نقش هورمون های استروئیدی جنسی زنانه در برخی مسیرهای پیام رسانی سیتوکین ها بعد از آسیب تروماتیک مغزی

فهرست مندرجات
عنوان ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….صفحه
چکیده 1

فصل اول: مقدمه و اهداف
1-1) مقدمه 3
2-1) بیان مساله و اهمیت موضوع 7
3-1) هدف کلی طرح 8
4-1) اهداف اختصاصی یا ویژه طرح 8
5-1) اهداف کاربردی طرح 9
6-1) فرضیات یا سوالات پژوهش (با توجه به اهداف طرح) 9

فصل دوم: مروری بر متون
1-2) آسیب تروماتیک مغزی 10
2-2) شیوع TBI 10
3-2) علل TBI 10
4-2) شدت آسیب 10
5-2) طبقه بندی TBI 11
6-2) مراحل آسیب مغزی در TBI 11
1-6-2) آسیب اولیه مغزی 11
2-6-2) آسیب مغزی ثانویه 12
1-2-6-2) جریان خون مغزی 12
2 -2-6-2) وازواسپاسم مغزی 13
3 -2-6-2) مصرف اکسیژن 13
4-2-6-2) تحریک سمی و استرس اکسیداتیو 13
5-2-6-2) التهاب 14
6-2-6-2) تخریب سد خونی-مغزی 15
7-2-6-2) خیز 16
8-2-6-2) فشارداخل جمجمه ای(ICP) 16
9-2-6-2) نکروز و آپوپتوز 17
7-2) سیتوکین ها 18
1-7-2) سیتوکین ها و ضربه مغزی 19
2-7-2) مسیرهای پیام رسانی سیتوکین ها 20
3-7-2) مولکول های پایین دست پیام رسانی سیتوکین ها 20
1-3-7-2) مولکول STAT-3 20
2-3-7-2) مولکول SOCS-3 21
3-3-7-2) مولکول های NFκB-P52، NFκB-P65 وIκBα 23
8-2) استروژن 24
1-8-2) مکانیسم های حفاظت عصبی استروژن 24
9-2) پروژسترون 26
1-9-2) مکانیسم های حفاظت عصبی پروژسترون 27

فصل سوم: مواد و روش ها
1-3) حیوان های مورد آزمایش 28
2-3) گروه های مورد مطالعه 28
3-3) وسایل و مواد 29
1-3-3) وسایل 29
2-1-3-3) وسایل استفاده شده در آزمایشگاه ایمونوهیستوشیمی(IHC) 30
2-3-3) مواد 31
1-2-3-3) مواد مورد استفاده در آزمایشگاه التهاب عصبی 31
2-2-3-3) مواد مورد استفاده در آزمایشگاه ایمونوهیستوشیمی (IHC) 32
3-2-3-3) بافرهای مورد استفاده در آزمایشگاه IHC 33
4-3) روش های استفاده شده در پژوهش 34
1-4-3) روش برداشتن دو طرفه تخمدان 34
2 -4-3) اینتوباسیون (لوله گذاری داخل نای) 35
3-4-3) القاء ضربه مغزی 36
4-4-3) اندازه گیری میزان خیز مغزی با اندازه گیری محتوای آب مغز 37
5-4-3) روش اندازه گیری سلول های دارای مولکول های مسیر پیام رسانی سیتوکین ها 38
1-5-4-3) فیکس بافت مغز 38
2-5-4-3) قالب گیری (تهیه بلوک های پارافینی) 39
3-5-4-3) برش گیری 41
4-5-4-3) رنگ آمیزی IHC 42
1- مرحله رتریوال 43
2- مرحله پراکسیداز 44
3- مرحله آنتی بادی اولیه 44
بافت کنترل مثبت مولکول ها 44
4-مرحله آنتی بادی ثانویه 44
5-مرحله کروموژن (واکنش رنگی) 44
6-رنگ آمیزی هسته ها 45
7-مونت کردن اسلاید 45
6-4-3) روش استخراج اطلاعات از اسلاید ها 46
5-3) تجزیه و تحلیل آماری 46

فصل چهارم: نتایج
الف) تغییرات خیز مغزی (BWC) در حیوانات گروه های مختلف 47
ب) یافته های مولکولی با روش رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی (IHC) 53
درصد p-STAT-3 Positive Cells در گروه های مختلف حیوانات 53
درصدSOCS-3 Positive Cells در گروه های مختلف حیوانات 61
درصد NFκB-P52 Positive Cells در گروه های مختلف حیوانات 69
درصد p-NFκB-P65 Positive Cells در گروه های مختلف حیوانات 77
درصد p-IκBα Positive Cells در گروه های مختلف حیوانات 85
آنالیز p-STAT-3 Positive Cells بر اساس نوع سلول 93
آنالیز SOCS-3 Positive Cells بر اساس نوع سلول 94
آنالیز NFκB-P52 Positive Cells بر اساس نوع سلول 95
آنالیز p-NFκB-P65 Positive Cellsبر اساس نوع سلول 96
آنالیز p-IκBα Positive Cells بر اساس نوع سلول 97

ج) یافته های هیستوپاتولوژی با روش رنگ آمیزی ……………………… ……………………………………H&E98
تغییرات درصد ادم بافت مغز در گروه های مختلف حیوانات………………………………………………………………………………………………………………………….98
تغییرات درصد احتقان بافت مغز در گروه های مختلف حیوانات……………………………………………………………………………………………………………………105
تغییرات درصد دژنراسیون نورونی در گروه های مختلف حیوانات…………………………………………………………………………………………………………………112
تغییرات درصد آپوپتوز نورونی در گروه های مختلف حیوانات……………………………………………………………………………………………………………………..119
تغییرات درصد گلیوز در گروه های مختلف حیوانات…………………………………………………………………………………………………………………………………..126

فصل پنجم: نتیجه گیری و بحث
بحث 128
الف) اثر استروئیدهای جنسی بر روی خیز مغزی بعد از TBI 128
ب) اثراستروئیدهای جنسی بر روی سلول های حاوی STAT-3 p- 131
ج) اثراستروئیدهای جنسی بر روی سلول های حاوی SOCS-3 134
د) اثراستروئیدهای جنسی بر روی سلول های حاوی NFκB 136
ﻫ) اثراستروئیدهای جنسی بر روی سلول های حاوی p-IκBα 138
نتیجه گیری 142
پیشنهادات 143
فهرست منابع 144

فهرست جداول

جدول1-4: تجزیه و تحلیل رنگ آمیزیIHC برای مولکول p-STAT-3 در مغز موش های صحرایی به دنبال TBI……………………………………………………93
جدول2-4: تجزیه و تحلیل رنگ آمیزیIHC برای مولکول SOCS-3 در مغز موش های صحرایی به دنبال TBI………………………………………………………..94
جدول3-4: تجزیه و تحلیل رنگ آمیزیIHC برای مولکول NFκB-P52 در مغز موش های صحرایی به دنبال TBI …………………………………………………95
جدول4-4: تجزیه و تحلیل رنگ آمیزیIHC برای مولکولp-NFκB-P65 در مغز موش های صحرایی به دنبال TBI ……………………………………………..96
جدول 5-4: تجزیه و تحلیل رنگ آمیزیIHC برای مولکول p-IκBα در مغز موش های صحرایی به دنبال TBI………………………………………………………..97
فهرست تصاویر

تصویر1-3: اوارکتومی دو طرفه حیوان…………………………………………………………………………………………………………………………34
تصویر2-3: لوله گذاری داخل نای حیوان قبل از القای ضربه مغزی………………………………………………………………………………………………35
تصویر3-3: پلیت گذاری سر حیوان پیش از اعمال ضربه مغزی…………………………………………………………………………………………………..36
تصویر4-3: دستگاه القاء ضربه مغزی……………………………………………………………………………………………………………………………..37
تصویر5-3: فیکس کردن مغز حیوانات در ظروف حاوی فرمالین10%………………………………………………………………………………………38
تصویر6-3: دستگاه TISSUE PROCESSOR…………………………………………………………………………………………………………………………………………40
تصویر7-3: دستگاه PARAFFIN DISPENSER………………………………………………………………………………………………………….40
تصویر 8-3: بلوک های پارافینی حاوی بافت مغز با کدهای ویژه………………………………………………………………………………………………………………………………41
تصویر 9-3: دستگاه MICROTOM……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….42
تصویر10-3: جار مخصوص رتریوال………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………43
تصویر11-3: آنتی بادی های اولیه و ثانویه خریداری شده از شرکت Santa Cruz Biotechnology………………………………………………………………..45
تصویر12-3: فرم جمع آوری اطلاعات پاتولوژی…………………………………………………………………………………………………………………………46
تصویر 13-4: مقایسه سلول های p-STAT-3 مثبت یافت شده در مغز با رنگ آمیزی IHC (100×)در گروه های مختلف……………………………………….53

تصویر14-4: مقایسه سلول های p-STAT-3مثبت یافت شده در مغز با رنگ آمیزی IHC (100×) در گروه های مختلف……………………………………….54
تصویر 15-4: مقایسه سلول های SOCS-3مثبت یافت شده در مغز با رنگ آمیزی IHC (100×) در گروه های مختلف………………………………………….61
تصویر16-4: مقایسه سلول های SOCS-3مثبت یافت شده در مغز با رنگ آمیزی IHC (100×) در گروه های مختلف……………………………………………62
تصویر17-4: مقایسه سلول های NFκB-P52مثبت یافت شده در مغز با رنگ آمیزی IHC (100×) در گروه های مختلف……………………………………..69
تصویر18-4: مقایسه سلول های NFκB-P52مثبت یافت شده در مغز با رنگ آمیزی IHC (100×) در گروه های مختلف……………………………………..70
تصویر19-4: مقایسه سلول های p-NFκB-P65 مثبت یافت شده در مغز با رنگ آمیزی IHC (100×) در گروه های مختلف………………………………..77
تصویر20-4: مقایسه سلول های p-NFκB-P65مثبت یافت شده در مغز با رنگ آمیزی IHC (100×) در گروه های مختلف…………………………………..78
تصویر 21-4: مقایسه سلول های p-IκBα مثبت یافت شده در مغز با رنگ آمیزی IHC (100×) در گروه های مختلف…………………………………………..85
تصویر 22-4: مقایسه سلول های p-IκBα مثبت یافت شده در مغز با رنگ آمیزی IHC (100×) در گروه های مختلف……………………………………………86
تصویر 23-4: مقایسه ادم بافت مغز با رنگ آمیزیH&E (40×)، 24 ساعت پس از TBI در گروه های مختلف…………………………………………………….98
تصویر 24-4: مقایسه احتقان بافت مغز با رنگ آمیزیH&E (40×)، 24 ساعت پس از TBI در گروه های مختلف……………………………………………….105
تصویر 25-4: مقایسه دژنراسیون نورونی بافت مغز با رنگ آمیزیH&E (40×)، 24 ساعت پس از TBI در گروه های مختلف………………………………112
تصویر 26-4: مقایسه آپوپتوز نورونی بافت مغز با رنگ آمیزیH&E (40×)، 24 ساعت پس از TBI در گروه های مختلف……………………………………119
تصویر 27-4: گلیوز بافت مغز با رنگ آمیزیH&E (40×)، 24 ساعت پس از TBI در گروه درمانیP2…………………………………………………………………126
فهرست نمودارها

