری افزایش یافت.این مساله هم درحیوانات نشخوار کننده وغیر نشخوار کننده(جوندگان) مشاهده شده بود (62). مکانیزمهای مسئول برای تاثیرات گوسیپول براندام تولیدمثلی نر از طریق اهداف متعددی اعمال میشود. این تاثیرات برروی اسپرماتوزوئیدها و اسپرمسازی و عملکرد بافتهای غیر غددی متفاوت است (28). پاز وهومونایی معتقدند که گوسیپول درصورت تصفیه نشدن روغن پنبه دانه،از آن حذف نمیشود و لذا ورود آن به داخل بدن ممکن است باعث توقف باروری افراد شود(62).
پژوهشگران در مطالعات خویش دریافتند که گاوهای که از کنجاله پنبه دانه تغذیه کرده اند دارای محیط بیضه کوچکتری نسبت به گاوهای گروه شاهد هستندو علت آن در تخریب لایه های زاینده در بیضه است که باعث کاهش آنها شده است(27). طبق مطالعات راندل وهمکارانش در سال 1992 ، مقادیر موثر مصرف گوسیپول در نرها ، کاهش تحرک و تولید اسپرم و افزایش ناهنجاری در اسپرم را به همراه دارد و از طرفی با کاهش ضخامت اپیتلیوم ژرمینال در ارتباط است آنها معتقد بر این بودند که آسیب وارده به غلاف میتوکندری در قطعه میانی اسپرم علت کاهش تحرک اسپرمهایی است که در معرض گوسیپول هستند(65). میزان داینئین که یک پروتئین متصل شونده به میکروتوبولهاست در سلولهای اسپرماتید واسپرماتوسیتهای اولیه موشهای صحرایی که به صورت خوراکی گوسیپول استیک اسید را دریافت کردندکاهش یافت و 8هفته بعداز پایان یافتن این رژیم غذایی میزان پروتئین داینئین به مرور زمان به حالت اولیه خود بازگشت (79).
تاثیرات طولانی مدت گوسیپول براسپرماتوزوئیدها یا تماس با دوزهای بالا ولی در طی زمانی کوتاه تغییرات ریخت شناسی شدیدی را در اسپرماتوزوئیدها ایجاد میکند که شامل آسیب به آکروزوم اسپرم ومیتوکندری آن و همچنین آسیب به دم اسپرم ورشد ناقص آن است (28).
در تحقیق فلنیده آندراده و همکاران درسال 2006 ، کاهش تراکم اسپرم در اپیدیدیم موشهای تحت اثرگوسیپول مشاهده شد. آنها بیان داشتندکه یکی ازعادی ترین تغییرات استفاده از گوسیپول حضور اسپرمهایی با مورفولوژی غیر عادی است که این نقص به صورت سرهای مجزا یا شکسته اسپرم ظاهر گشت. تفکیک(لایه لایه شدن) سلولهای اپیتلیوم اپیدیدیمی ،هم در سر وهم دردم اپیدیدیم در موشها نشان دهندهاین است که یکی از عملکردهای گوسیپول بر روی اپیدیدیم میباشدو حال آنکه تاتیراث ناباروری گوسیپول بدون تغییر در سطح تستوسترون و وضعیت هورمون آندروژون ایجاد شد. وجود مواد سیتوپلاسمی شامل کیسه ها وذرات با اندازهها وشکلهای مختلف در لومن اپیدیدیم حیواناتی که گوسیپول دریافت کرده بودند نیز مشاهده شد (37). مهار تیپT، کانالهای کلسیمی در غشای اسپرم نیز ممکن است یکی از مکانیزمهای باروری گوسیپول به حساب آید (51).
نتایجی که قنبری و همکارانش در سال 1384 بدست آوردند نیز بیانگر این مطلب است که ، استفاده از کنجاله پنبه دانه در در جیره غذایی قوچهای آتابای موجب کاهش اندازه محیط بیضه ،کاهش درصد تحرک وبقای اسپرماتوزوآ و افزایش درصد غیر طبیعی آنها میشود (12). آرشامی نیز در طی مطالعهای که بر روی قوچهای نژاد رامبویه انجام داد دریافت که سطح تستوسترون پلاسمای خون قوچهای مصرف کننده گوسیپول با وجود اینکه کمتر بود اما اختلاف معنی داری با گروه شاهد نداشت واین درحالی است که در بررسیهای انجام شده بر روی بافت بیضه اندازه سلولهای لایدیگ کمتر از قوچهای گروه شاهد بود (1).
برخی از فعالیت های بازدارنده گوسیپول شامل توقف فسفریلاسیون اکسیداتیو و اختلال در تنفس سلولی وکاهش تولید ATPاست که از طریق مهار فعالیت آنزیمهایی که در چرخه انتقال الکترون حضور دارند از جمله لاکتات دهیدروژناز ، پیروات دهیدروژناز، NAD ایزوسیترات دهیدروژناز وسوکسینیک دهیدروژناز شکل میگیرد (49).
