پروتکل سنجش فعالیت آنزیم های گیاهی

2-11-5- سنجش فعالیت آنزیم ها
2-11-5-1- تهیه بافر استخراج (بافر فسفات50 میلی مولار)
میلی مولار با pH برابر 7 به صورت زیر می باشد:
1- 68/0 گرم نمک پتاسیم دی هیدروژن فسفات (KH2PO4) به همراه 0186/ 0 گرم اتیلن دی آمین تترا استات (EDTA) و دو گرم پلی واینیل پلی پیرو لیدون(pvpp) در 50 میلی لیترآب مقطر حل گردید وحجم آن به100 میلی لیتر رسانده شد.
2- 87/0 گرم نمک پتاسیم مونو هیدروژن فسفات (K2HPO4) به همراه 0186/ 0 گرم اتیلن دی آمین تترا استات (EDTA) و دو گرم پلی واینیل پلی پیرو لیدون(pvpp) در 50 میلی لیترآب مقطر حل گردید وحجم آن به100 میلی لیتر رسانده شد.
3- محلولهای 1 و2 به عنوان محلولهای ذخیره میباشند که در هر بار آزمایش 39 میلی لیتر از محلول 1 با 61 میلی لیتر از محلول 2 مخلوط شده و pH آن با استفاده از pH متر بین2/7-8/6 تنظیم گردید.
2-11-5-2- استخراج آنزیم ها
بهمنظور استخراج و اندازه گیری آنزیم، برگ های فریز شده چمن در هاون چینی ریخته و نیتروژن مایع به آن اضافه گردید. سپس برگ ها بهخوبی کوبیده شدند تا کاملاً خرد شوند. به مقدار 5/0 گرم از پودر برگ آسیاب شده به میکروتیوب های 2 میلی لیتری منتقل شد و با افزودن یک میلیلیتر از بافر استخراج به مدت 15 دقیقه با دور rpm 14000 در دمای 4 درجه سانتی گراد، سانتریفوژ شدند. پس از اتمام سانتریفوژ عصاره رویی با استفاده از سمپلر برداشته و به میکروتیوب های 5/1 میلی لیتری منتقل شدند و دوباره به مدت 10 دقیقه با دور rpm 10000 در دمای 4 درجه سانتی گراد، سانتریفوژ شدند. پس از اتمام سانتریفوژ عصاره رویی با استفاده از سمپلر برداشته و به میکروتیوب های با همان حجم منتقل شدند. میکروتیوب های حاوی عصاره در زمان سایش برگ ها و سانتریفوژ نمونه های دیگر در داخل ظرف یخ نگهداری شده و در صورت عدم استفاده به فریزر80- درجه سانتی گراد انتقال داده شد [Beauchamp and Fridovich, 1971]. از این عصاره برای سنجش آنزیمهای پراکسیداز، سوپراکسیددیسموتاز، آسکورباتپراکسیداز وکاتالاز استفاده شد.
2-11-6- سوپراکسیددیسموتاز (SOD)
فعالیت کل آنزیم سوپراکسیددیسموتاز با اندازهگیری تواناییاش در جلوگیری از کاهش فتوشیمیایی نیترو بلو تترازولیوم (NBT) تعیین شد [Giannopolitis and Ries, 1977].
2-11-6-1- بافرهای سنجش آنزیم SOD

بافر1: بافر فسفات 50 میلی مولار حاوی EDTA 1/0 میلی مولار، متیونین (mM 13) و نیترو بلو تترازولیوم (NBT) Mµ7و pH برابر 7.

اسید را به حجم 100 سی سی می رسانیم
KH2PO4(/68gr) +EDTA(/3722gr)

باز را به حجم 100 سی سی می رسانیم
K2HPO4(/87gr)+EDTA(/3722gr)

61cc baz+39cc acid
سپس به این 100سی سی 13میلی مولار متیونین یعنی 19/ گرم به آن اضافه می شود و بعد 7 میلی مولار NBT یعنی /006 گرم به آن اضافه می شود و سپس PH روی 7 تنظیم می شود.