نمودار1-4: مقایسه محتوای آب مغز (%) در گروه های مختلف مطالعه………………………………………………………………………………………………………………………..47
نمودار2-4: مقایسه محتوای آب مغز (%) در گروه های TBI،Veh، E1و E2……………………………………………………………………………………………………………48
نمودار3-4: مقایسه محتوای آب مغز (%) در گروه های TBI، Veh، P1و P2…………………………………………………………………………………………………………..49
نمودار4-4: مقایسه محتوای آب مغز (%) در گروه های TBI، Veh+Vehو E2+P1………………………………………………………………………………………………50
نمودار5-4: مقایسه محتوای آب مغز (%) در چهار گروه درمانی E1 ، E2،P1 و P2……………………………………………………………………………………………………..51
نمودار6-4: مقایسه محتوای آب مغز (%) در سه گروه درمانی E2، P1و P1 E2+………………………………………………………………………………………………………..52
نمودار7-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های p-STAT-3مثبت یافت شده در مغز (%) در گروه های مختلف مطالعه…………………………………………………55
نمودار8-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های p-STAT-3 مثبت مغز (%) در گروه های TBI،Veh ،E1 و E2………………………………………………………..56
نمودار9-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های p-STAT-3مثبت در مغز (%) در گروه های TBI،Veh ، P1و P2…………………………………………………….57
نمودار10-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های p-STAT-3 مغز (%) در گروه های TBI، Veh+Vehو E2+P1…………………………………………………..58
نمودار11-4: مقایسه میانگین تعداد سلول ها یp-STAT-3 مثبت مغز (%) در چهار گروه E1 ، E2،P1 و P2……………………………………………………………59
نمودار12-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های p-STAT-3 مغز (%) در سه گروه درمانی E2،P1 و P1 E2+…………………………………………………………….60
نمودار 13-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های SOCS-3 مثبت مغز (%) در گروه های مختلف مطالعه……………………………………………………………………….63
نمودار14-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های SOCS-3 مثبت مغز (%) در گروه های TBI،Veh ،E1 و E2………………………………………………………….64
نمودار15-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های SOCS-3 مثبت مغز (%) در گروه هایTBI ، Veh، P1و P2…………………………………………………………..65
نمودار16-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های SOCS-3مثبت مغز (%) در گروه هایTBI ، Veh+Vehو E2+P1…………………………………………………66
نمودار17-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های SOCS-3مثبت مغز (%) در چهار گروه درمانی E1 ، E2،P1 وP2…………………………………………………………67
نمودار18-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های SOCS-3مثبت مغز (%) در سه گروه درمانی E2،P1 و P1 E2+…………………………………………………………..68
نمودار 19-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های NFκB-P52مثبت مغز (%) در گروه های مختلف مطالعه…………………………………………………………………….71
نمودار20-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های NFκB-P52 مثبت مغز (%) در گروه های TBI،Veh ، E1و E2……………………………………………………….72
نمودار21-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های NFκB-P52 مثبت مغز (%) در گروه هایTBI،Veh ، P1و P2……………………………………………………….73
نمودار22-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های NFκB-P52مثبت مغز (%) در گروه هایTBI، Veh+Vehو E2+P1…………………………………………….74
نمودار23-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های NFκB-P52مثبت مغز (%) در چهار گروه درمانی E1 ، E2،P1 و P2…………………………………………………..75
نمودار24-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های NFκB-P52مثبت مغز (%) در سه گروه درمانی E2،P1 و P1 E2+……………………………………………………76
نمودار25-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های p-NFκB-P65مثبت مغز (%) در گروه های مختلف مطالعه………………………………………………………………….79
نمودار26-4: مقایسه میانگین تعداد سلول ها ی p-NFκB-P65مثبت مغز (%) در گروه هایTBI ،Veh ،E1 وE2…………………………………………………..80
نمودار27-4: مقایسه میانگین تعداد سلول هایp-NFκB-P65 مثبت مغز (%) در گروه های TBI، Veh،P1 و P2…………………………………………………….81
نمودار28-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های p-NFκB-P65مثبت مغز (%) در گروه هایTBI، Veh+Vehو E2+P1…………………………………………82
نمودار29-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های p-NFκB-P65مثبت مغز (%) در چهار گروه درمانی منفرد E1 ، E2،P1 و P2 ………………………………… 83
نمودار30-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های p-NFκB-P65مثبت مغز (%) در سه گروه درمانی E2، P1 و P1 E2+……………………………………………….84
نمودار31-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های p-IκBα مثبت مغز (%) در گروه های مختلف مطالعه……………………………………………………………………………87
نمودار32-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های p-IκBα مثبت مغز (%) در گروه های TBI، Veh ،E1 و E2…………………………………………………………….88
نمودار33-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های p-IκBα مغز (%) در گروه های TBI، Veh،P1 و P2………………………………………………………………………89
نمودار34-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های p-IκBαمغز (%) در گروه هایTBI ، Veh+Vehو E2+P1…………………………………………………………..90
نمودار35-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های p-IκBα مثبت مغز (%) در چهار گروه درمانی E1 ، E2،P1 و P2…………………………………………………………91
نمودار36-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های p-IκBαمثبت مغز (%) در سه گروه درمانیE2 ،P1 و P1 E2+……………………………………………………………92
نمودار37-4: مقایسه میزان ادم بافت مغز (%) در گروه های مختلف مطالعه …………………………………………………………………………………………………99
نمودار38-4: مقایسه میزان ادم بافت مغز (%) در گروه هایTBI، Veh ، E1و E2………………………………………………………………………………..100
نمودار39-4: مقایسه میزان ادم بافت مغز (%) در گروه هایTBI،Veh ،P1 وP2…………………………………………………………………………………..101
نمودار40-4: مقایسه میزان ادم بافت مغز (%) در گروه های TBI، Veh+Vehو E2+P1………………………………………………102
نمودار41-4: مقایسه میزان ادم بافت مغز (%) در چهار گروه درمانی E1، E2،P1 و P2 ………………………………………………..103
نمودار 42-4: مقایسه میزان ادم بافت مغز (%) در سه گروه درمانی E2،P1 و P1 E2+…………………………………………………….104
نمودار 13-4: مقایسه میزان احتقان بافت مغز (%) در گروه های مختلف مطالعه………………………………………………………………….106
نمودار44-4: مقایسه میزان احتقان بافت مغز (%) در گروه هایTBI، Veh،E1و E2……………………………………107
نمودار45-4: مقایسه میزان احتقان بافت مغز (%) در گروه هایTBI، Veh،P1 و P2……………………………108
نمودار46-4: مقایسه میزان احتقان بافت مغز (%) در گروه هایTBI، Veh+Vehو E2+P1………………………..109
نمودار47-4: مقایسه میزان احتقان بافت مغز (%) در چهار گروه درمانی E1 ، E2،P1 و P2…………………………….110
نمودار48-4: مقایسه میزان احتقان بافت مغز (%) در سه گروه درمانی E2،P1 و P1 E2+………………………….111
نمودار49-4: مقایسه میزان دژنراسیون نورون های مغز (%) در گروه های مختلف مطالعه…………………………………………………………………………..113
نمودار50-4: مقایسه میزان دژنراسیون نورون های مغز (%) در گروه هایTBI، Veh، E1و E2………………………………………114
نمودار51-4: مقایسه میزان دژنراسیون نورون های مغز (%) در گروه هایTBI، Veh،P1 و P2…………………………………………115
نمودار52-4: مقایسه میزان دژنراسیون نورون های مغز (%) در گروه هایTBI، Veh+Vehو E2+P1……………………………116
نمودار53-4: مقایسه میزان دژنراسیون نورون های مغز (%) در چهار گروه درمانیE1 ، E2،P1 و P2……………………117
نمودار 54-4: مقایسه میزان دژنراسیون نورون های مغز (%) در سه گروه درمانی E2،P1 و E2+P1…………………………….118
نمودار55-4: مقایسه میزان آپوپتوز نورون های مغز (%) در گروه های مختلف مطالعه………………………………………………………….120
نمودار56-4: مقایسه میزان آپوپتوز نورون های مغز (%) در گروه هایTBI،Veh ،E1و E2 …………………………………………….121
نمودار57-4: مقایسه میزان آپوپتوز نورون های مغز (%) در گروه هایTBI، Veh، P1و P2……………………………………..122
نمودار58-4: مقایسه میزان آپوپتوز نورون های مغز (%) در گروه هایTBI ، Veh+Vehو E2+P1…………………………123
نمودار59-4: مقایسه میزان آپوپتوز نورون های مغز (%) در چهار گروه درمانی E1، E2،P1 و P2………………………………124
نمودار60-4: مقایسه میزان آپوپتوز نورون های مغز (%) در سه گروه درمانی E2،P1 و P1 E2+ ……………………………….125
نمودار61-4: مقایسه میزان گلیوز در بافت مغز (%) در گروه های مختلف مطالعه…………………………………………………………………………………127

چکیده

مقدمه و هدف: آسیب تروماتیک مغزی (TBI)، یکی از دلایل عمده آسیب و مرگ در سراسر جهان است. مطالعات نشان داده هورمون های استروئیدی جنسی دارای اثرات حفاظت عصبی بر ترومای مغزی تجربی هستند. خیز مغزی یک عامل حیاتی در مرگ و میر ناشی از TBI می باشد، اما هنوز مکانیسم های آن به خوبی شناخته نشده و درمان آن ممکن نشده است. مطالعات اخیر، آثار سودمند درمان با هورمون های جنسی زنانه را در حیوانات تایید کرده اند، لیکن هنوز مکانیسم اثر آن ها شناخته نشده است. این پژوهش بدین منظور طراحی شده که مشخص شود آیا هورمون های استروئیدی جنسی زنانه می توانند از طریق اثر بر مسیر پیام رسانی سیتوکین ها، عملکرد آن ها را تحت تاثیر قرار داده و از این طریق اثرات ضد التهابی بعد از TBI را اعمال کنند؟
مواد و روش ها: این پژوهش مداخله ای – تجربی بر روی 10 گروه موش صحرایی ماده (با وزن 250-200 گرم) که هر گروه شامل شش زیرگروه بود، انجام شد. گروه ها به ترتیب عبارت بودند از: 1-کنترل، 2-شم، 3-TBI، 4-حلال، 5- حلال+حلال، 6-استروژن با دز کم (E1)، 7-استروژن با دز زیاد (E2)، 8-پروژسترون با دز کم (P1)، 9-پروژسترون با دز زیاد (P2) و 10-E2+P1. دو هفته بعد از اوارکتومی، ضربه مغزی منتشر(از نوع متوسط)، به روش مارمارو (Marmarou) با وزنه 300 گرمی، در گروه های10-8 ایجاد شد و تزریق حلال و داروها در گروه های 4 تا 10، نیم ساعت بعد از اعمال ضربه مغزی و به صورت داخل صفاقی انجام گردید. محتوای آب بافت مغز، به عنوان شاخصی از خیز مغزی، 24 ساعت بعد از القاء ضربه مغزی اندازه گیری شد. هم چنین درصد سلول های مغزی حاوی پنج مولکول: p-STAT-3،SOCS-3 ،NFκB-P52 ،p-NFκB-P65 و p-IκBα درگروه های مختلف مطالعه، با روش ایمونوهیستوشیمی(IHC) ، سنجیده شد و در مورد هر مولکول، سلول های بروز دهنده، به تفکیک در آستروسیت، میکروگلیا و نورون، بررسی گردید. در پایان شاخص های هیستوپاتولوژیک: ادم بافتی، احتقان، دژنراسیون نورونی، آپوپتوز نورونی و گلیوز با استفاده از رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین، در تمام گروه های حیوانات مورد بررسی قرار گرفت.
یافته ها: نتایج مطالعه نشان داد بعد از TBI، خیز مغزی افزایش می یابد که این افزایش، توسط مصرف انفرادی یا مصرف ترکیبی استروئیدها کاهش پیدا می کند. تعداد سلول های p-STAT-3مثبت یافت شده در مغز، بعد از TBI افزایش نشان داد. این افزایش فقط توسط E2 مهار شد، که بیشترین اثر مهاری بر روی نورون ها در مقایسه با میکروگلیا یا آستروسیت ها اعمال می گردید. اگرچه تعداد سلول های SOCS-3 مثبت در مغز، بعد از TBI تغییر پیدا نکرد، اما E2 و هم چنین E2+P1 افزایش در سلول های با SOCS-3 مثبت را موجب شد. هم چنین یاخته هدف برای این اثر استروژن، میکروگلیا و آستروسیت بود. از طرفی تعداد سلول های NFκB-P52 مثبت مغز، تحت تاثیر TBI قرار نگرفت، اما E2 توانست سلول های با NFκB-P52 مثبت را کاهش دهد که این اثر به طور یکسان بر روی هر سه نوع سلول مغزی اعمال شد. تعداد سلول هایp-NFκB-P65 مثبت مغز بعد از TBI افزایش یافت و E2، کاهش این سلول ها را بعد از TBI موجب شد. ضمناً E1 آستروسیت ها را برای اعمال اثر خود انتخاب نموده بود. درصد p-IκBα Positive Cells بعد از TBI، تغییر پیدا نکرد، اما E2 تعداد این سلول ها را کاهش داد و این اثر مهاری به طور یکسانی بر روی یاخته های مختلف مغزی اعمال گردید. هم چنین پس از اعمال TBI، شاخص های ادم بافتی، احتقان، دژنراسیون نورونی و آپوپتوز نورونی، افزایش یافتند. E1 بیش از بقیه گروه های درمانی، احتقان را کم کرد و در کاهش سایر فاکتورها، E2 بهتر عمل نمود.
نتیجه گیری: با توجه به نتایج فوق اولاً هورمون موثر، دز زیاد استروژن می باشد که وقتی به صورت ترکیب با پروژسترون مصرف می شود، در بسیاری از موارد اثرات آن از بین می رود و ثانیاً به نظر می رسد که یکی از مکانیسم های احتمالی حفاظت عصبی(کاهش خیز مغزی) استروژن بعد از TBI، از طریق اثرگذاری بر روی مسیر پیام رسانی سیتوکین های التهابی یعنی کاهش مولکول های p-STAT-3،NFκB-P52 ،p-NFκB-P65 و p-IκBα و یا افزایشSOCS-3 می باشد.
کلید واژه ها: آسیب تروماتیک مغزی، خیزمغزی، محتوای آب مغز، استروژن، پروژسترون، مولکولp-STAT-3، مولکولSOCS-3، مولکولNFκB-P52 ، مولکولp-NFκB-P65، مولکول p-IκBα، ادم بافتی، احتقان، دژنراسیون نورونی، آپوپتوز نورونی و گلیوز.

