بسمه تعالی
اسپکتروفتومتر در بیوشیمی
کاربرد اسپکترو فتو متری در بیو شیمی
اسپکتروفتومتری
بوسیله اسپکتروفتومتر شدت رنگ محلولها را با دقت اندازه گیری می کنند.
دستگاههائی که برای رنگ سنجی به کار برده می شوند الکتروفتومترو یا اسپکتروفتومتر نامیده می شوند.
اکثریت قریب به اتفاق سنجش های بیوشیمیایی به روش های کالریمتری و یا اسپکتوفتومتری انجام می پذیرد،که بر اساس ارتباط بین شدت جذب نور (absorbance) و یا عبور نور (transmittance) توسط غلظت های مختلف از ماده مورد نظر،بنا شده است.
بطور کلی هر اسپکتروفتومتر:
یک منبع نورانی،
یک وسیله ایجاد نور تکرنگ با طول موج مشخص
یک سلول یا لوله مخصوص برای جادادن محلول رنگی
، یک سلول فتوالکتریک و یک گالوانومتر دارد.
اندازه گیری غلظت یک محلول
به دو روش می توان غلظت یک محلول را اندازه گیری کرد:
الف) از راه اندازه گیری نوری که از محلول رنگی خارج می شود و
به آن ،Transmitance ،یا عبور می گویند؛
ب) اندازه گیری مقدار نوری که جذب محلول رنگی می شود و به آن دانسیته اپتیک (OPTICAL DENSITY) O.D یا آبسوربنس می گویند.
الف) دانسیته اپتیک یا آبسوربنس
نوری که از یک محلول رنگی عبور می کند مقداری از آن جذب محلول رنگی می شود .
اگر Io شدت نور اولیه و I شدت نور خارج شده از محلول باشد بنابراین I a شدت نوری است که جذب محلول رنگی گردیده است.
Ia = I – Io
Log Io – log I =OD = Absorbanc
logI/I0=OD
(1) log I0/I=OD
جذب از دو قانون پیروی می کند:
مطابق قانون بیرولامبرت (BEER & LAMBERT) هنگامیکه نور یک رنگ از محلول رنگی عبور میکند مقدار نوری که به وسیله محلول جذب می شود ویا مقدار نوری که از محلول خارج می شود؛
به غلظت ماده رنگی موجود در محلول
به ضخامت لوله ایکه نور از آن عبور کرده بستگی دارد.یعنی:
OD=KCL = جذ ب
قانون بیر لامبرت
logIo/I= KCL
که در آن K ضریب جذب ماده مورد آزمایش، C غلظت جسم مورد آزمایش و L قطر لوله می باشد و چون معمولاً قطر لوله را مساوی یک سانتی متر اختیار میکنند بنابراین خواهیم داشت: OD= log I0/I=KC
K یا ضریب جذب ماده برای مواد مختلف فرق می کند و به آسانی قابل اندازه گیری است.
نحوه درجه بندی دستگاه اسپکتروفوتومتر
روی صفحه مدرج دستگاه در قسمت بالا درصد نور عبور کرده یا ترانسمیتانس
در قسمت پائین درست در مقابل درجات ترانسمیتانس OD،یا ابز ربنس قرار می هند.
، درجات میزان عبور همه با هم مساوی است.
درجات O D به علت لگاریتمی بودن نامساوی هستند.
روش کار و اندازه گیری جذب یک محلول
آزمایش 1 – بهترین طول موج برای اندازه گیری غلظت یک محلول رنگی چیست؟
می دانید که از تجزیه نور سفید نورهای مختلف رنگی حاصل می شود که در قسمت مرئی دارای طول موجهای زیر می باشد.
بنفش 420-430، آبی470-490، سبز520-550 ، زرد580
انتخاب طول موج مناسب جهت اندازه گیری جذب
محلول مورد آزمایش رادرمعرض تابش نورهایی با طول موجهای مختلف قرارداده OD های قرائت شده را یادداشت می کنیم.
نمودار جذب برحسب طول موج را رسم می کنیم.
طول موج منا سب ،طول موجی است که ماکز یمم جذب را دارد.
دو نکته: عملی
1 – در قرائت OD نتایج، زمانی قابل اطمینان است که:
0.7 < OD <0.1
بنابر این غلظت مجهول اگر زیاد باشد باید آنرا با حلال مربوطه طوری رقیق نمود که OD آن در حدود بیان شده قرار گیرد.
در این صورت ضریب رقت را باید در محاسبه منظور نمود.
2 – اگر قرائت OD چندین مجهول پشت سر هم بخواهد انجام گیرد در فواصل قرائت باید دستگاه را با شاهد (BLANK) روی صفر OD تنظیم نمود.
سایر اصطلاحات در اسپکتروفتومتری
معرفها
موادی هستند که حداکثر میزان ناخالصی مواد شیمیایی را مشخص می کنند.
محلولهای استاندارد
اداره ملی استاندارد از طریق دفتر مواد مرجع استاندارد،کالج پاتولوژیستهای آمریکا وکمیته استانداردهای
آزمایشگاههای بالینی ،استانداردهای آزمایشگاهای بالینی مواد شیمیایی را تعیین می کند واین محلولها دارای مقدار
نرمال از مواد شیمیایی هستند.
بلانک
لوله شاهد است وهمیشه مقدار آن در اسپکتروفوتومتر صفر است.