مطالعات، نشان داد که گوسیپول استیک اسید از طریق باز داشتن آنزیم لاکتات د هیدروژناز باعث اختلال در عملکرد چرخه گلیکولیز شده که کاهش سطح ATP و تحرک اسپرم را به همراه دارد این آنزیم در انتقال کاهنده از سیتوسل به میتوکندری شرکت میکند و اسپرم را قادر به حرکت میسازد و در سیتوسل تولید انرژی میکند (77). سریکو وهمکاران نیزمعتقد بودند که گوسیپول بااختلال در عملکرد پروتئینهای آنزیمی جنبندگی اسپرم را کاهش میدهد (28). اگرچه گوسیپول در غلظت Mµ10 قادر به جدا کردن فسفریلاسیون اکسیداسیو از زنجیره انتقال الکترون میتوکندری وآنزیمهای گلیکولیتی است اما احتمال اینکه تاثیر گوسیپول فقط بر روی متابولیسم و مهار آنزیمها باشد ضعیف است (66). گوسیپول ومتابولیتهایش دارای عملکرد پرواکسیدانی وآنتی اکسیدانی نیز هستند .شواهد قابل مشاهدهای از استرس اکسیداتیو ،تشکیل گونههای فعال اکسیژن و قطعه قطعه شدن DNA وخصوصیات زنجیره های انتقال الکترون در سیستم های زیستی وجود دارد (48). کارت و همکاران در سال 1994 بیان داشتند که میزان گوسیپولی که میتواند بر تحرک اسپرمها در موشهای صحرایی تاثیر بگذارد µM/ml10-3/9 است در حالی که مانسس عنوان کرد که تاثیر گذاری غلظت گوسیپول بر روی سلولهای کشت شده سرتولی از Mµ3 آغاز میشود (54). نتایج حاصل از این مطالعه که در شرایط invitro برروی ردههای سلولی بافت بیضه انجام شده موید همین مطلب است که با توجه به غلظت گوسیپول میزان تاثیر گذاری آن متفاوت خواهد بود. مشاهده گردیده که در رده سلولی GC1-spg که مشتق از سلول بنیادی بافت بیضه موش است در غلظتهای µM/ml 10 و µM/ml 5 و µM/ml 5/2 نیز سمیت نسبت به گروه کنترل مشاهده شده واین مساله نیز دررده سلولی مشتق از بافت بیضه گوسفند SFTF-PI43 نیز دیده شده است.
در دههای اخیر استفاده از سیستم کشت سلولی ابزار مهمی را برای توضیح عملکرد گوسیپول در سطح کشت فراهم کرده است. مطالعات انجام شده توسط zhung و همکارانش نشان از این دارد که سلولهای سرتولی و لایدیگ کشت شده نیز نسبت به سطوح بالای گوسیپول آسیب پذیرند.تاثیر بر روی این سلولها با ایجاد واکوئلهای گسترده و افزایش قطرا ت لیپیدیدر آنها مشاهده شد (97). مطالعات که در زمینه تاثیر گوسیپول بر روی سلولهای سرتولی کشت شده انجام شده به این نکته اشاره دارد که ممکن است، میتوکندری به عنوان هدف احتمالی ناباروی گوسیپول باشد (54).
Zhou و همکارانش در سال 2008در مطالعات خود که برروی سلول سرتولی کشت شده انجام داده بودند، اثبات کردند که گوسیپول باعث مسدود شدن اتصالات شکافدار بین سلولی20 Gjic (سلولهای سرتولی کشت شده مورد نیاز برای اسپرمسازی در موش وانسان)سلولهای سرتولی با سلولهای مجاور و سلولهای جنسی در حال تمایز شده و باعث کاهش بیان کانکسین4321 میگردد.
Cx43 یک جز اساسی در مسیر های Gjic میباشد. اهمیت پروتئین کانکسین 43 در اتصالات شکافدار به تنظیم روند اسپرماتوژنز در بالغین مربوط میگردد وحذف Cx43 از سلولهای سرتولی موش صحرایی موجب به تاخیر افتادن در بلوغ سلولهای سرتولی میشود.آنها تاثیرات گوسیپول بر قابلیت زیست Gjic سلولهای سرتولی در گروههای آغشته به Mµ 10 از این ماده بررسی کردند و در یافتند که این گروهها 10برابر قابلیت زیستشان نسبت به گروه کنترل کاهش یافته است. آنها همچنین بیان داشتند که Cx43اتصالات شکافدار با افزایش دوز گوسیپول کاهش مییابد (99). گوسیپول احتمالا عملکرد میتوکندری سلول ها را طی پدیده آپوپتوز که منجر به فعال شدن کاسپازها میشود ، مختل میکند. آپوپتوز مرگ برنامه ریزی شده سلولی است که به لحاظ فیزیولوژی وپاتولوژی اهمیت دارد و خانواده بزرگ ژنی BCL-2 و کاسپازها در مسیر آپوپتوز شرکت میکنند (61). پروتئینهای Bcl2 تنظیم کنندگان حیاتی آپوپتوز هستند که میتوان آنها را به 3 گروه تقسیم کرد: زیرخانواده/BCL-2 BCL-Xl که از آپوپتوز جلوگیری میکند وشامل هر 4 دومین مشابه (BH1, ،BH2، BH3، BH4)هستند. زیر خانوادهbax/bak مرگ سلولی را ترویج میدهدو دومین BH4 را ندارند وزیر خانواده 3 هم از پروتئینهای پروآپوپتوزی تشکیل شده (Bid/ Bad/Bim) موجب القا آپوپتوز میگردند وتنها دومین ، BH3را دارا هستند ( 60،26).