1-1) مقدمه
آسیب تروماتیک مغزی1(TBI)، که به آن آسیب داخل جمجمه ای2 هم گفته می شود، هنگامی به وجود می آید که یک نیروی خارجی به مغز آسیب وارد نماید (Helps et al., 2008). TBI را می توان براساس شدت، مکانیسم و یا سایر ویژگی ها طبقه بندی کرد(Finnie, 2001). علل ایجاد TBI عبارتند از: پرت شدن از ارتفاع، سوانح رانندگی، ورزش و خشونت. سالانه در آمریکا حداقل 5/1میلیون نفر به علتTBI به اورژانس مراجعه می کنند. از این تعداد 50 هزار نفر می میرند، 235 هزار نفر بستری می شوند و 1/1میلیون نفر درمان شده وترخیص می گردند. حدود90 -80 هزار نفر از این بیماران از نقص دائمی و یا نوعی معلولیت رنج می برند، با تمام این اوصاف هنوز درمان ثابت کلینیکی برای آن وجود ندارد (Wang et al., 2006).
آسیب های ایجاد شده پس از TBI به دو دسته اولیه و ثانویه تقسیم می شوند. از جمله آسیب های اولیه که بلافاصله پس از تروما رخ می دهد، می توان به از بین رفتن انسجام بافتی، تخریب سد خونی- مغزی3(BBB)، خیز4، رهایش سیتوکین ها، التهاب و آزاد شدن رادیکال های آزاد اشاره نمود. تغییرات ثانویه ساعت ها، روزها و ماه ها پس از تروما رخ می دهد و شامل تغییرات فوق و نیز تغییرات دیگری مانند پیشرفت خیز ثانویه، هیپرپلازی و هیپرتروفی سلول های گلیا، فعال شدن سلول های التهابی، رهایش فاکتورهای نوروتروفیک، تجمع رادیکال های آزاد اکسیژن، آپوپتوز و دژنراسیون نورونی است (Chong et al., 2005).
خیز مغزی تجمع آب در فضای داخل و خارج سلولی است. خیز مغزی پس از TBI یافته شایعی است که اساساً به دو نوع تقسیم می شود: 1- خیز وازوژنیک5: که به دلیل تخریب سد خونی-مغزی(BBB) ایجاد می شود. مایع داخل عروقی از طریق اندوتلیوم (پینوسیتوز) یا اتصالات نشتی خارج می شود. 2- خیز سیتوتوکسیک6: که تجمع آب در داخل نورون ها، میکروگلیا و آستروسیت هاست (Klatzo, 1967).
خیز باعث تورم سلولی می شود که به دنبال آن غلظت متابولیت های سلولی تغییر می کند و در نتیجه فیزیولوژی، بیولوژی و عملکرد سلولی تغییر می کند. تخریب سد خونی- مغزی، از مهم ترین پیش نیازهای تشکیل خیز مغزی است. هردو نوع خیز باعث افزایش فشار داخل جمجمه ای7(ICP) و در نتیجه کاهش فشار پرفیوژن مغزی8(CPP) می شود که منجر به ایسکمی بافتی می گردد (Marmarou, 2004). ایسکمی نیز باعث گشادی عروق9 از طریق مکانیسم های خودتنظیمی می شود که برای بازگرداندن خونرسانی مغزی طراحی شده اند. پس از TBI، خودتنظیمی در اکثر بیماران مختل می شود یا از دست می رود.
TBI یک بیماری پیچیده نورودژنراتیو است که مسیرهای سلولی و ملکولی زیادی از جمله التهاب را درگیر می کند (Ziebell and Morganti-Kossmann, 2010). آزاد شدن ترکیبات مختلف هم چون سیتوکین های التهابی از سلولهای موجود در گردش خون و نیز سلول های مقیم در سیستم عصبی مرکزی شامل میکروگلیاها و آستروسیت ها، منجر به آشکار شدن پاسخ های التهابی در سیستم عصبی مرکزی می گردد. سیتوکین ها اثرات پیش برنده التهاب و ضد التهاب دارند (Mellergård et al., 2011). سیتوکین های پیش برنده التهاب از قبیل: اینترلوکین10های IL-6 وIL-1β ، فاکتور نکروز تومور آلفا11(TNF-α) و اینترفرون12(INF) ها بعد از آسیب بافتی و ایسکمی آزاد شده و واکنش های التهاب را تنظیم می کنند. در مقابل گروه دیگری از سیتوکین ها مثل: IL-4، IL-10، IL-13 و فاکتور تغییر شکل بتاβ)13 TGF-)، باعث کاهش التهاب می گردند و سیتوکین های ضدالتهاب نامیده می شوند (Cederberg and Siesjö, 2010). حفظ تعادل و موازنه بین سیگنال های پیش برنده التهاب و ضدالتهاب، برای شروع یک پاسخ ایمنی مناسب، مهم است (Brown et al., 2010b).
17-بتا استرادیول (E2) و پروژسترون آثار حفاظت عصبی14و ضد التهابی در مدل های تجربی آسیب مغزی انجام شده در شرایط in vivo و in vitro نشان داده اند (Arevalo et al., 2010, Johann and Beyer, 2013). ثابت شده است که استروژن و پروژسترون آثار حفاظت عصبی وابسته به جنس در ایسکمی و TBIایفا می کنند. هورمون های جنسی زنانه باعث حفاظت عصبی بعد ازTBI از قبیل حفاظت از سد خونی- مغزی (Chen et al., 2005, Soltani et al., 2009)، کاهش استرس اکسیداتیو بعد از جراحت (Chen et al., 2005) و خیز می شوند (Soltani et al., 2009). گزارش شده است که موش های صحرایی ماده بالغ در مقایسه با موش های نر بالغ دچار مرگ و میر کمتر و آسیب نورونی کمتری به دنبال ایسکمی مغزی می شوند (Groswasser et al., 1998). هم چنین در مطالعات مشخص شده که هم استروژن و هم پروژسترون قادر به کاهش خیز مغزی و حفاظت از سد خونی مغزی(Brann et al., 2007) و کاهش فشار داخل جمجمه ای (Shahrokhi et al., 2010) بعد از TBI می باشند؛ علاوه بر این، نتایج تحقیقات گروه التهاب عصبی در آزمایشگاه ما نشان داده است که مصرف توام استروژن و پروژسترون نیز دارای توانایی برای حفاظت در برابر آسیب های TBI در موش صحرایی ماده می باشد (Soltani et al., 2009, Shahrokhi et al., 2010).
پاسخ التهابی به دنبال TBI همراه با رهایش میانجی های التهابی مثلIL-1β ، TNF-α و6 IL-از یاخته های مغزی طی چند دقیقه بعد از جراحت است؛ استروژن آزاد سازی سیتوکین ها را از انواع متعددی از سلولها، مهار می کند. مطالعات نشان داده اند که یائسگی با افزایش تولید سیتوکین های التهابی از قبیل اینترلوکین ها و TNF-α همراه است و استروژن مقدار سیتوکین های پیش برنده التهاب را در زنان بعد از یائسگی کاهش می دهد (Ralston et al., 1990, Abu-Taha et al., 2009)؛ علاوه بر این استروژن، باعث کاهش بیان mRNA مربوط بهIL-6 ، به دنبال التهاب می گردد (Cerciat et al., 2010). مصرف استروژن باعث کاهش 1β IL- و افزایش تولید 15 IL-1raدر 24 ساعت بعد از ایسکمی می گردد. بنابراین تعدیل نسبت IL-1ra/IL-1β توسط استروژن، ممکن است در اثر ضد التهابی استروژن نقش داشته باشد (Choi et al., 2008). اگر استروژن فوراً بعد از برداشتن تخمدان مصرف شود، تولید سیتوکین های پیش برنده التهاب را در سیستم عصبی مرکزی و محیطی، بعد از TBI کاهش می دهد (Khaksari et al., 2010b). پروژسترون می تواند باعث کاهش سیتوکین های التهابی پس از TBI شود و از این طریق موجب کاهش ادم مغز گردد (He et al., 2004a).
مولکول انتقال دهنده پیام و فعال کننده رونویسی شماره316(STAT-3)، یکی از پروتئین های سیتوپلاسمی است که به عنوان فاکتورهای انتقال پیام و رونویسی عمل کرده و در پاسخ های طبیعی سلولی به سیتوکین ها و فاکتورهای رشد شرکت دارد. در پاسخ به تحریک گیرنده سیتوکینی،STAT-3 فعال شده و بیان ژن را القا می کند، بدین طریق به دنبال فسفریله شدن تیروزین توسط سیتوکین ها، پروتئین STAT-3 دایمر شده وارد هسته می گردد و ژن های هدف خاصی را تحریک می کند (Campbell, 2005).
مولکول سرکوب گر انتقال پیام سیتوکین شماره 317(SOCS-3)، یکی از اعضای جدید خانواده مهارگران انتقال پیام در مسیر JAK/STAT18 می باشد و قادر است فعالیت STAT-3را مهارکند. STAT-3 وSOCS-3 به وسیله محرکهای التهابی مانندLPS19 و TNF-α فعال می شوند و مهم تر اینکه فعال سازیSOCS-3 مستقل ازSTAT-3 نیز می تواند صورت گیرد (Meisel et al., 1996). مشخص شده که پس از التهاب، مولکول SOCS-3و STAT-3 در هر سه گروه سلول میکروگلیا، آستروسیت ها و نورون ها دیده می شوند (Yang et al., 2007).
فاکتور هسته ای کاپا بی20(NFκB)، پروتئینی است که از هومو و هترو دایمرهای پنج عضو از خانواده Rel شامل: NFκB1 (p50)، NFκB2 (p52)، Rel A (p65)، Rel B و c-Rel (Rel)، تشکیل شده است (Heissmeyer et al., 2001). این مولکول دارای ترکیبات مختلف است و از اعضای خانواده فاکتورهای رونویسی می باشد. این خانواده عمدتاً در پاسخ های استرس، ایمنی و التهاب دخیل است و نقش محوری در التهاب دارد. NFκB یکی از مسیرهای اصلی است که مواد التهاب زا آن را به کار می برند. یکی از این هترودایمرها P52-P65 NFκB می باشدکه در مسیر انتقال پیام سیتوکین ها وارد هسته شده و رونویسی از DNA را برای ژن ها خصوصاً ژن مولکول های دخیل در التهاب انجام می دهد (Baldwin, 1996). فرم فسفریله P65- NFκB، فاکتور آماده برای دایمر شدن وفعال کردن روند التهابی می باشد.
دایمرهای NFκB در سیتوزول سلولهای تحریک نشده، از طریق پیوند غیر کووالانسی با یک گروه پروتئین های مهاری به نامI-κBs 21 غیرفعال می باشند. IκBα یکی از اعضای این خانواده پروتئین های سلولی است که عمل آن مهار NFκB می باشد. IκBα از طریق اتصال به NFκB باعث نگهداری فرم غیر فعال آن ها در داخل سیتوپلاسم می شود. علاوه براین IκBα توانایی NFκB را برای اتصال به DNA نیز مهار می کند. سیگنال هایی که فعالیتNFκB را القا می کنند، سبب فسفریله شدن IκBα شده و به دنبال آن باعث تجزیه وتخریب توالی آن ها وجدایی از NFκBمی شوند و به این ترتیب مجموعه NFκB اجازه فعالیت یافته و وارد هسته می شود. بنابراین همه عواملی که موجب فسفریلاسیون مولکول IκBα می شوند، تحریک سنتز عوامل التهاب زا را موجب می گردند (Baeuerle, 1998).
گزارش شده است که مسیر پیام رسانی22 سیتوکین ها نیز می تواند تحت تاثیر هومون های استروئیدی جنسی زنانه قرار گیرد که از جمله می توان به مطالعات زیر اشاره کرد:
استروژن می تواند مسیر پیام رسانی التهاب زا را از طرق زیر تضعیف کند: 1- جلوگیری از افزایش NFκB در سیتوپلاسم. 2- جلوگیری از انتقال NFκB به داخل هسته. 3- تداخل با اتصال NFκB به.DNA 4- مهار فعالیت آنزیمIKKα 23 (آنزیم فسفریله و تخریب کنندهIκBα )، که منجر به کاهش تخریبIκBα شده و ورود NFκB را به هسته مهار می کند (Shih et al., 2006). استروژن خونریزی زیر آراکنوئید را از طریق تداخل24 باNFκB ، مهار می کند و این از مسیرهایی است که استروژن با التهاب مبارزه می کند (Shih et al., 2006). دو مسیر کینازJNK 25وP3826، جزء 4 زیرگروه اصلی خانواده پروتئین کینازهای فعال کننده میتوژن27(MAPKs) می باشند که در انتقال پیام های صادره از سیتوکین های پیش برنده التهاب نقش دارند. در یک مطالعه، 17-بتا استرادیول به طور معنی داری فعالیت JNK و P38 Kinase را کاهش داد. نتایج این مطالعه هم چنین نشان داد که آثار حفاظت سلولی 17-بتا استرادیول روی آسیب ایسکمی/ خونرسانی مجدد (I/R)، توام با تعدیل انتخابی مسیرهای MAPK می باشد (Vilatoba et al., 2005). گزارش شده است که استروژن با مسیر JAK/STAT تداخل می نماید، به طوری که گزارش شده است که هپاتیت C را از طریق مهارJAK/STAT تضعیف می نماید (Leong et al., 2004b). علاوه بر این گزارش شده است که استروژن، میزانSTAT دفسفریله را افزایش می دهد (Liu et al., 2002). استروژن هم چنین بیان کبدی SOCS-2 و SOCS-3 را احتمالاً از طریق فعال کردن مسیرهای نسخه برداری موجب می شود (Leong et al., 2004b). بیان شده است در حالی که استروژن باعث افزایشSOCS-1 و3-SOCS در موش های ماده فاقد تخمدان می شود، پروژسترون ها را کاهش می دهد (He et al., 2004b). گزارش شده کهP65 -NFκB بعد از جراحت مغزی در حیوانات افزایش پیدا می کند، که این افزایش در حیوان هایی که بعد از جراحت، پروژسترون دریافت می کنند، جلوگیری می شود (Pettus et al., 2005). بیانNFκB-P65 و TNF-α در اثر پروژسترون پس از اعمالTBI ، کاهش یافته است (Pan et al., 2007). نتایج بالا معرف این هستند که هورمون های استروئیدی جنسی زنانه از طریق مکانیسم های فوق، می توانند مسیر پیام رسانی سیتوکین ها را تنظیم کنند.
2-1) بیان مساله و اهمیت موضوع