آزمایش شماره 1:اندازه گیری گلوگز خونGlucose
معمولا گلوکز خون به صورت ناشتا در سرم خون وریدی اندازه گیری می شود روش های متعددی برای اندازه گیری گلوکز وجود دارد. این روش ها به دو روش کلی شیمیایی و کیت های آنزیمی تقسیم می شوند مهمترین روش شیمیایی اندازه گیری گلوکز روش ارتو تولو ئیدین است. اندازه گیری گلوکز به دو روش آنزیمی دقیق تر واختصاصی تر است .در روش های آنزیمی اثر عوامل مداخله کننده در آزمایش به حداقل می رسد . سه روش آنزیمی برای اندازه گیری گلوکز طراحی شده است که عبارتند از :
1- روش گلوکز اکسیداز(GOD) 2- روش گلوکز دهیدروژناز 3- روش هگزوکیناز
آزمایش قندها یا گلوسیدها
قندها یا ساکاریدها را به سه دسته تقسیم می کنند:
دسته اول – منوساکاریدها
پلی الکلهای 3 تا 7 کربنی هستند که یکی از عاملهای الکلی به عامل کربنیل تبدیل شده است و به ترتیب آنها را تریوز – تتروز- پنتوز- هگزوز- هپتوز می نامند.
منوساکاریدها ممکن است دارای عامل آلدئیدی یا ستنی باشند که در حالت اول آلدوز و در حالت دوم ستوز نامیده می شوند.
مهمترین پنتوزها: آرابینوز – گزیلوز – ریبوز و…
مهمترین هگزوزها: گلوکز-مانوز-گلاکتوز-فروکتوز … می باشند.
دسته دوم – الیگوساکاریدها
از الیگو ساکاریدها، دی ساکاریدها دارای اهمیت بیشتری هستند.
بعضی از دی ساکاریدها دارای خاصیت احیاکنندگی می باشند مانند: مالتوز و لاکتوز.
برخی دیگر دارای خاصیت احیاء کنندگی نیستند. مانند ساکارز یا سوکروز.
دسته سوم – پلی ساکاریدها
مهمترین پلی ساکاریدها شامل نشاسته، سلولز و گلیکوژن می باشد.
هدف آزمایش: اندازه گیری گلوکز خون اساس آزمایش: روش گلوکز اکسیداز ( GOD ) پاراآمینوفنازن ( PAP )
آنزیم گلوکز اکسیداز باعث اکسیداسیون گلوکز وتولید H2O2 یا آب اکسیژنه می شود که در حضور این آنزیم پارا آمینوفنازن و فنل کمپلکس صورتی رنگی ایجاد می کند که در طول موج 500 نانومتر جذب دارد شدت رنگ حاصل ومیزان جذب با مقدار گلوکز نمونه رابطه مستقیم دارد.
وسایل مورد نیاز برای آزمایشاندازه گیری گلوکز خون :
1 – لوله آزمایش
2 – معرف شماره 1
3 – معرف شماره 2 ( محلول استاندارد گلوکز )
4 – سمپلر 10 میکرولیتری یا λ50 وλ1000
5 – نمونه سرم
6 – سر سمپلر
7 – بن ماری
8 – اسپکتروفوتومتر
روش انجام آزمایش :
سه لوله آزمایش برداشتیم سپس روی لوله اول تست وروی لوله دوم استاندارد و روی لوله سوم بلانک نوشتیم سپس درون هر سه لوله یک میلی لیتر از معرف شماره 1 ریختیم سپس ده میکرولیتر معرف شماره 2 به لوله استاندارد اضافه کردیم سپس ده میکرولیتر از نمونه سرم به لوله تست اضافه کردیم بعد از این مراحل سه لوله را 15 دقیقه دربن ماری 37 درجه سانتیگراد قرار دادیم سپس توسط اسپکتروفوتومتر جذب آنها را در طول موج nm500 قرائت کردیم وسپس غلظت گلوکز نمونه را توسط فرمول زیر محاسبه کردیم.
محاسبه:
غلظت گلوکز سرم
مقادیر طبیعی:110-70میلی گرم درصد
تفسیر: این فرد دارای میزان نرمال گلوگز میباشد.
گلوکزاوری
گلوکز اوری glucosuria یعنی وجود گلوکز در ادرار .
گلیکوز اوری glycosuria یعنی وجود هر نوع قندی .
جواب مثبت کاذب ممکن است در بیمارانیکه سالیسیلات، مورفین و بعضی از داروهای دیگر خورده اند، دیده شود.
به طور معمول یک انسان سالم حداکثر یک گرم گلوکز از راه ادرار دفع مینماید
درگلوکزاوری مقداری گلوکز دفع شده از این مقدار بیشتر است.
گاهی گلوکز به طور اتفاقی از ادرار دفع می شود که در حالات، هیجان، شوک، تحریک، ورزشکاران در ورزش های سنگین،
15 درصد از بیمارانی که گلوکز در ادرار دارند، مربوط به بیماری قند نیست.
جستجوی گلوکز در ادرار
طریقه آزمایش:
5 میلی لیتر معرف بندیکت در لوله آزمایش ریخته و روی آن 8 تا 10 قطره ادراربریزید.
1-2 دقیقه روی شعله نگاه دارید..
اگر گلوکز در ادرار زیاد باشد تمام محتوی لوله زرد آجری شده و رسوب می کند ، اگر مقدار آن متوسط باشد دارای رسوب و رنگ آن کاملاً آجری می شود .
اگر مقدار آن کم باشد، زرد مایل به سبز می شود