از آنجایی احتمالا مکان اصلی فعالیت گوسیپول می تواند در سطح میتوکندری باشد. توانایی گوسیپول به خصوص انانتیومر (-) گوسیپول برای پیوستن به 2-BCl و BCl-xl در شرایط Invitro والقای آزاد سازی سیتوکروم c و فعالسازی BAK نشان دهنده این مساله است. در پژوهشی که توسط اولیور وهمکاران در سال 2005 انجام گرفت برای اثبات این مساله میتوکندری هایی که در آنها بیان بیش از حد پروتئین Bcl2 رخ داده بود جداسازی شده و به صورت مجزا مورد بررسی قرارگرفتند وبه مدت یک ساعت در تماس با غلظتهای 10تا50 میکرومول بر لیترگوسیپول بودند. سپس سوپرناتانت آنها در معرض روش Immunoblotting قرار گرفت و آزاد سازی سیتوکروم c که وابسته به مقدار مصرف گوسیپول بود مشاهده شد(57). دو مدل برای عملکرد گوسیپول ارائه شده، در اولین مدل گوسیپول به خصوص انانتیومر (-) آن ممکن است به طور مستقیم با چسبیدن به 2-BCl یا BCL-Xl عمل کند و موجب مهار فعالیت آنتی آپوپتوزی وجایگزینی عوامل پرو آپوپتوزی ازجمله پروتئینهایbax/bak یا دومینBH3 گردد وهمچنین BH3 متصل شده به Xl -BCL را به عنوان مکان خاصی برای بر هم کنش با گوسیپول مطرح شده است. در دومین مدل احتمالی گوسیپول ممکن است به طور مستقیم با اعضای خانواده 2-BCl پرو آپوپتوزی از جمله BAXیا BAK واکنش داده تا فعالیت آپوپتوزی را ترویج دهد (60و61 و 21).
زمانی که سیگنالهای مرگ توسط گوسیپول،سبب القای پدیده آپوپتوز میگردند، موجب میشوند که پروتئین آپوپتوزی خانواده 2-BCL به ویژه (خانواده BAX) فعال گردند و موجب افزایش نفوذ پذیری غشای میتوکندری میشوند و در نتیجه سیتوکرومC از فضای بین غشای میتوکندری آزاد شده وبا Apaf-1 ) 22(، فاکتورهای فعال کننده پروتئازهای آپوپتوزی کمپلکسی را شکل داده که کاسپاز9 که یک کاسپاز آغازگر است را فعال وبه دنبال آن کاسپازهای اجرایی3 تحریک شده که در ادامه کاسپازx را فعال میکنند واین پدیده آبشار کاسپازی منجر به مرگ سلولها خواهد شد (60و61و98و50). در ضمن افزایش میزان پروتئینهایP53 که در پاسخ به آسیب DNA ناشی از تیمار بادوز بالای گوسیپول رخ میدهد باعث القا پدیده آپوپتوز در سلولهای سرطانی پروستات میشود و نیز میتواند یکی دیگر از مکانیزمهای مربوط به اثرات گوسیپول باشد (82).
بر اساس نتیجه پژوهش حاضر گوسیپول باعث کاهش توانایی حیات در ردههای سلول بنیادی GC1-spgو SFTF-PI43 شده که که مکانیسم عمل آن وابسته به دوز است به طوریکه دوزهای بالاتر گوسیپول اثر مهاری شدیدتری رااعمال میکند. نتایج حاصل از دو روش مطالعه توکسیسیتی تقریبا هماهنگ بوده و اثر سمیت گوسیپول رابر روی دو رده سلولی ذکر شده تایید کرده است. تست سمیت سنجی MTT و تست رنگ آمیزی تریپان بلو نشان داد که حساسیت نسبت به گوسیپول در هر دو رده سلولی نشخوار کننده وغیر نشخوار کننده در شرایط invitro تقریبایکسان است. حال آنکه در چندین مطالعه به مقاوم بودن نشخوار کنندگان اشاره شد. تفاوت تحقیق فعلی با مطالعات گذشته ناشی از این مساله است که در مطالعات گذشته گوسیپول به عنوان جیره غذایی و خوراکی توسط نشخوار کنندگان مصرف میشد که به دلیل باند شدن گوسپول به پروتئین های آزاد در محیط شکمبه و میکروبهای موجود در شکمبه با تغییر فیزیولوژیکی محیط سبب کاهش سمیت گوسیپول می شود و اثر گذاری آن بر روی بافتها را کمی کاهش می دهد در حالی که در این مطالعه اثر گوسیپول به طور مستقیم بر روی رده سلولی ژرمینال (سلول بنیادی) بافت بیضه بوده است. تفاوت بین گونه ها ونحوه ارزشیابی نیز می تواند یکی ازدلایل این تفاوتها باشد.. مقدار مصرف میانه کشنده 23(IC50) که در اکثر گونه ها که با روش خوراکی تعیین شده در موش های صحرایی mg/kg3340-2400 ، در موش mg/kg950-500 ، برای خرگوش ها mg/kg600-350 و mg/kg550 برای خوک ها عنوان شده است (18). در تحقیق حاضر غلظت مهار کننده (IC50) گوسیپول برای رده های سلولی GC1-spg برابرM µ2/3 و برای SFTF-PI43 برابرM µ2/2 تعیین شده است، در حالی که مانسس(IC50) رده سلولی سلولهای سرتولی(TM4)را در حدودM µ6/7 تعیین کرده است که می توان احتمال داد که رده های سلولی بافت بیضه ذکر شده در این مطالعه، حساس تر از رده سلولی سرتولی است.