آمار آسیب های مغزی در دنیا بالاست، اما در ایران به دلیل آمار بالای تصادفات جاده ای، این آسیب ها فراوانی بیشتری دارد، به طوری که در سال 1386 بیش از 22918 نفر در کشور در تصادفات جاده ای جان باختند و این در حالی است که در کشور سوئد مرگ و میر ناشی از تصادفات، سالانه 200-150 مورد است (اقتصاد, 1387).
خیز مغزی کنترل نشده علت بسیاری از ناتوانی ها و مرگ ومیرهای همراه با TBI است. التهاب، باعث بیان سریع واسطه های التهابی مثل سیتوکین ها، کموکین ها و پروستاگلاندین می شود.
استروژن یک هورمون استروئیدی مشتق از کلسترول است که اغلب به عنوان یک تنظیم کننده تولید مثل شناخته می شود اما در رشد، تمایز، بلوغ و عملکرد بافت های مختلف از جمله سیستم عصبی مرکزی نقش دارد. هم چنین این هورمون نقش حفاظتی در برابر آسیب های مغزی داشته و در حافظه و یادگیری شرکت می کند (Brann et al., 2007).
17- بتا استرادیول، بسیاری از اعمال خود را از دو مسیر اعمال می کند: 1-مسیر ژنومیک(کلاسیک) 2-مسیر غیر ژنومیک(غیر کلاسیک). بسیاری از اعمال استروژن از طریق گیرنده های کلاسیک یعنی گیرنده های آلفا و بتا انجام می شوند.گیرنده های استروژن (ERs)، هم در مسیرهای پیام رسانی کلاسیک نقش دارند و هم در مسیرهای غیر کلاسیک. مسیرهای کلاسیک کپی برداری از ژن را مستقیماً از طریق عناصر پاسخ دهنده به استروژن28(EREs)، تحت تاثیر قرار می دهند. در مقابل مسیر غیر کلاسیک، به صورت غیر وابسته به عناصر پاسخ دهنده به استروژن، کپی برداری از طریق سایر عناصر مثل: NFκB و یا از طریق گیرنده های متصل به غشا و پیک های ثانویه تحت تاثیر قرار می دهد. در مجموع یافته ها نشان می دهند که استروژن اعمال ضدالتهابی خود را با واسطه هر دو گیرنده آلفا و بتا انجام می دهد (Bryant et al., 2005).
تزریق دز فیزیولوژیک هر دو هورمون جنسی باعث کاهش نفوذپذیری سدخونی- مغزی و تشکیل خیز می گردد (O'Connor et al., 2005). هم چنین مشخص شده که مصرف توام استروژن و پروژسترون باعث کاهش خیز مغزی و بهبود پیامدهای نورولوژیک می شود (Soltani et al., 2009). در ادامه مطالعات قبلی انجام شده در گروه تحقیقاتی التهاب عصبی که نشان داده شد، استروژن و پروژسترون باعث تغییر در میزان سیتوکین های التهاب زا در سیستم عصبی مرکزی شدند.
با توجه به اینکه اثرات استروژن بر آسیب های ایسکمی مغزی و التهاب، شناخته شده است، اما مکانیسم های اثر سلولی و ارتباط استروژن با میانجی های شناخته شده در پیدایش التهاب عصبی و ایسکمی مغزی به درستی اثبات نشده است، در مطالعه حاضر به دنبال این هستیم که این فرضیه را مورد آزمون قرار دهیم که آیا هورمون های استروئیدی جنسی زنانه می توانند، از طریق مکانیسم های جدید برشمرده در بالا با اثر بر پیام رسانی سیتوکین ها، عملکرد آن ها را تحت تاثیر قرار داده و از این طریق اثرات ضد التهابی بعد از TBI را اعمال کنند؟
3-1) هدف کلی طرح:

تعیین نقش هورمون های استروئیدی جنسی زنانه دربرخی مسیرهای پیام رسانی سیتوکین ها بعد از آسیب تروماتیک مغزی منتشر درموش های صحرایی ماده.
4-1) اهداف اختصاصی یا ویژه طرح:

1- مقایسه محتوای آب مغز در گروه های مختلف مطالعه
2- مقایسه درصد سلول های دارای مولکول p-STAT-3 در مغز گروه های مختلف مطالعه
3- مقایسه درصد سلول های دارای مولکولSOCS-3 در مغز گروه های مختلف مطالعه
4- مقایسه درصد سلول های دارای مولکول NFκB-P52در مغز گروه های مختلف مطالعه
5- مقایسه درصد سلول های دارای مولکول p-NFκB-P65در مغز گروه های مختلف مطالعه
6- مقایسه درصد سلول های دارای مولکول p-IκBα در مغز گروه های مختلف مطالعه
7- مقایسه درصد سلول های دارای مولکول هایp-STAT-3،SOCS-3،NFκB-P52 ،p-NFκB-P65 و p-IκBα در مغز گروه های مختلف مطالعه
8- مقایسه درصد ادم بافتی، احتقان، دژنراسیون نورونی، آپوپتوز نورونی و گلیوز در مغز گروه های مختلف مطالعه

5-1) اهداف کاربردی طرح:

از آن جایی که هورمون های جنسی زنانه نقش حفاظت عصبی(نوروپروتکتیو) بعد از جراحت مغزی را اعمال می کنند و با توجه به اینکه این هورمون ها اعمال حفاظتی را از طریق تغییر در تولید سیتوکین ها انجام می دهند، امید است که نتایج این مطالعه پایه بتواند راه گشای تحقیقات بعدی باشد.
6-1) فرضیات یا سوالات پژوهش (با توجه به اهداف طرح):
1- محتوای آب مغزی، در مغز گروه های مختلف تفاوت ندارد.
2- درصد سلول های دارای مولکول p-STAT-3 در مغز گروه های مختلف مطالعه تفاوت ندارد.
3- درصد سلول های دارای مولکول SOCS-3 در مغز گروه های مختلف مطالعه تفاوت ندارد.
4- درصد سلول های دارای مولکول NFκB-P52 در مغز گروه های مختلف مطالعه تفاوت ندارد.
5- درصد سلول های دارای مولکول p-NFκB-P65در مغز گروه های مختلف مطالعه تفاوت ندارد.
6- درصد سلول های دارای مولکول p-IκBα در مغز گروه های مختلف مطالعه تفاوت ندارد.
7- درصد سلول های دارای مولکول های p-STAT-3،SOCS-3 ،NFκB-P52 ، p-NFκB-P65وp-IκBα در مغز گروه های مختلف مطالعه تفاوت ندارد.
8- درصد ادم بافتی، احتقان، دژنراسیون نورونی، آپوپتوز نورونی و گلیوز در مغز گروه های مختلف مطالعه تفاوت ندارد.