بافر2: بافر ریبوفلاوین (mM12/0)، به همین منظور 001/ گرم ریبو فلاوین را در 20 میلی لیتر آب مقطر حل می کنیم. ریبوفلاوین به نور حساس است، بنابراین در ظرفی با پوشش آلومینومی نگهداری میشود هر روز باید ساخته شد.
2-11-6-2- تعیین فعالیت آنزیم SOD
1-نمونه کنترل، شامل 975 میکرولیتر بافر 1، 15 میکرولیتر بافر2 و 10 میکرولیتر بافر فسفاتی است که در استخراج عصاره از آن استفاده شد.
2- نمونه بلانک، شامل 975 مایکرولیتر بافر 1، 15 میکرولیتر بافر2 و 10 میکرولیتر بافر فسفاتی است که در استخراج عصاره از آن استفاده شد.
3-نمونه عصاره آنزیمی، شامل 975 میکرولیتر بافر 1، 15 میکرولیتر بافر 2 و 10 میکرولیتر عصاره آنزیمی است.
نمونه بلانک به مدت 15 دقیقه در تاریکی قرار داده شد و نمونههای کنترل و عصاره آنزیمی، به مدت 15 دقیقه، در شیکر نوری با دمای 20 درجه سانتی گراد و دارای دو عدد لامپ فلورسنت W40 با دور 100 دور در دقیقه شیک شدند. سپس جذب در طول موج 560 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر مدل PG Instruments ItdT80+UV/VIS قرائت شد.
یک واحد SOD به مقدار آنزیمی گفته میشود که سبب مهار 50 درصد NBT به فورمازان1 شود. تفاوت بین جذب هر عصاره در مدت زمان روشنایی 15 دقیقه و جذب عصاره آنزیمی در همان مدت زمان روشنایی در واقع نشان دهنده بازداشتن واکنش خودبخودی و تشکیل فورمازان توسط SOD است.

SOD آنزیم فعالیت (Unit/mg) =(100-[ ((OD Control-OD Sampel))/(OD Control)×100])/50(2-8)
2-11-7- آنزیم پراکسیداز (POD)
برای سنجش فعالیت سینتیکی آنزیم POD از روش سزار و همکاران [Cesar et al., 2010] استفاده گردید.
2-11-7-1- تهیه بافرهای سنجش
1) بافر آب اکسیژنه (H2O2) 225 میلی مولار: برای این منظور 450 میکرو لیتر H2O2 با بافر فسفات به حجم 20 میلی لیتر رسانیده شد. محلول ها به عنوان سوبسترا باید در هر بار اندازه گیری تازه باشند.
2) بافر گایاکول 45 میلی مولار: برای این منظور 112 میکرولیتر گایاکول با بافر فسفات به حجم 20 میلیلیتر رسانیده شد.
2-11-7-2-تعیین فعالیت آنزیم
بافر H2O2 به مقدار 495 میکرولیتر و بافر گایاکول به همان مقدار در دمای پایین (ظرف حاوی یخ) با هم مخلوط گردید و به آن 10 میکرولیتر عصاره آنزیمی اضافه و منحنی جذب در طول موج 470 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر مدل PG Instruments ItdT80+UV/VIS قرائت شد. در محلول بلانک به جای عصاره آنزیمی، 10 میکرولیتر از بافر فسفات 50 میلی مولار (7 pH=) استفاده شد. فعالیت آنزیمی با استفاده از فرمول قانون بیر لامبرت و با ضریب خاموشی گایاکول پراکسیداز µM-1c-1m6/26 محاسبه شد و فعالیت آنزیم در نهایت بر حسب µMol/g FW.min محاسبه شد.

2-11-8- آسکورباتپراکسیداز (APX)
فعالیت این آنزیم به روش ناکانو و آسادا [Nakano and Asada, 1981] با اندکی تغییرات مورد سنجش قرار گرفت.
2-11-8-1- بافرهای سنجش آنزیم APX برای 100 میلی لیتر
25 میلی مولار بافر فسفات+1/ میلی مولارEDTA +5/ میلی مولار آسکوربیک اسید+10 میلی مولار آب اکسیژنه
K2HPO4 =/1×/025×174.18 =/43545gr
KH2PO4 =/1×/025×136/09=/34gr
EDTA= /1×/1×10-3×372/24=/0037224gr
ASA=/1×/5×10-3×176/13=/0088065gr
H202=/01×100ml=10×v2→v2=/1022ml
→/1×1000= 100میکرولیتر
EDTA و ASA به طور جداگانه یکبار به KH2PO4 و یکبار به K2HPO4 اضافه می کنیم و مرحله آخر به هر دو H2O2 اضافه کرده و هر کدام را به حجم 100 سی سی می رسانیم.
PH = 7 61 baz + 39 acid