فصل پنجم
مشکلات
وپیشنهادات
مشکلات:
* حساسیت بالای کار با ردههای سلولی ولزوم رعایت تمامی اصول وقوانین مرتبط با کشت سلول
* وقت گیر بودن انجام مراحل ولزوم پیگیری مداوم جهت حفظ، سلامت وثبات سلولهای کشت شده حتی در روزهای تعطیل
* قیمت بالای مواد وتجهیزات مصرفی مربوط به کار کشت سلول
پیشنهادات:
* مطالعات وبررسی بیشتر در زمینه خاصیت ضد سرطانی گوسیپول
* به کار بردن گوسیپول به عنوان یک ماده آنتی باکتریال برای تاثیر گذاری بر روی باکتری ها
* استفاده از گوسیپول به عنوان یک نئواجونت به منظور کاهش حجم توده های توموری
تقدیر و تشکر:
با نهایت سپاس از استاد گرامی جناب آقای دکتر جورسرایی و جناب آقای دکتر ذبیحی به پاس راهنمایی و یاری بی شائبه شان و تقدیر فراوان ازسرکار خانم دکتر حجتی به پاس تلاشهای بی وقفه شان.
و با تشکر از کلیه کارکنان مرکز سلولی مولکولی دانشگاه علوم پزشکی بابل به الاخص سرکار خانم عابدیان به پاس مساعدت و همکاری بی دریغ و نیز راهنمایی های ارزنده شان.
و نیز با سپاس فراوان از سرکار خانم دکتر هاله اخوان نیاکی به پاس همکاری بزرگوارانه شان.
منابع
منابع فارسی
1- آرشامی جواد، . بررسی اثرات هیستوپاتولوژیک گوسیپول در بیضه قوچ.(1373).مجله علوم و صنایع کشاورزی. جلد 8، شماره 1 ، صفحات79 ـ 91.
2- اکبرزاده نجار رضا،جدی تهرانی محمود ،صادقی محمد رضا ، زرنانی امیرحسین،صالحخو شیدا،حسین زاده فاطمه ،حیدری مهناز ، عینی لیلا ،آخوندی محمد مهدی.(1386). پیوند سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی در موش. مجله دانشکده پزشکی ،دانشگاه علوم پزشکی تهران ،دوره 65،ویژنامه3 ، صفحات1-9.
3- باتلر ،مایکل. (1385). فناوری کشت سلولهای حیوانی(ترجمه میرزا خلیل بهمنی و ایوب خسروی).تهران: انتشارات دانشگاه امام حسین.(تاریخ انتشار به زبان اصلی ندارد).
4- بهاروند ،حسین.(1386). سلولهای بنیادی بزرگسالان. جلد2،تهران :انتشارات خانه زیست شناسی.
5- پریور کاظم ، محسنی کوچصفهانی هما ، بیگدلی محمدعلی ، مناس قدرت عبادی. بررسی اثرات سیتوتوکسیک تولوالدواکسیم بر روی اسپرماتوژنز موش های نژاد Balb/C نابالغ. مجله علوم پزشکی دانشگاه آزاد اسلامی، دوره 20 ، شماره 1، بهار 89 ، صفحات 1 تا 6
6- جان کوئیرا ، لوئیز کارلوس ، کارنیرو ،خوزه . (1383). بافت شناسی پایه (ترجمه مهدی منتظری). تهران: انتشارات ارجمند.ویرایش یازدهم
7- جورسرایی سیدغلامعلی ، فیروزجایی علیرضا ، یوسف نیاپاشا یوسف رضا ، پور مرزونی عیسی طهماسب ، سرابی ابراهیم. اثرات هیستوپاتولوژیکی تزریق تک دوز سم دیازینون بر روی ساختار بیضه در موش سفید صحرایی. فصلنامه پزشکی یاخته سال دوازدهم شماره1،پیاپی45.
8- حداد خداپرست ، محمد حسین. محمد علی، نجفی. (1384). تهیه کنسانتره پروتئینی ا زکنجاله پنبه دانه جهت مصرف انسان به روش مخلوط حلال ما و آب: استن:هگزان. مجله کشاورزی شماره 1 ، جلد
9-حسن زاده، نادر. (1384) . فناوری استفاده از مواد طبیعی گیاهی با تاکید بر مدیریت بیماری آتشک. مجله علمی پژوهشی علوم کشاورزی، سال یازدهم شماره 1
10- سروری،علی.نادری، محمد مهدی.حیدری،مهناز. زرنانی،امیرحسین.صادقی،محمد رضا.آخوندی،محمد مهدی.(1389). عوامل خطر ساز محیطی وکاهش باروری در مردان وزنان. فصلنامه باروری ناباروری.دوره11،شماره4،صفحات211-226.
11- فاطمی، حسین.(1377).شیمی مواد غذایی. تهران :انتشارات شرکت سهامی انتشار.
12- قنبری، فرزاد . جعفریآهنگری، یوسف . قورچی، تقی. حسنی ، سعید.( 1385). بررسی اثرات گوسیپول کنجاله پنبه را به بر برخی فرآسنجه های خونی در قوچهای آتابای . مجله علوم کشاورزی ،سال12، شماره 3، صفحات 632 ـ 623.
13- کروجی، مرتضی. عزیزی،حسین .شاهوردی، عبدالحسین.بهاروند، حسین. سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی موش وانسان. فصلنامه پزشکی یاخته،سال دوازدهم،شماره2،تابستان89، صفحات148-158.