1-2) آسیب تروماتیک مغزی
مرکز کنترل بیماری های امریکا، آسیب تروماتیک مغزی (TBI)29 را چنین تعریف می کند: آسیب به سر( ناشی از آسیب های ضربه ای یا نفوذی و یا حاصل نیروهای شتابی افزایشی یا کاهشی) که همراه با علائم و نشانه های مربوط به آسیب است مثل: کاهش سطح هوشیاری، فراموشی، اختلالات نورولوژیک و یا نوروسایکولوژیک، شکستگی جمجمه، آسیب های تشخیص داده شده داخل جمجمه ای و یا مرگ (Thurman et al., 1999).
2-2) شیوع TBI
TBI از عوامل مهم مرگ و میر در افراد زیر 45 سال است و بیشترین موارد آن در کشورهای با درآمد پایین و متوسط رخ می دهد (Hofman et al., 2005). شیوع جهانی TBI در جهان حدود 200 در هر 100000 نفر با مرگ و میر 20 در هر 100000 نفر گزارش شده است (Reilly, 2007). در ایران سالانه بیش از 15000 مورد مرگ مغزی در اثر ضربه مغزی ناشی از حوادث رخ می دهد (پیری, 1383). گزارش ها از اروپا و استرالیا برای بستری در بیمارستان و آسیب سری کشنده حدود 235 در 100000 نفر، امریکا 103 در 100000 نفر و هند 160 در 100000نفر بوده است (Selladurai and Reilly, 2007).
3-2) علل TBI
کشورهای مختلف دارای توزیع متفاوتی از علل TBIهستند. هر چند یکی از شایع ترین دلایل، حوادث جاده ای مربوط به موتورسواران است، پرت شدن و برخورد ها و جرایم فیزیکی از دیگر علل شایع هستند. وقوع TBI به علت سقوط در دو گروه: جوان ترین و مسن ترین افراد، حداکثر می باشد (Andelic et al., 2008). حوادث رانندگی در جاده ها، از دلایل آسیب های سری در بیشتر کشورها هستند (Jennett, 1996). کشور های مختلف انواع مختلف حوادث جاده ای را مسئول این مرگ ها گزارش کرده اند. آمار جدید نشان می دهد در کشورهای توسعه یافته، شیوع TBI ناشی از آسیب های سری مربوط به حوادث جاده ای کاهش یافته است.
4-2) شدت آسیب
رایج ترین شیوه تقسیم بندی شدت آسیب در انسان ها، معیار گلاسکوی کوما (GCS)30 است که معیاری جهت تعیین سطح هوشیاری بیمار است و بر اساس آن بیماران TBI به سه دسته آسیب: خفیف31 (GCS بالاتر از 13)، متوسط32 (GCS بین 9 و12) و شدید33 (GCS پایین تر از 13) تقسیم می شوند (Wang et al., 2006). به منظور تقلید از این دسته بندی کلینیکی، تحقیقات آزمایشگاهی مدل های آسیب خود را به نحوی طراحی کردند که ترومای ایجاد شده در طیف وسیعی از شدت آسیب قرار گیرد.
5-2) طبقه بندی TBI
در سال 2001 مدل های حیوانی TBIتوضیح داده شده و TBI را به دو دسته موضعی34 یا منتشر35 و اولیه36 یا ثانویه37 تقسیم کردند (Finnie, 2001). آسیب کانونی از نظر آسیب شناسی با کوفتگی و پارگی ها و اغلب با هماتوم توام است. در مقابل واژه "آسیب منتشر" زمانی به کار می رود که خیز منتشر مغزی، آسیب ایسکمی مغزی و آسیب منتشر آکسونی (DAI)38 ایجاد شود (Gennarelli et al., 1982).
6-2) مراحل آسیب مغزی در TBI:
1-6-2) آسیب اولیه مغزی
آسیب مغزی اولیه آسیب اجتناب ناپذیر مغز است که بلافاصله پس از ضربه به وجود می آید و عبارت است از آسیب بافتی و اختلال در تنظیم CBF39و متابولیسم. این حالت باعث تجمع اسید لاکتیک ناشی از گلیکولیز بی هوازی، افزایش نفوذ پذیری غشا و تشکیل خیز می گردد (Gennarelli et al., 1982).
هر دو آسیب سری موضعی و منتشر دارای بخش های اولیه و ثانویه هستند. آسیب های موضعی شامل هماتوم اپی دورال، ساب دورال، له شدگی و پارگی بافت مغزی و هماتوم در داخل بافت مغزاست. آسیب منتشر شامل آسیب ترومایی اکسون40 می باشد که ناشی از آسیب مغزی ترومای متوسط تا شدید است (Vink et al., 2003). ترکیب این آسیب ها به شدت آسیب اولیه و سایر آسیب های همراه صدمات مثل هیپوکسی و هیپوتانسیون و ویژگی های فردی بیمار بستگی دارد (Gennarelli et al., 1982). به علت اتمام ذخایر ATP و نارسایی پمپ های غشایی، بافت وارد مرحله ثانویه آسیب می گردد .(Morganti-Kossmann et al., 2007b)
2-6-2) آسیب مغزی ثانویه
روند آسیب ثانویه پیچیده است و شامل آبشار فرایندهای بیوشیمیایی است که ساعت ها تا ماه ها پس از TBI به وقوع می پیوندد و با آسیب اولیه به بافت مغز از جمله نورون ها و سلول های گلیا آغاز می شود. فرایندهای سلولی آغاز شده ممکن است به خیز یا مرگ سلولی منجر شوند و پس از آن با شروع روند التهابی نوروژنیک، عملکرد سلول ها و عروق تحت تاثیر قرار گیرد. سپس اثرات آسیب ثانویه و خیز به صورت کلینیکی با افزایش فشار درون جمجمه ای تظاهر می کنند که باعث کاهش فشار پرفیوژن مغزی و کاهش خون رسانی مغز می شود. بخش بزرگی از مرگ و میرهای ناشی از TBI به علت بروز آسیب های ثانویه در بافت مغز است (Gwinnutt and Carroll, 2005).
در سطح سلولی، طبیعت دو مرحله ای آسیب ثانویه به وسیله مسیرهای آشفته شده بی شماری وساطت می شود که از آن جمله می توان موار زیر را نام برد: الف- سمیت تحریکی که به وسیله افزایش ماده میانجی گلوتامات و آسپارتات ایجاد می شود، ب- تولید رادیکال های آزاد به وسیله اختلال عمل میتوکندری، که باعث آسیب به پروتئین ها و غشاهای فسفولیپیدی نورون ها و گلیاها می شود، ج- پاسخ التهابی عصبی که بر اثر فعال شدن سیستم ایمنی سیستمیک و سیستم ایمنی 41CNS، ایجاد می شود (Morganti-Kossmann et al., 2007b).
هیپوکسی و هیپوتانسیون مستقیماً با اکسیژن رسانی مغز مرتبطند (Gwinnutt and Carroll, 2005) و از لحاظ بالینی رایج ترین علت های آسیب مغزی ثانویه می باشند که هر دو شرایط در صورتی که سریع تشخیص داده شده و درمان شوند قابل برطرف شدن هستند (Morganti-Kossmann et al., 2007a). در مجموع تجزیه غشای سلولی و عروقی نهایتاً باعث آپوپتوز و نکروز می گردد (Morganti-Kossmann et al., 2007b).
1-2-6-2) جریان خون مغزی
تحقیقات نشان داده که ایسکمی کلی یا کانونی مغزی از مراحل اولیه تا تاخیری پس از TBI رخ می دهد. ارتباط زیاد بین هیپوپرفیوژن مغزی و پیامد پایین، نشان دهنده این است که TBI و سکته ناشی از ایسکمی در بسیاری از موارد دارای مکانیسم های مشابهی هستند (Werner and Engelhard, 2007).
بیماران مبتلا به TBI ممکن است در مراحل اولیه آسیب، هیپوپرفیوژن مغزی را نشان دهند. به همین ترتیب ممکن است به دنبال ایسکمی پس از تروما، پرخونی به وجود آید. این افزایشCBF بیش از حد تقاضای متابولیک، مرتبط با فلج عروق مغزی42 است که باعث افزایش حجم خون مغزی و در نتیجه افزایش ICP می شود (Kelly et al., 1997). هم ایسکمی و هم پرخونی بر عدم تناسب بین CBF و متابولیسم مغزی دلالت دارند.
2 -2-6-2) وازواسپاسم مغزی
وازواسپاسم مغزی پس از تروما یک آسیب ثانویه مهم است که در بیش از 30% بیمارانTBI رخ می دهد و نشان دهنده شدت آسیب مغزی است. وازواسپاسم مغزی سرنوشت نهایی بیمار را تعیین می کند و مکانیسم های ایجاد آن عبارتند از:
1-کاهش فعالیت کانال پتاسیم، در نتیجه، دپلاریزاسیون مزمن عضله صاف عروق
2-آزاد شدن اندوتلین در راستای کاهش NO دردسترس
3-کاهشcGMP در عضله صاف عروق
3 -2-6-2) مصرف اکسیژن
یکی از ویژگی های TBI، عدم تعادل بین حمل اکسیژن و مصرف اکسیژن مغزی است. مکانیسم های همودینامیک وعروقی مختلفی این عدم انطباق را ایجاد می کنند و نتیجه پایانی مشترک آنها، هیپوکسی مغزی است (Stiefel et al., 2006).
4-2-6-2) تحریک سمی و استرس اکسیداتیو
TBI در مراحل اولیه و ثانویه همراه با رهایش گسترده میانجی های تحریکی به ویژه گلوتامات است. این گلوتامات اضافی در خارج سلول، نورون ها و آستروسیت ها را تحت تاًثیر قرار می دهد (OBRENOVITCH and URENJAK, 1997). استرس اکسیداتیو43 مربوط به تولید نمونه های اکسیژن واکنشی44 (ROS) شامل رادیکال های آزاد اکسیژن، سوپراکسیدها، پراکسیدها، اکسید نیتریک و پراکسی نیتریت، در پاسخ به TBI است. نتیجه نهایی این وضعیت، پراکسیداسیون ساختارهای عروقی و سلولی، اکسیداسیون پروتئین و از هم گسیختگی DNA و مهار زنجیره انتقال الکترون میتوکندری است. هرچند این مکانیسم ها برای مرگ ناگهانی سلول کافی هستند، فرایندهای التهابی و آپوپتیک زودرس توسط استرس اکسیداتیو القا می شوند (Chong et al., 2005).
به نظر می رسد که استرس های اکسیداتیو نقش کلیدی را در تخریب نورونی بعد از TBI داشته باشند. این ترکیبات نه فقط به اجزای سلولی غشای نورونی آسیب می رسانند، بلکه هم چنین به لیپو پروتئین های میلین در ساختار اکسون ها نیز آسیب می رسانند (Gül et al., 2005). دقایقی بعد از TBI افزایش قابل توجه در رادیکال های آزاد باعث اشباع مکانیسم های جاروب گر آندوژنی می شود که می تواند منجر به تخریب لیپیدهای غشا، پروتئین های ضروری و نهایتاً DNA شود که منجر به مرگ سلولی می گردد (Kelso et al., 2011). مشخص شده که تجمع رادیکال های آزاد اکسیژن در عروق نقش مهمی را در آبشار مولکولی درگیر در تخریب سد خونی- مغزی ایفا می کند (Chen et al., 2006). رادیکال های آزاد هم چنین می توانند به سلول های آندوتلیالی آسیب برسانند که به ادم سیتوتوکسیک و وازوژنیک منجر می شود.
5-2-6-2) التهاب
TBI باعث القای طیف وسیعی از پاسخ های التهابی و ایمونولوژیک می شود. هر دو آسیب اولیه و ثانویه باعث رهایش واسطه های سلولی از جمله سیتوکین های پیش التهابی، پروستاگلاندین ها و رادیکال های آزاد می شود. التهاب اساساً یک پاسخ حفاظتی با هدف برطرف کردن عامل اولیه ایجاد آسیب و نیز سلول ها یا بافت های مرده می باشد. بدون التهاب، آسیب برطرف نمی شود اما التهاب، خود، ممکن است آثار زیان باری نیز در پی داشته باشد.
التهاب را می توان بر اساس شدت و زمان آن تقسیم بندی کرد. التهاب حاد طی چند دقیقه تا چند ساعت پس از آسیب بافت ایجاد می شود و با تورم، قرمزی، گرما، درد و از دست رفتن فعالیت قسمت درگیر التهاب، نمود پیدا می کند. فرایندهای عروقی نقش مهمی در ایجاد این نوع التهاب دارند:
ا-تغییر در قطر عروق که منجر به افزایش جریان خون می شود.
2-تغییرات ساختمانی در عروق ریز که به پروتئین های پلاسما و لوکوسیت ها اجازه خروج از گردش خون را می دهد.
3-مهاجرت لوکوسیت ها از عروق کوچک و تجمع آنها در محل ضایعه (Cotron RS, 2003).
التهاب مزمن بر اثر تداوم حضور آنتی ژن ایجاد می شود. تجمع و فعال شدن تک هسته ای ها مشخصه این نوع التهاب است. دیگر مشخصات عمده این نوع التهاب عبارت است از:
1-ارتشاح سلول های تک هسته ای شامل: ماکروفاژها و پلاسما سل ها که نمایان گر نوعی واکنش پایدار به آسیب می باشد.
2-تخریب بافت که عمدتاً ناشی از سلول های التهابی است.
3- سعی در ترمیم از طریق جایگزینی بافت همبند خصوصاً فیبروز، افزایش رگ های خونی کوچک و رگ زایی (Cotron RS, 2003).
پس از TBI آبشار پیچیده ای از وقایع التهابی آغاز می شود . در نهایت این آسیب ها منجر به مرگ سلولی، ایسکمی و خونریزی می گردد (Shein et al., 2007). سطوح IL-1،IL-6 ، IL-8 و IL-10در گردش خون و در مقادیر بالاتر در مایع مغزی-نخاعی (CSF)، بزرگسالان دچار TBI، بالا می رود (Morganti-Kossman et al., 1997, Csuka et al., 1999, Fassbender et al., 2000). در مورد اطفال نیز یافته ها حاکی از افزایش IL-6 وIL-10 در CSF بیماران، یک روز پس از آسیب می باشد (Mellergård et al., 2011).
گزارش های فراوانی حاکی از آن است که مهار التهاب می تواند مرگ سلولی و آسیب ثانویه بافتی را افزایش دهد و به این ترتیب دیدگاه پایه در مورد بدتر شدن شرایط سلول به دنبال التهاب را تغییر داده اند (Suzuki et al., 2009) و مشخص شده که زمان مداخله در کنترل التهاب، حیاتی است (Rosenbaum et al., 1991). سیتوکین های التهابی مانند IL-1β، IL-6 و TNF-α می توانند آسیب ثانویه بافتی را درTBI آغاز کنند اما در مراحل بعدی ممکن است بر خلاف این رفتار نمایند. نتایج مطالعاتی که روی آسیب بافتی غیر سیستم عصبی مرکزی (CNS) انجام شده، احتمال می دهند که شروع پاسخ هاب التهابی منجر به القای فاکتورهای ضد التهاب IL-4، IL-10 و TGF-β در مراحل بعدی می گردد، گرچه مکانیسم آن نامعلوم است (Cederberg and Siesjö, 2010).
لوکوسیت ها و ماکروفاژها از طریق آزاد سازی سیتوکین های پیش التهابی، پروتئازهای سیتوتوکسیک و رادیکال های آزاد اکسیژن باعث فعال سازی میکروگلیاهای موضعی می شوند. کموکین ها، مولکول های چسبنده و سیتوکین های پیش التهابی ازمیکروگلیاهای فعال شده آزاد می شوند (Bondanelli et al., 2005)، که باعث فعال سازی و خیز سلول های CNS و در نهایت باعث افزایش نفوذپذیریBBB45 می شوند. التهاب به دنبال تخریب BBB ممکن است مفید باشد اما فعال شدن بیش از حد فرایندهای التهابی ممکن است منجر به مرگ سلولی شود (Shlosberg et al., 2010).
6-2-6-2) تخریب سد خونی-مغزی
سد خونی-مغزی یک سد عروقی بین سیستم عروقی و پارانشیم مغز است که از سلول های اندوتلیال عروق ریز مغزی، اتصالات محکم اندوتلیال غشای پایه مویرگی و پایک های انتهایی آستروسیت ها تشکیل شده است و مانع از ورود بسیاری از ترکیبات به مغز می گردد. به طور کلی BBB به وسیله سلول های اندوتلیال مغزی شکل گرفته که توسط اتصالات محکم به هم متصل هستند. BBB آسیب دیده منجر به ورود مایع خارج سلولی و تورم کنترل نشده پاهای انتهایی آستروسیت ها طی چند ساعت می گردد. نورون ها هم بسته به درجه آسیب ممکن است متورم گردند. لذا جریان خون عروق کوچک به میزان قابل توجهی آسیب می بیند. ثابت شده است که آسیب BBB، در زمان حاد پس از ضربه (6 ساعت پس از ضربه)، باعث ورود ترکیبات گردش خون شامل: نوتروفیل ها، لنفوسیت ها و مونوسیت / ماکروفاژ ها به سیستم عصبی مرکزی می شود (Cadosch et al., 2010, Ziebell and Morganti-Kossmann, 2010). این سلول های فعال شده، واسطه هایی مانند پروستاگلاندین ها و رادیکال های آزاد و سیتوکین های التهابی را آزاد کرده، کموکین ها و مولکول های چسبنده را القا نموده و باعث تثبیت سلول های ایمنی و گلیاها در ناحیه آسیب دیده می گردند (Lucas et al., 2006). شواهدی وجود دارد مبنی بر اینکه BBB در هر دو شرایط التهابی و غیر التهابی نفوذپذیر است و سلول های ایمنی و التهابی فعال شده از آن عبور می کنند، اگرچه نفوذپذیری در شرایط التهابی بیشتر می باشد (Ziebell and Morganti-Kossmann, 2010).
7-2-6-2) خیز
خیز به تجمع غیرطبیعی مایع در پارانشیم مغزی گفته می شود که به دو نوع وازوژنیک و سیتوتوکسیک تقسیم می شود. هنگامی که مایع منشاء گرفته از خون در اطراف سلول ها تجمع می یابد، خیز از نوع وازوژنیک است و زمانی که در اثر آسیب به سلول ها، در داخل آن ها مایع تجمع می یابد به آن خیز سیتوتوکسیک می گویند. به صورت عمومی پذیرفته شده است که خیز ویژه TBI منشاء وازوژنیک دارد که به دنبال باز شدن تروماتیک سد خونی-مغزی رخ می دهد. انسجام ساختاری و عملکردی BBB که اساس حفظ حجم طبیعی مغز و هومئوستاز مغزی است، پس از TBI آسیب می بیند و افزایش نفوذپذیری سلول های اندوتلیال مویرگی به آلبومین و سایر پروتئین های پلاسمایی، خیز وازوژنیک را ایجاد می کند (DeWitt and Prough, 2003, Unterberg et al., 2004) که یک عارضه جدی TBI می باشد. خیز مغزی وازوژنیک به طور کلاسیک عامل پیشرفت خیز بعد از TBIمی باشد. سلول های آندوتلیال عروق نورونی نسبت به ایسکمی بسیار آسیب پذیر می باشند. طی ایسکمی مغزی، رادیکال های آزد اکسیژن، نیتریک اکسید و پروتئازها آزاد می شوند که منجر به تخریب سد آندوتلیالی و افزایش نفوذ پذیری عروق کوچک مغزی و در نتیجه خیز وازوژنیک می شود (Verkman et al., 2006).
خیز سیتوکسیک به تجمع مداوم مایع داخل سلولی گفته می شود که هم آستروسیت ها و هم نورون ها را درگیر می کند. در ایجاد خیز سیتوتوکسیک در نورون ها و گلیا ها 3 مکانیسم اصلی وجود دارد که شامل: 1- افزایش نفوذ پذیری غشای سلول به + Na وK+ 2- نقص در فعالیت پمپ های یونی فعال مثل -ATPase Na/K 3- جذب مداوم ذرات فعال اسموتیکی می باشد.
8-2-6-2) فشارداخل جمجمه ای(ICP)46
متوسط طبیعی ICP در بزرگسالان در وضعیت خوابیده mmHg 10-0 می باشد. پس از TBI ،ICP افزایش یافته ونتایج نورولوژیک ضعیف تر می شوندMiller . و همکاران (1997) روی علت اولیه مرگ در TBI شدید کار کردند و دریافتند که تقریباً نیمی از آنها ناشی از هایپرتانسیون داخل جمجمه ای بودند (Miller et al., 1977) . بسیاری از محققین نشان داده اند که ICP عامل محکمی برای پیش بینی پیامدهای TBI شدید است و آستانه های درمانی بر پایه این مدرک است و با کنترل سریع ICP افزایش یافته، می توان مانع از آسیب ایسکمی مغز شد و پس از آن کنترل ICP تسهیل می گردد.