2-11-8-2- سنجش فعالیت آنزیم APX
سنجش فعالیت آنزیم از طریق اندازه گیری اکسید شدن آسکوربات توسط اسپکتروفتومتر در طول موج 290 نانومتر برای مدت زمان 1 دقیقه انجام شد، بلانک (با حجم نیم میلی لیتر) حاوی 490 میکرولیتر از بافر 25 میلی مولارو 10 میکرولیتر بافرفسفات50 میلی مولار،و نمونه (با حجم نیم میلی لیتر) حاوی 490 میکرولیتر از بافر فسفات 25 میلی مولار و 10 میکرولیتر از عصاره آنزیمی و پس از بهمزدن (یعنی با گذاشتن پارافیلم بر روی کووت، یک بار کووت را سروته می کنند) سرعت واکنش آنزیمی به صورت تغییرات جذب بر زمان (OD/min) در طول موج nm290 برای 1 دقیقه ثبت گردید.
اگر تغییرات جذب بر زمان (OD/min) را به ثابت mM-1cm-18/2 تقسیم کنیم فعالیت آنزیمی بهدست می آید. [Nakano and Asada, 1981].
2-11-9- سنجش آنزیم کاتالاز (CAT)
فعالیت این آنزیم به روش چنس و ماهلی [Chance and Maehly, 1955] با اندکی تغییرات مورد سنجش قرار گرفت.
2-11-9-1- بافرهای سنجش آنزیم CAT
25 میلی مولار بافر فسفات+1/ میلی مولارEDTA +10 میلی مولار آب اکسیژنه
K2HPO4 =/1×/025×174.18 =/43545gr
KH2PO4 =/1×/025×136/09=/34gr
EDTA= /1×/1×10-3×372/24=/0037242gr
H202=/01×100ml=10×v2→v2=/1022ml
→/1×1000= 100میکرولیتر
EDTA یکبار به KH2PO4 و یکبار به K2HPO4 اضافه می کنیم و مرحله آخر به هر دو H2O2 اضافه کرده و هر کدام را به حجم 100 سی سی می رسانیم.
PH = 7 61 baz + 39 acid

2-11-9-2- سنجش فعالیت آنزیم CAT
سنجش فعالیت آنزیم از طریق اندازه گیری تجزیه آب اکسیژنه توسط اسپکتروفتومتر در طول موج 240 نانومتر برای مدت زمان 1 دقیقه انجام شد، بلانک (با حجم نیم میلی لیتر) حاوی 495 میکرولیتر از بافر فسفات 25 میلی مولار و 5 میکرولیتر بافر فسفات50 میلی مولار، نمونه (با حجم نیم میلی لیتر)، حاوی 495 میکرولیتر از بافر فسفات 25 میلی مولار و 5 میکرولیتر از عصاره آنزیمی و پس از بهمزدن (یعنی با گذاشتن پارافیلم بر روی کووت، یک بار کووت را سروته می کنند) سرعت واکنش آنزیمی به صورت تغییرات جذب بر زمان (OD/min) در طول موج nm240 برای 1 دقیقه ثبت گردید.
Arnon D.S. 1940. Copper enzyme in isolated chloroplast polyphenol oxidase in Beta vulgaris. Journal Plant Physiology. 24: 1-15.

پرولین
Bates, L.S., R.P. Waldren and L.D. Teare. 1973. Rapid determination of free proline for water-stress studies. Plant Soil 39:205-207.
استخراج عصاره
Beauchamp, C. and I. Fridovich, 1971. Superoxide dismutase: improved assays and applicable to acrylamide gels. Anal Biochemistry. 44: 276-287.
Sod
Giannopolitis, C. N and S. K Ries. 1977. Superoxide dismutases. I. Occurrence in higher plants. Plant Physiology. 59: 309-314.

Pod
Cesar Ferreira, L., A. Catarina Cataneo, M. Ramazzini Remaeh, N. Corniani, T. de Fumis, Y. Andréo de Souza, J. Scavroni, B.José Aparecido Soares, 2010. Nitric oxide reduces oxidative stress generated by lactofen in soybean plants. Pesticide Biochemistry and Physiology. 97: 47-54

APX
Nakano, Y. and K. Asada. 1981. Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidases in spinach chloroplasts. Plant Cell Physiology. 22: 867-880

CAT
Chance, B., and A.C.Maehly. 1955. Assay of catalase and peroxidase. Methods in Enzymology. 2:764-775
1. Formazan
—————

————————————————————

—————

————————————————————