13- نوری دلوئی، محمدرضا. حاج ابراهیمی، زهرا. سلول های بنیادی و پزشکی ملوکولی اهمیت و جایگاه راهبردی ، کاربردها و چشم انداز. فصلنامه طب و تزکیه، سال چهاردهم، پاییز 1384، صفحات 61 تا 74
14-نجفی، غلامرضا. اسلامی، سیامک. کریمی، علی. (1388). اثر سم دیازون بر روی بافت بیضه در موش بالغ رت: مطالعه هیستوپاتولوژی
منابع لاتین:
15- Abe K, Matsuki N2000.Measurement of cellular 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) reduction activity and lactate dehydrogenase release using MTT. Neurosci Res.;38(4):325-9.
16-Acamovic.T, Brooker. J. D, Biochemistery of plant secondary metabolites and their effects in animals, proceeding of the nutrition society (2005), 64, 403-412
17- Amini,A. Andkamkar,F.(2005).the effects of GossypoL of Spermatogenesis in NMRI Mic. Iranian Journal of science and Technology ,TransactionA, vol 29, No A l, 123-133.
18- Alexander. J.Benford. D.Cockburn .A.Cravedi .j.p.Doglioti E.Alessandro D.D.Ferandez-Cruz M.L.Peter Fink-Gremmels j.Lodovico Galli C.Grandjean P.Gzyl J.Gerhard H.Johansson N.Mutti A.Schlatter J.Leeuwen RV.Peteghem C.V.Varger p. (2008).Gossypol as undesirable substance in animal feed – Scientific Opinion of the Panel on Contaminants in the Food Chain.The EFSA Journal 908, 1-55.
19- Apont,p.m.Van.Bragt,MP.deRooiij, DG. (2005) Spermatognial stemcell: charetiristics on Experimental Possibilities. APMIS.113:727-742.
20- Badawy, Shawky Z. A. Souid, Abdul-Kader Cuenca, Violeta. Montalto, Nicholas. Shue, Frances.(2007). Gossypol inhibits proliferation of endometrioma cells in culture .Asian Journal of Andrology.Volume 9, Issue 3, pages 388-393.
21- Balakrishnan K, Wierda WG, Keating MJ, Gandhi V.(2008). Gossypol, a BH3 mimetic, induces apoptosis in chronic lymphocytic leukemia cells. Blood. ;112(5):1971-80.
22- BEN-DAVID.Mand. SCHENKER. J.G .(1983). Transient hyperprolactinemia: a correctable cause of idiopathic female infertility. J cline Endocrinol metab;57(2):442-4
23- Bourinbaiar,As.Lee-Huang,S.(1994).comparative invitro study of contraceptive agents with anti-HIV activity:gramicidin,nonoxynol-9,and gossypol.contraception.49(2):131-7
24- Brocas ,C. Rivera, R .M. Paula-Lopes ,F. F . McDowell, L. R . Calhoun, M. C. Staples, C .R. Wilkinson, N. S. Boning, A. j . Chenoweth, P. J . Hansen,p.j. (1997). Deleterious Action of gossypol on Bovin Spermatozoa , oocytes and embryo. Biology of reproduction. 57: 901-907
25- Chang , Qing, Qian, Xiaojing , Xu, Zenglu. Zhang ,chengxia.(2010). Effect of combined administration of low-dose gossypol with steroid hormones on the mitotic phase of spermatogenesis of rat . J. EXP.Zool. 313-671-679.
26- Cheng EH, Sheiko TV, Fisher JK, Craigen WJ, Korsmeyer SJ. (2003) . VDAC2 inhibits BAK activation and mitochondrial apoptosis. Science.;301(5632):513-7.
27- Chenoweth , P .J. Risco , C.A. Larsen , R . E. Velez , J. Shaw , N. Chase ,C. C. Tran ,T . ( 1999). effect of dietary gossypol on aspects of semen quality , sperm morphology and sperm perm production in young Brahman bulls.Theriogenology . 42 : 1-13.
28- Cierszko,A.Dobrowski,k.(2000). in vitro effect of gossypol acetate on yello perch(perca flavescens)spermatozoa.Aquatic toxicology .vol 49,issue3,page181-187.
29- Clawson AJ and smith FH, 1966. Effect of dietary iron on gossypol toxicity and on residues of gossypol in porcine liver . j. Nutr. 89(3), 307-310
30- Coutinho, E.M. Gossypol:acontraceptive for men.(2002). Contraception. 65- 259-293.
31- Cui ,G.Zheng , w.sun, Y. Zhang , Q. Deng , X. Chen, X. (2007). Gossypol with methyL Testesterone and Ethinylestradiol Male cloes not affect Rat spermatogonial stem cell differentiatian.Vol53,No2.page91-98.
32- De Rooij,DG.(1998).Stem eell in the testis.int JExp pathol.79:67-80.
33- De Rooij DG, Mizrak SC. (2003). Deriving multipotent stem cell from Mouse spermatogonial stem cell: anewl tool for developmental and clinical research. Development : 135(13): 22.7-2213
34- Dodou,kalliopi.(2005). investigation on gossypol:past and present development. vol 14,No11.pagel419.1434.
35- Ed Wards,J.D.Jr.(1958).Total synthesis of gossypol. J. Am. Chem. Soc80 (14), pp 3798-3799.