9-2-6-2) نکروز و آپوپتوز
دو نوع مختلف مرگ سلولی ممکن است پس از TBI، به وجود آید: نکروز و آپوپتوز (مرگ برنامه ریزی شده سلول). نکروز در پاسخ به آسیب بافتی مکانیکی شدید یا آسیب ایسکمی / هیپوکسی با رهایش شدید میانجی های عصبی تحریکی و نقص متابولیکی به وجود آید. به دنبال آن فسفولیپازها، پروتئازها و لیپیدپراکسیدازها باعث اتولیز47 غشاهای بیولوژیک می شوند. در مقابل نورون هایی که آپوپتوز می شوند، از نظر ساختاری در دوره پس از آسیب، دست نخورده هستند و دارای تولید کافی ATP می باشند که پتانسیل فیزیولوژیک غشایی را فراهم می کند. هرچند آپوپتوز طی ساعت ها یا روزها پس از آسیب اولیه نمایان می شود. جابه جایی فسفاتیدیل سرین منجر به شروع به هم خوردن یکپارچگی غشا همراه با لیز شدن غشای هسته، متراکم شدن کروماتین و شکسته شدن DNA می شود. فعال و غیر فعال شدن متوالی کاسپازها که ارائه گر پروتئازهای خاص از خانواده آنزیم تبدیل کننده اینترلوکین ها هستند، از مهم ترین واسطه های مرگ برنامه ریزی شده سلول شناخته شده است (Eldadah and Faden, 2000, Chong et al., 2005). آبشار التهابی که پس از TBI فعال می شود، به واسطه آزاد شدن سیتوکین های التهابی و ضد التهابی است که پلی پپتید بوده و در شرایط طبیعی به ندرت در بافت سالم دیده می شوند، اما در پاسخ به به شرایط پر استرس و بیماری، بیان آنها افزایش می یابد (Perry et al., 2001, Lucas et al., 2006). در مورد ویژگی عملکردی سیتوکین ها گفته می شود سیتوکین های مشتق از نورون ها اغلب درگیر ارتباطات سلولی اند، در حالی که سیتوکین های سلول های گلیا، واسطه رشد نورونی، بقا و مرمت نورونی هستند (Fan et al., 1995).
در TBI به دلیل از دست رفتن غشای یکپارچه عروق و سلول های پارانشیمی، فاکتورهای نکروز دهنده به سرعت در ناحیه تحت ضربه پیشرفت می کنند و باعث ایجاد نکروز بافتی می شوند. این فرایند در صورتی که با کاهش تامین نیازهای متابولیک (در برابر افزایش تقاضا) و اگزوسیتوتوکسیسیتی48 همراه شود شدیدتر می گرددTBI . هم چنین چرخه سلولی ورود مجدد را در میکروگلیاها، آستروگلیاها و نورون ها فعال می کند که منجر به تشکیل اسکارهای گلیال و بدتر شدن التهاب می شود (Cernak et al., 2005) و نتیجه بعدی آن القاء مسیر انتقال پیام آپوپتز و مرگ سلولی می باشد. موج ثانویه از مرگ سلولی در نتیجه فرایندهای آپوپتوزی در مدل های حیوانی گزارش شده است (Clark et al., 1999). از لحاظ قیاس زمانی، آپوپتوز با زمان بروز التهاب وخیز همراه می باشد. یافته ها نشان می دهند که فرآیندهای التهاب، خیز و افزایش فشار داخل جمجمه ای، به عنوان آغازگرهای آپوپتوز به دنبال TBI می باشند. آپوپتوز سلول های آندوتلیالی به دنبال ضربه در ارتباط با تنظیم کاهشی فاکتورهای ضد آپوپتوز و تنظیم افزایشی فاکتور های پیش برنده التهاب می باشد که در نهایت باعث تخریب BBB و در نتیجه تخریب بیشتر نورنی می شود (Zhang et al., 2005). تحلیل نورونی منجر به نقص نورونی و تشکیل اسکار آستروگلیالی می شود که خود این عامل در ارتباط با نقص عملکردی و اختلال در فرآیند شناختی به دنبال TBI است (Di Giovanni et al., 2005).
7-2) سیتوکین ها
سیتوکین ها گروهی از پروتئین های ترشح شده از سلول ها هستند که به عنوان ابزار ارتباط بین سلول ها به روش های اندوکرین49 ، اتوکرین50 و پاراکرین51 عمل می کنند و در پاتوفیزیولوژی آسیب های التهابی، نقش حیاتی دارند. در طی سال های اخیر به سیتوکین ها توجه بیشتری درجهت فهم تغییرات فیزیولوژیک بعد از تروما یا التهاب شده است. آنها نقش مهمی در مکانیسم های دفاعی و ترمیم به دنبال تروما دارند. TNF-α،IL-1β ،IL-6 ،IL-8 ،IL-12 وIFN-γ مهم ترین سیتوکین های التهابی بعد از تروما هستند و واکنش های التهابی را تنظیم می کنند (Yao et al., 1998, Hildebrand et al., 2005). در مقابل گروه دیگری از سیتوکین ها مثل IL-1Ra، IL-10،IL-13 و TGF-β منجر به کاهش التهاب شده و سیتوکین های ضد التهاب نام دارند. این پروتئین ها توسط ترکیبات موجود در گردش خون شامل نوتروفیل ها، لنفوسیت ها و مونوسیت ها/ ماکروفاژها و نیز سلول های موجود در CNS مانند میکروگلیاها، آستروسیت ها و نورون ها ساخته می شوند و به علت فعالیت در غلظت های کم، شناسایی آن ها مشکل است (Abul Abbas K, 2007).
سیتوکین ها برای فعالیت مناسب CNS در هر دو وضعیت فیزیولوژیک و پاتولوژیک ضروری می باشند (Wang and Campbell, 2002) . آن ها به عنوان مولکول پیام رسان داخل سلولی در شرایط پاتوفیزیولوژیک عمل می کنند. ویژگی مشترک اغلب سیتوکین ها این است که به صورت آبشاری عمل می کنند، دارای عملکرد چند گانه اند و به طور سینرژیک وارد عمل می شوند. افزایش غلظت سیتوکین های پیش برنده التهاب در شرایط پاتوفیزیولوژیک باعث آسیب بافتی و تخریب نورونی می شود (Kadhim et al., 2008). سیتوکین ها از قبل ساخته و ذخیره نمی شوند، بلکه در شرایط پاتوفیزیولوژیک فعال شدن سلول باعث فعال شدن نسخه برداری از ژن های آن ها می شود. این فعال شدن نسخه برداری به صورت گذراست و mRNAکد کننده اغلب سیتوکین ها ناپایدار بوده و از این رو ساخت سیتوکین ها نیزگذرا می باشد (Hanke and Sabel, 2004). سیتوکین ها در بیماری های نورولوژیک دارای نقش دوگانه هستند. مطالعات تجربی دال بر نقش حفاظتی آن ها در فعالیت ایمنی دستگاه عصبی و نیز نقش تخریبی آن ها در ترمیم بافت عصبی وجود دارد (Wahl, 2007). نقش سیتوکین ها در سیستم عصبی مرکزی در اختلالات متعددی از جمله عفونت ها، بیماری و تروما مورد بررسی قرار گرفته است. در دهه گذشته مطالعات متعددی نشان دادند که به دنبال ضربه مغزی، برخی واسطه های ایمنی مثلIL-1،IL-6 ، IL-10، TGF-βو TNF-α افزایش یافته اند.(Maegele et al., 2007a)

1-7-2) سیتوکین ها و ضربه مغزی
مطالعات زیادی تولید سیتوکین ها وفاکتورهای رشد را به دنبال TBI نشان داده اند (Simi et al., 2007b). تغییرات سطح سیستمیک سیتوکین ها شامل IL-1،IL-6 ،IL-8 ،TNF-α و TGF-β به دنبال TBI گزارش شده است، سطح mRNA و غلظت پروتئینی برای این سیتوکین ها بعد از ضربه مغزی به طور معنی داری افزایش می یابد (Morganti-Kossmann et al., 2007b).
خانواده IL-1 باعث القاء سیتوکین ها می شود و نقش مهمی در التهاب نورونی دارد. IL-1 دو نوع گیرنده را تحت تاثیر قرار می دهد (نوع I ونوع II). -1β IL توسط میکروگلیاها تولید می شود و می تواند هم بر سلول های نورونی و هم بر سلول های غیر نورونی اثرکند (Pinteaux et al., 2009). در مدل آسیب نورونی در جوندگان، β IL-1باعث وخیم تر شدن تحلیل نورونی می شود که در ارتباط با اختلال عملکرد BBB می باشد (Vecil et al., 2000). مهار IL-1 توسط تزریق داخل بطنی IL-1ra (آنتاگونیست گیرنده اینتر لوکین-1) باعث کاهش حجم کوفتگی و تخریب نورونی می شود (Jones et al., 2005b). هم چنین تزریق آنتی بادی IL-1α و IL-1βقبل از ضربه مغزی از نوع Weight-drope پیامدهای بعد از ضربه را بهبود بخشید (Lu et al., 2005).
:IL-6 یکی از عوامل مهم در ایجاد پاسخ های فاز حاد TBI ، می باشد. مطالعات نشان دادند که درCNS نقش پیش برنده التهابی آن همراه با ویژگی های تروفیکی و ضد آپوپتیکی آن می باشد بر اساس نقش آن به عنوان سیتوکین پیش برنده التهاب در موش های ترانس ژنیک مشخص شد که افزایش IL-6 باعث التهاب نورونی و آسیب مغزی می شود (Kadhim et al., 2008). در حالی که در چندین نوع از آسیب های مغزی، اثر محافظت نورونی آن از جمله بهبود بقای نورونی،کاهش توکسیسیتی به واسطه52NMDA و حفاظت از نورون در برابر فاکتورهای آپوپتیکی مشخص شده است (Suzuki et al., 2008). در TBI،IL-6 دارای ویژگی های محافظت نورونی می باشد. در یک مطالعه کاهش استرس های اکسیداتیو و مرگ سلولی آپوپتیک و افزایش تسکین بافتی در موش های ترانس ژنیک با بیان افزایش یافته IL-6 در آستروسیت ها، دیده شد (Penkowa et al., 2003).
IL-8 : به عنوان یکی از سیتوکین های اصلی درگیر در TBI به شمار می رود، که توسط انواع سلول ها از جمله نوتروفیل ها، سلول های آندوتلیالی، آستروسیت ها و میکروگلیاها تولید می شود. آزاد سازی IL-8 توسط سایر سیتوکین ها مثل IL-1 تحریک می شود. عواملی مثل هیپوکسی ایسکمیک و پرفیوژن مجدد که مکانسیم های پایه استرس های اکسیداتیو بعد از TBI می باشند، نیز در تحریک آزادسازی IL-8 نقش دارند (Gopcevic et al., 2007).
TNF-α : باعث تنظیم تعدادی از فرایندها در CNS از جمله تکامل نورونی، بقای سلولی، شکل پذیری53 سیناپسی و هومئوستاز یونی می شود. به علاوه TNF-α به عنوان یک هماهنگ کننده پاسخ های التهابی عمل می کند و اختلال در پیام رسانی آن در پاتوفیزیولوژی های CNS دیده شده است (Ramilo et al., 1990). مشخص شده که α-TNF در نقص های شناختی و حسی حرکتی و آسیب بافتی در TBI نقش دارد و مهار فارماکولوژیک و یا ژنتیکی آن باعث بهبود عملکرد شناختی و حرکتی می شود (Bermpohl et al., 2007).
2-7-2) مسیرهای پیام رسانی سیتوکین ها
برای بسیاری از سیتوکین ها، مسیر JAK/STAT برای درک ارتباط سلولی بواسطه سیتوکین ها و پاسخ های بیولوژیک در سیستم عصبی مرکزی، اساسی می باشد. سیتوکین ها واسطه های چند عملکردی ار تباط سلولی هستند. اعمال منحصر به فرد سیتوکین های منفرد، ناشی از فعالیت مسیرهای انتقال پیام سلولی جفت شده با گیرنده ویژه مثل آبشار انتقال پیام تیروزین کینازی JAK/STAT می باشد (Campbell, 2005). JAK/STAT یک مسیر اصلی پیام رسانی واسطه گر پاسخ های سلولی به سیتوکین هاست و نقش کلیدی در پاسخ داخل سلولی به سیتوکین ها بازی می کند. نقش قطعی مسیر پیام رسانی JAK/STATدر انتقال پیام و عملکرد سیتوکین در موش ثابت شده است (Wang and Campbell, 2002).54 JNK وP38 Kinase نیز دو مسیر اصلی کیناز و جزء 4 زیرگروه اصلی خانواده پروتئین کینازهای فعال کننده میتوژن(MAPKs) می باشند که در انتقال پیام های صادره از سیتوکین های پیش برنده التهابی نقش دارند.
3-7-2) مولکول های پایین دست پیام رسانی سیتوکین ها
1-3-7-2) مولکول STAT-3
مولکول انتقال دهنده پیام و فعال کننده رونویسی شماره 355(STAT-3)، یکی از پروتئین های سیتوپلاسمی دخیل در مسیر سیتوکین هاست که به عنوان فاکتور انتقال پیام و رونویسی عمل کرده و در پاسخ های طبیعی سلولی به سیتوکین ها و فاکتورهای رشد شرکت دارد. در پاسخ به تحریک گیرنده سیتوکینی، STAT-3 فسفریله و فعال شده و بیان ژن را القاء می کند، بدین طریق که به دنبال فسفریله شدن تیروزین توسط سیتوکین ها، پروتئین STAT-3 دایمر شده وارد هسته می گردد و ژن های هدف خاصی را تحریک می کند (Suzuki et al., 2009). واضح است که فعالیتSTAT-3 باید به شدت کنترل شود و به همین دلیل تعدیل کنندگان عملکرد JAK/STATمثل SOCS(مولکول سرکوب گر انتقال پیام سیتوکین)56، PIAS (پروتئین مهارگر STAT فعال شده)57 و فسفاتازها مناسب ترین گزینه می باشند. هم چنین معلوم شده STAT-3 نقش مهمی در پاسخ های بقا / آپوپتوز، تکثیر و التهاب سلول دارد. (Planas et al., 2006)
2-3-7-2) مولکول SOCS-3
اولین عضو خانوادهSOCS که کشف شد، پروتئین ناشی از سیتوکین SH2 (CIS)58 بود. در حال حاضر این خانواده هشت عضو دارد SOCS-1 تا SOCS-7و CIS. این پروتئین ها تنظیم کننده منفی مسیرهای پیام رسانی درگیر در اعمال سلولی بسیاری از سیتوکین ها، فاکتورهای رشد و هورمون ها هستند(Wang and Campbell, 2002). در واقع پروتئین های SOCS مهارگران فیدبک فیزیولوژیک پیام رسانی گیرنده سیتوکین هستند (Wang and Campbell, 2002, Wang and Secombes, 2008). مطالعات در موش، اهمیت مولکول های SOCS را در حفظ هومئوستازی توسط پاسخ های سلولی به سیتوکین های خاص یا فاکتورهای رشد در انواع مختلف سیستم های فیزیولوژیک ثابت کرده است. سیتوکین ها طیف وسیعی از پاسخ های بیولوژیک را درCNS تعدیل می کنند به طوری که اعضای خانواده SOCS می توانند نقش ویژه ای در تنظیم پیام رسانی داخل سلولی توسط این افکتورها در هر دو وضعیت طبیعی و بیماری داشته باشند (Wang and Campbell, 2002).
ژن های SOCS در مغز طبیعی بیان شده اند. جالب اینکه بیان حداکثر ژن های SOCS-1، SOCS-2 وSOCS-3 در مغز موش از روز چهاردهم جنینی تا روز هشتم پس از تولد اتفاق می افتد (Wang et al., 2009a). بسیاری از ژن های SOCS به طور اساسی در مغز در حال رشد و نیز بالغ بیان شده اند، در حالیکه بیان بقیه خصوصاً ژن های SOCS-1 و SOCS-3 می تواند بسیار تنظیم شده باشد (Wang and Campbell, 2002). SOCS-3یکی از اعضای جدید خانواده مهارگران آبشار پیام رسانی در مسیر JAK/STAT می باشد که به طور منفی در تنظیم مسیرهای داخل سلولی فعال شده با انواع سیتوکین ها دخالت دارد و قادر است فعالیت STAT-3را مهارکند. پیشنهاد شده SOCS-3 نقش بحرانی در یکپارچه کردن مسیرهای نوروایمونواندوکرین دارد (Planas et al., 2006). بیانSOCS-3 بین سه ژن 1-3 SOCS بررسی شده در یک نوع ماهی قزل آلا، در بافت های پوست، آبشش، عضله، طحال و کلیه بیشترین مقدار بود. معلوم شده تعدیل بیان ژن SOCS وابسته به نوع سلول و نوع سیتوکین می باشد. نشان داده شد که بیان ژن SOCS ماهی توسط سیتوکین ها افزایش یافته اما این افزایش وابسته به نوع سلول است. ضمناً اینترفرون گاما (IFN-ϒ)59 بیان هر سه نوع ژن SOCS را در هر دو رده سلولی فیبروئید و مونوسیت/ ماکروفاژ، تنظیم افزایشی داد (Wang and Secombes, 2008).
نتایج مطالعات یک نقش اساسی برای SOCS-3 در تنظیم خون سازی60 درکبد نشان داده است. اگرچه SOCS-3 تحت شرایط فیزیولوژیک در سطوح پایین بیان شده است، چندین مطالعه نشان دادند که سطوح SOCS-3 در مغز پس از تزریق محیطی سیتوکین های مختلف یا به دنبال تحریک ایمنی محیطی با LPS، تنظیم افزایشی می یابد (Wang and Campbell, 2002).
پروتئین های SOCS مستقیماً با خانواده JAK واکنش نشان داده و فعالیت کاتالیتیک آنها را مهار می کنند یا اینکه با تیروزین فسفریله موجود در دومین های سیتوپلاسمی گیرنده های سیتوکینی تداخل می کنند. SOCS-1 و SOCS-3 به طور ویژه نقش برجسته ای در التهاب بازی می کنند. در کراتینوسیت ها SOCS-1 و SOCS-3 فعالیت STAT-1 و STAT-3را مهار می کنند و بیان مولکول چسبنده داخل سلولی شماره 161 (ICAM-1)، پروتئین القایی اینترفرون گاما شماره 10(IP-10) 62 و پروتئین جاذب ماکروفاژ شماره 1 (MCP-1)63ناشی از IFN-ϒ را کاهش می دهند. بنابراین SOCS-1 و SOCS-3به طور ویژه، فعالیت ناشی ازIFN-ϒ و/ یا فعالیت JAK1 وJAK2 و متعاقباً فعالیت STAT را مهار می کنند (Choi et al., 2005).
STAT-3 و SOCS-3 به وسیله محرکهای التهابی مانند LPS64و TNF-α فعال می شوند و مهم تر اینکه فعال سازیSOCS-3 مستقل از STAT-3 نیز می تواند صورت گیرد (Meisel et al., 1996). مطالعه ای نشان داد که تفاوت های جنسی در فعالیت STAT-3 و بیان SOCS-3 میوکاردی طی ایسکمی وجود دارد که نشان گر سطوح پایین تر فعالیت SOCS-3 در قلب مردان است و به نوبه خود توام با بهبود بهتر زنان در مقایسه با مردان می باشد. مردان به طور معنی داری سطوح پایین تری از SOCS-3 در مقایسه با قلب زنان داشتند و بیان SOCS-3 در زنان حدوداً پنج برابر بیشتر از مردان بود (Wang et al., 2009a). نشان داده شده که بیان بیش از حد SOCS-3 منجر به مرگ سلول نوروبلاستوما می شود (Aid et al., 2008).
ژن SOCS-3 به طوراساسی در سطوح مختلف در مغز موش بیان شده اند و این با مراحل رشد تغییر می کند. وجود SOCS-3 در نورون های هیپوتااسلایدوس و تنظیم افزایشی آن توسط سیتوکین های مختلف، قویاً پیشنهاد می کند که این مولکول نقش مهمی در عملکردهای تعدیل کنندگی نورواندوکرین و نوروایمونواندوکرین وابسته به سیتوکین بازی می کند. در حالی که مقالات محدودی در مورد عملکرد SOCS-3 در مغز وجود دارد، این مولکول در شرایط فیزیولوژیک، در سطوح کمی بیان می شود و برعکس، بیان آن در پاسخ به تحریکات التهابی افزایش می یابد (Wang and Campbell, 2002).