36- EL-sharaky,A.S .EL-Seweilly,S.M. EL-SAyed,M.M. and EL-Shahawy,I.N The efeectof Gossypol ,gossypolone and Apogossypolon the lipid of male rat serum and seminal Flaid.(1994). qatar unive.sci.j.14(e).32-38.
37- FaLoni de Andrade,SÉRgio. urbanoLiva,Samara. KLineflter,Gary Robert.(2006). Epididymis-Specific Pathologic Disorders in Rats Exposed to Gossypol from Weaning Through Puberty. Toxicologicpathology-34:730-737.
38- Fombad RB, Bryant MJ.( 2004) . An evaluation of the use of cottonseed cake in the diet of growing pigs. Trop Anim Health Prod.;36(3):295-305.
39-Freedman TB, Cao X, Oliviera RV, Cass QB and Nafise LA, 2003. Determination of the absolute configuration and solution conformation of gossypol by vibrational circular dichroism. Chirality 15, 196-200.
40- Freshney,r.Ian.(2005).culture of animal cells .a manual basic techniques.5th edition wiley and sons.new jersey.
41- Gdanies,M.Jbrragimov,B.T. Dadabaev,B.N.(1990). Lattice lnclusion Complexes ofgossypol,Structureof the 1:1complex of Gossypol with Acetonitrile. Acta cryst.c46,810-813.
42-Gamboa DA, Calhoum MC, kuhlmann SW, SW, Haq AU and bailey CA, 2001. Tissue distribution of gossypol enantiomers in broilers fed various cottonseed meals. J. Poultry Sci. 80, 920-925
43- Hassan ME, Smith GW, Ott RS, Faulkner DB, Firkins LD, Ehrhart EJ, Schaeffer DJ. (2004). Reversibility of the reproductive toxicity of gossypol in peripubertal bulls. Theriogenology.;61(6):1171-9.
44- Jiang, Jiahuna. Silvova ,Veronika. Jedinak,Andrej. Silva,Daniel.(2011). Gossypol inhibits growth,invasiveness,and angiogensis in human Prostate cancer cells by modulating NF -KB/AP-I Dependent – and indendent- signaling. spring Science Businces Mwdia B.v
45-Kandylis k, Nikokyris P, Liamadis D and deligiannis K, 1992, Evaluation of cotton sed cake as feed ingredient for fattening sheep . J. Sci. Food Agric. 58(3), 291-299
46- Koruji,M.Movaedian,M.Mowla,S.J.Gourabi,H. Arfaee ,A,J. (2009).efficiency of adult mouse spermatogonial Stem cell colony formation under Several Culture condition. In vitro cell.Dev.Biol-Animal. 45:281-289
47- Kochar, P.G., 2004, 'What are stem cells?', ProQuest Review Article.
48- kovacic ,Peter. Mechanism of Drug and Toxic action of Goosypol: focus On reactive oxygen species and erectron transfer.(2003)current medicinal ,chemistry. vol10, Nnmber24.pp,2711-2718.
49- Le Blanc M, Russo J, Kudelka AP, Smith JA.(2002). An in vitro study of inhibitory activity of gossypol, a cottonseed extract, in human carcinoma cell lines. Pharmacol Res;46(6):551-5.
50- Lei X, Chen Y, Du G, Yu W, Wang X, Qu H, Xia B, He H, Mao J, Zong W, Liao X, Mehrpour M, Hao X, Chen Q.(2006).Gossypol induces Bax/Bak-independent activation of apoptosis and cytochrome c release via a conformational change in Bcl-2. FASEB J.;20(12):2147-9.
51- Liang ,shi yu . Jun – Ping ,Bai , Wen – ping , WANg. ( 2003) ION – Channels inhuman sperm membran and contraceptive mechanisms of male antifertility compounds derived from tradirional Medicine ActaPharmacol 24 (1) : 22-30
52- LU, Liang .sen-ming , wang. Xi- gang , Hu. Mon – ming , Coa .Ji -ren , zhang (2008). effect of gossypol acetic acid on CNE2 Cells apoptosis. cell.vol88:287-298.
53-Marrison, sean.J. Mashah, nirao.Anderson,david.j.(1997).Regulation mechanism in stem cell. cell. vol88:287-298.
54- Monsees ,Tk. Winterstein ,u. SChill,WB. Miska,W.(1998). Jnfluence of gossypol on the secretory function of cultured rat setoli cells. Toxican:36(5)813-6.
55- Mutin ,M. George, f. Lesaule, G.Sampol, J. Reevalution of Trypsin-EDTA for endothelial cell detachment befor flow cytometry analysis endothelium. 1996;4(4):289-95.
56- Nikokyris NP, Kandylis Kostas Deligiannis Kostas. (1999 ). Effects of varying levels of dietary free gossypol in whole cotton seed on physiological responses of growing-fattening lambs.J,Sci.food Agric.1968-1981.
57- Oliver CL, Bauer JA, Wolter KG, Ubell ML, Narayan A, O'Connell KM, Fisher SG, Wang S, Wu X, Ji M, Carey TE, Bradford CR. (2004). In vitro effects of the BH3 mimetic, (-)-gossypol, on head and neck squamous cell carcinoma cells.Clin Cancer Res.;10(22):7757-63.
58- Oliver CL, Miranda MB, Shangary S, Land S, Wang S, Johnson DE. (2005). Gossypol acts directly on the mitochondria to overcome Bcl-2- and Bcl-X(L)-mediated apoptosis resistance. Mol Cancer Ther.;4(1):23-31.
59- Park W, Chang MS, Kim H, Choi HY, Yang WM, Kim do R, Park EH, Park SK. (2008). Cytotoxic effect of gallic acid on testicular cell lines with increasing H2O2 level in GC-1 spg cells. Toxicol In Vitro.;22(1):159-63.
60- Parone,p.A. James.D.Martinou,j.c.(2002). Mitochondria: regulating the inevitable. Biochimie;84(2-3):105-11.
61- Parone PA, Martinou JC.( 2006).Mitochondrial fission and apoptosis: an ongoing trial. Biochim Biophys Acta.;1763(5-6).
62- Paz,G.f.Homonnai,z.T.(1984). effect of antifertility agent, gossypol acetic acid,on the metabolism and testestrone secretion of isolated rat interstitial cell in vitro. Contraception.; 29(6):543-52.
63- Pegg DE. Principles of cryopreservation. 2007. Methods Mol Biol. 368:39-57.
64- Polsky,B.Segal ,SJ.Baron, PA.Gold. Gold,IW .Heno, H.Armstrong, D. (1989). inactivation of human Immuno deficiency virus by gossypol. contraception.39(6) : 579-87.
65- Randel.R.D.Chase, C.C.Jrand Wyse S.J. Effects of gossypol and cottonseed products on reproduction mammals.Journal of animal science. Joarnal of animal Science.y,AnimSCi.70:1628-1638 .
66- Reyes J, Borriero L, Tanphaichitr N, Bellve AR, Benos DJ. 1986. Energy metabolism of cultured TM4 cells and the action of gossypol. Biol Reprod.;34(5):809-19.
67-Ryu,Buom-young. Kubota, Hiroshi. Avarbook, Mary.R. Brinster, RalphL. (2005) Consenteration of spermatognial stem cell self – renewal signaling between monse andrat.Pans.vol:102,n.40:14302-4307.
68-Sakesena SK,Salmonsen R,Lau IFand Chang MC.(1981).Gossypol its toxicological and edocrinological effect in male rabbit.contraception24(2),203-14.
69- Seshagir.Polani B. i. (2001).Molecular insights into the causes of male infertility . Journal of Biosciences Volume 26, Number 4, 429-435.
70- Sedler,W.T.(2010)Traslated by (R.Chotbi,A.zenooi, N.Bahrami) lipincott willams and wikins.11edition-2010.
71- Schmidt JA, Abramowitz LK, Kubota H, Wu X, Niu Z, Avarbock MR, Tobias JW, Bartolomei MS, Brinster RL.(2011). In vivo and in vitro aging is detrimental to mouse spermatogonial stem cell function. Biol Reprod. ;84(4):698-706.
72-Shaaban wf.Taha TA,EL-Nouty FD,El-Mahdy AR AND and Salem MH.(2008). reproductive toxicologic effect of gossypol on male rabbit: biochemical, enzymaticand electrolytic propertic of seminal plasma.fertil. steril.89,1585-1593.
73- Shamblott MJ, Axelman J, Wang S, Bugg EM, Littlefield JW, Donovan PJ, Blumenthal PD, Huggins GR, Gearhart JD. (1998). Derivation of pluripotent Stem cell from cultured human primordial germ cell.Proc Natl Acad Sci USA. Nov 10;95(23):13726-31.
74- Shelley MD, Hartley L, Groundwater PW, Fish RG. (2000).Structure- activity studies on gossypol intumor cell lines. Anti cancer Drugs.;11(3):209-16.
75- Singh SR, Burnicka-Turek O, Chauhan C, Hou SX.( 2011).Spermatogonial stem cells, infertility and testicular cancer. J Cell Mol Med.;15(3):468-83.
76- Smith AG. .(2001).emberyo-drived stm cell of mic and men. Annu Rev Cell Dev Biol.;17:435-62.
77- Stephens DT, Critchlow LM, Hoskins DD. ( 1983). Mechanism of inhibition by gossypol of glycolysis and motilily of Monkey spermatozoa in vitro .. J Reprod Fertil. Nov;69(2):447-52.
78-Sunilkumar G, Campbell LM,puckhaber L, Stipanovic RD and Rathore KS, 2006. Engineering cottonseed for use in human nutrition by tissue-specific reduction of toxic gossypol . proc. Nat. acad. Sci., 103 , 18054-18059
79- TENG C.S. Biological activity in the repopulating rat spermatocyte after the withdrawal of gossypol treatment. V: Inhibition and recovery of microtubular dynein. (1995) , vol. 51, n5, pp. 313-318.
80- Uzal FA. Puschner B. Tahara JM. Nordhausen RW. Gossypol toxicosis in a dog consequent to ingestion of cottonseed bedding. J Vet Diagn Invest. (2005 Nov; 17(6):626-9.
81- van Pelt AM, Roepers-Gajadien HL, Gademan IS, Creemers LB, de Rooij DG, van Dissel-Emiliani FM.(2002) . estabilishment of cell Lines with rat Spermatogonial stem cell charateristics. Endocrinobgy . Endocrinobgy . 143(5): 1845 – 1850
82- Volate SR, Kawasaki BT, Hurt EM, Milner JA, Kim YS, White J, Farrar WL. and . Farrar,. (2010.). Gossypol Induces Apoptosis by Activating p53 in Prostate Cancer Cells and Prostate Tumor-Initiating Cells. mol cancer ther :9:461_470
83- Wang.X and plhak,L.C.(2000) production,characterization, and application of anti-gossypol polyclonal antibodies .J.Agric,Fool chem..48,5109-l6.
84- Wang.x.Wang,J.Wong,sc.chow,LS.Nicholls, JM.Wang, YC.Liu, Y.kwong, DL.(2000). Cytotoxic effect of gossypol on colon carcinoma cells. Life Sci. 2000 Oct 20;67(22):2663-71.
85- Wagers, Amy.L. Welssman,living.l.(.2004). plasticity of adalt stem cells.cell. vol,ll6:639-48.
86- Available from :www. en.wikipedia.org/wiki/plan-secondry-metabolism.
87- Available from :www.sigmaaldrich.com.
88- Available from :www.ncbi, pasteur.ac.ir/r-Generalcell.asp.ncbicod C164 .
89- Available from: www.ncbi, pasteur.ac.ir/r-Generalcell.asp. ncbicod C471.
90-Availablefrom:www.paa.com/cell_culture_products/sera/ foetal_bovine_serum_fbs.html.
91-Availablefrom:www.medicago.se /productsheets/ Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4 and 7.2.
92- Available from http: www.scribd.com/doc/6909835/Trypan-Blue-Exclusi on-Test-of-Cell-Viability.
93- Available from http: www.stem cells.nih.gov/info/basics.
94- Ye WS, Liang JC, Hsu TC. (1983). Toxicity of male contraceptive , gossypol, in mammalian Cell cultures. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Plant. Volume 19, Number 1, 53-57.
95- Yildirim, M, Lim, C. Wan, PJ Aand klesius, PH. (2003).Growth performance and response of channel catfish(ictalurus punctatus) fed diet containing graded levels of gossypol acetic acid.Aqua culture 219(1-4),751-769.
96- Yong Wang. Song wei. Li Shuchun. Xin Guan .Shiying Miao. shudong zong . Koide SS and Linfang Wang . GC-1 mRHBDD 1 Knockdown spermatogonia cells their spermatogenic capacity in mouse seminiferous tubules.BMC Cell Biology.page1-7.
97- Zhuang , L.Z. Philips , D . M. Gunsalus , G.L. Bardin , C.w. Mather, J.P. (1983). Effect of gossypol on Rat sertoli and leyding cells in primary cultare and estabilished cell line. American society of andrology. 4: 336-344.
98- Zhang M, Liu H, Guo R, Ling Y, Wu X, Li B, Roller PP, Wang S, Yang D. (2003).Molecular mechanism of gossypol-induced cell growth inhibition and cell death of HT-29 human colon carcinoma cells. Biochem Pharmacol;66(1):93-103
99- Zhou DR, Zhou YC, Cui GH, Guo X, Qin J, Gui YT, Cai ZM.(2008).Gossypol repressed the gap junctional intercellular communication between Sertoli cells by decreasing the expression of Connexin43. Toxicol In Vitro.;22(7):1719-25.
Evaluation of Gossypol induced Cytotoxicty
on two Stem Cell lines derived from Testicular tissue
Abstract:
gossypol is a polyphenolic compound derived from cotton seed plant.Today ,this plants is used as supplementary of feed for ruminants. Some studies indicate that the excessive use of gossypol causes disorder in spermatogensis process. The lower dose of gossypol is also considered as a contraceptive agent in men.Due to the fact that it may has some effect on germinal cells. Hence,in this research, we studies about the effect of gossypol on the two stem cell lines of mouse testicular tissue GC-1spg (non ruminant animal) and SFTF-PI43 (ruminant animal).
Metod and material: GC-1spg and SFTF-PI43 cells have been culture in medium RPMI160 with fetal bovine serum 10%and 1% penicillin streptomycin. then 5×104 cells/ml in the two, 24 well plates were seeded of each cell line. After preparation of gossypol acetic acid solution in foure concentrations of 1/25,2/5,5and 10μm we exposed and incubated The mentined cell line in 24 hours.
In order to examine the influence of gossypol acetic acid on cell growth, and studing on viability cell, MTT assey and Trypan-blue dye exclusion,were used as methods in this research. To analyze the data, one way ANOVA and two_taild Student,s T test.
Result: in this study,gossypol toxicity in the concentration of 2/5,5 and 10 μM
toward the control group has been seen in both cell line, which meaning ful statistically .(p<.001) .gossypol toxicity of the concentration of 1/25 μM was not meaning ful statistically
Conclusion: the effect of toxicity of gossypol acetic acid on two cell line of testicular tissue (GC-1spg and SFTF-PI43), demonstrate the decrease of viability stem cells in the spermatogenesis procedure which has dose dependant on dose.
Keyword: gossypol ,toxicity, GC-1spg , SFTF-PI43, testicular tissue
1 . Seminiferous lobules
2 .Self renwal
3. Inercellmass
4. Spermatogonial stem cells
5.Promordial Germ Cell
6 .Flavonoids
7. Alkaloid
8 .Terpenoid
9 .Atropine
10. Phytic Acid
11 .Phytoestrogens
12. Carotenoids
13. Gossypol
14 .Jiangsu
15. .LDH
17 . Hubei
18 . Hebei
19 – Gossypol Acetic Acid
20 . Gap junction inter cellular communication
21 . connexin43
22 .Apoptotic protease activating factor-1
23 Median lethal dose
—————
————————————————————
—————
————————————————————
62