3-3-7-2) مولکول های NFκB-P52، NFκB-P65 وIκBα
فاکتورهای نسخه برداری هسته ای کاپا بی65 (NFκBs)، اثرات خود را از طریق اتصال به جایگاه های κB اعمال می کنند. فاکتور NFκB، یک پروتئین مرکب به فرم های هومو و هترودایمر متشکل از پنج عضو از خانواده Rel شامل: NFκB1 (p50)، NFκB2 (p52)، Rel A (p65)، Rel B و c-Rel (Rel) تشکیل شده است (Heissmeyer et al., 2001). این مولکول دارای ترکیبات مختلف است و از اعضای خانواده فاکتورهای رونویسی می باشد. خانواده NFκB/ Relعمدتاً در پاسخ های استرس، ایمنی و التهاب دخیل بوده و نقش محوری در التهاب دارند و یکی از مسیرهای اصلی هستند که مواد التهاب زا آن را به کار می برند. یکی از این هترودایمرها P65-P52 NFκB می باشدکه در مسیر انتقال پیام سیتوکین ها وارد هسته شده و رونویسی از DNA را برای ژن ها، خصوصاً ژن مولکول های دخیل در التهاب انجام می دهد. این مولکول ها نقش مهمی طی رشد سلول های ویژه خون ساز، کراتینوسیت ها و اندام های لنفی دارند. اخیراً معلوم شده اعضای خانواده NFκB در فرایند نئوپلازی و تشکیل سیناپس های عصبی دخیلند. هم چنین اعضای خانواده NFκB جزء تنظیم کننده های مهم مرگ برنامه ریزی شده و کنترل فرایند تکثیر بوده و نقش بحرانی در تومورزایی دارند (Baldwin, 1996).
دایمرهای NFκB در سیتوزول سلولهای تحریک نشده، از طریق پیوند غیر کووالانسی با یک گروه پروتئین های مهاری به نام پروتئین های مهاری کاپا بی66 (I-κBs)، غیرفعال می باشند. تا امروز 7 نوع IκB شناسایی شده است:IκB-α ، IκB-β، IκB-ϒ، IκB-epsilon، BCL3، P100 و .P105 تمامIκB های شناخته شده دارای کپی های متعددی از توالی 30-33aa می باشند که تکرارهای ankyrin نام دارد و اتصال بین IκB و دایمرهایNFκB را وساطت می کند. IκB ها از طریق اتصال به NFκB باعث نگهداری فرم غیر فعال آن ها در داخل سیتوپلاسم می شود. سیگنال هایی که فعالیت NFκB را القا می کنند، سبب فسفریلاسیون IκB می شوند. جدایی و سپس تخریب IκB ها، اجازه فعال شدن به NFκB می دهد. سپس NFκB وارد هسته می شود و در محل موتیف67 های ویژه ای به DNA متصل شده و بیان ژن را القا می کند. IκBα یکی از اعضای خانواده پروتئین های سلولی است که عمل آن مهار NFκB است. علاوه براین IκBα توانایی NFκB را برای اتصال به DNA نیز مهار می کند. سیگنال هایی که فعالیتNFκB را القا می کنند، سبب فسفریله شدنIκBα و به دنبال آن تجزیه و تخریب توالی و جدایی آن ها از NFκBشده و به این ترتیب مجموعه NFκB اجازه فعالیت یافته و وارد هسته می شود و بر بیان ژن اثر می گذارد. ضمناً این تخریب عمدتاً توسط کمپلکس IκB کیناز آلفا (IKKα)68 صورت می گیرد که خود دارای سه زیر واحد است. بدین ترتیب همه عواملی که موجب فسفریلاسیون مولکول IκBα می شوند، تحریک سنتز عوامل التهاب زا را موجب می گردند (Baeuerle, 1998).
8-2) استروژن
گزارش های مبنی بر اختلافات جنسی بر نتایج TBI باعث توجه به اثرات این هورمون ها گردید و تحقیقات در زمینه اثرات حفاظت عصبی استروژن و پروژسترون آغاز شد. استروژن وپروژسترون هورمون های استروئیدی مشتق از کلسترول هستند که اغلب به عنوان تنظیم کننده تولید مثل شناخته می شوند اما در سیستم های دیگر مثل CNS نقش دارند. مطالعات حاکی از این است که خیز مغزی و نیز کوفتگی های قشری ناشی از ترومای مغزی در افراد ماده کمتر است (Hoffman et al., 2006a) و نیز حیوانات ماده به دنبال ایسکمی و تروما، نسبت به نرهای مشابه، آسیب بافتی کمتری می بینند. از طرفی پیش آگهی به دنبال ایسکمی تجربی در حیوانات ماده تحت تاثیر سیکل استروس قرار می گیرد به طوری که آسیب ایجاد شده در مرحله پرواستروس69 در مقایسه با مت استروس70 کمتر است و تفاوت در سطح آسیب، به میزان بالای استروژن نسبت داده می شود (Herson et al., 2009).
17-بتا استرادیول (E2)، استروژن غالب و قوی ترین استرادیول با منشا درونی است که به طور عمده در تخمدان ها ساخته می شود لیکن ارگان ها و بافت های دیگر مانند بافت چربی، سلول های مغزی (آستروسیت ها، میکروگلیاها و نورون ها)، سلول های سیستم ایمنی و استخوان نیز آن را تولید می کنند (Wise et al., 2009). مطالعات نشان داده که استروژن در آزمایش های in vivo در هر دو جنس اثر حفاظت عصبی دارد (Alkayed et al., 2001). در مورد آثار ضد التهابی استروژن، مشخص شده که این هورمون، نفوذپذیری سد خونی-مغزی را در مدل های آسیب مثل التهاب ایسکمیک، ایسکمی و تروما تنظیم می کند و تولید سیتوکین های التهابی را که به دنبال آسیب های مغزی افزایش می یابند، کاهش می دهد (Brown et al., 2010b). این هورمون، نورون های ناحیه CA1 هیپوکامپ را از مرگ ایجاد شده توسط ایسکمی گلوبال71، محافظت می کند.
1-8-2) مکانیسم های حفاظت عصبی استروژن
استرادیول بسیاری از اعمال خود را از طریق دو مسیر ژنومیک (کلاسیک) و غیر ژنومیک (غیر کلاسیک)، اعمال می کند:
1- آثار ژنومیک استرادیول از طریق گیرنده های کلاسیک یعنی گیرنده آلفا (ER-α) و گیرنده بتا (ER-β) انجام می شود و پس از10-5 ساعت ظاهر می شوند.
گیرنده های استروژن72(ERs)، در هر دو مسیر پیام رسانی کلاسیک و غیر کلاسیک نقش دارند (Brown et al., 2010b). بعد از کشف ER-β در سال 1996، محققین شباهت ها و تفاوت هایی را در توزیع این گیرنده ها کشف کرده اند، اگرچه هر دو گیرنده دارای ساختار و توزیع حدوداً مشابهی در مغز و سایر نقاط بدن می باشند، اما تفاوت های عملکردی مهمی نیز دارند. بیان ER-α در قشر در حال تکامل، افزایش می یابد سپس سقوط کرده و در سطح بسیار پایین در بزرگسالی باقی می ماند (Prewitt and Wilson, 2007).
E2 در مسیر ژنومیک روی فرایند ترجمه اثر می گذارد و می تواند بیان ژن را با یا بدون عناصر پاسخ استروژن73(EREs) و از طریق گیرنده های آلفا و بتا و یا از طریق فاکتورهای رونویس از قبیل NFκB و JAK/STAT تغییر دهد.
2- فعال شدن آثار انتقال سیتوپلاسمی: در مسیر غیر ژنومیک، استروژن به سومین گیرنده خود که اخیراً با تلاش های محققین کشف شده و داخل غشایی است، یعنی پروتئین جفت شونده با G پروتئین 30 (GPR30)74 متصل شده و اثرات ناشی از سیگنال های سریع را از خود نشان می دهد. GPR30 با تمایل بالا به استرادیول باند می شود و در بافت هایی از جمله مغز بیان می شود و یک سری آثار غیر ژنومیک استروژن را وساطت می کند. از جمله این آثار، فسفریلاسیون پروتئین می باشد که پس از 5 دقیقه ظاهر می گردد. این اثرات شامل فعال کردن کینازها از جمله75ERK،PKG76،77AKT و یا پیامبرهای ثانویه مثل Ca2+ و cAMPمی باشد. این آبشارهای سریع سیگنالی می توانند فرایند ترجمه را نیز تحریک کنند.
3- جریان های یونی وابسته به غشا، اغلب کانال های k+ ، وابسته به Ca2+ یا کلسیم را در بر می گیرد که بسیار سریع هستند و در عرض 2 دقیقه قادرند به غلظت های در حد پیکومولار استروژن پاسخ دهند.
4- افزایش خون رسانی مغزی پس از سکته مغزی و کاهش پراکسیداسیون غشای لیپیدی در اثر ویژگی های آنتی اکسیدانی.
5- تعدیل واکنش های ایمنی و گلیال و تعدیل سطح میانجی های تحریک پذیری عصبی.
6- اثر بر ساخت پروتئین هایی که در مهار و پیشبرد آپوپتوز نقش دارند.
7- در یک مسیر دیگر، استروژن به طور مستقیم نورون ها را تحت تاثیر قرار می دهد و نیز روی سلول های گلیا، سلول های ایمنی و ساختار عروق اثر کرده و پاسخ های آن ها را به آسیب مغزی تغییر می دهد. ترکیب آثار فوق منجر به کاهش پاسخ های آسیب رسان و تحریک بقای سلول می گردد (Herson et al., 2009).
به عبارت دیگر استروژن پس از آسیب ایسکمیک هر دو عمل ژنومیک و غیر ژنومیک خود را اعمال می کند، که شامل: تثبیت سد خونی-مغزی و کاهش خیز مغزی متعاقب آن (Liu et al., 2005a, O'Donnell et al., 2006)، افزایش جریان خون در حین ایسکمی و بعد از آن (Hurn et al., 1995, Pelligrino et al., 1998)، به کار گیری مولکول های ضد التهابی (Mori et al., 2004, Wen et al., 2004) و افزایش بیان واسطه های حفظ بقا مانند bcl-278 و79CART (Alkayed et al., 2001, Xu et al., 2006) می باشد. هم چنین E2 می تواند به صورت وابسته به دز به عنوان یک ماده آنتی اکسیدان و ضد پراکسیداسیون چربی عمل کند (Vedder et al., 1999) و باعث بهبود تشکیل مجدد نورون ها و شکل پذیری80 آن ها و افزایش حافظه، بعد از آسیب مغزی (Behl and Manthey, 2000) می گردد.
پاسخ التهابی همراه با سکته مغزی و تروما پیچیده است، لیکن از شواهد چنین برمی آید که استروژن به طور مستقیم و یا غیر مستقیم سه جزء از پاسخ التهابی را تنظیم می کند: 1- فعالیت میکروگلیاها (ماکروفاژهایی که از جریان خون آمده اند)، 2-فعالیت آنزیم سازنده نیتریک اکسید (iNOS)81 و 3-فعالیت سیتوکین ها.
میکروگلیاها در پاسخ به آسیب های مغزی، فعال شده، تکثیر یافته و به محل آسیب مهاجرت می کنند. E2 فعالیت میکروگلیا را سرکوب می کند. فعالیت iNOS در طول تروما و سکته مغزی، غلظت بالایی از نیتریک اکسید تولید می کند که منجر به مرگ سلول می گردد. در تعداد زیادی از مطالعات بیان شده است که استروژن فعالیت iNOS را نیز مهار می کند. در نمونه های مختلف آسیب مغزی، تزریق استرادیول باعث سرکوب سیتوکین های التهابی و تولید انواع ضد التهابی این پروتئین ها شده است (An et al., 1999, Tiwari-Woodruff et al., 2007, KHAKSARI et al., 2010a).
9-2) پروژسترون
با مشاهداتی از اثرات مثبت و نوروپروتکتیو از پروژسترون، این هورمون نیز مورد توجه قرار گرفت، از جمله این که خیز مغزی در حالت هیپرپروژسترونیسم در حیوانات ماده، بسیار ناچیز است (Hoffman et al., 2006a). مشاهده شده که پروژسترون در مقادیر کم اما تقریباً یکسان در مغز حیوانات نر و ماده وجود دارد و گیرنده های پروژسترون به صورت گسترده ای در سراسر سیستم عصبی مرکزی گسترده شده اند (Hoffman et al., 2006a). مطالعات تحقیقاتی روی مدل های حیوانی TBI، اثر حفاظت عصبی پروژسترون را نشان داده اند. پروژسترون در مدل های آسیب ایسکمیک مغزی نیز اثر محافظ دارد. در سال 2003، Goss و همکاران نشان دادند که پروژسترون در بهبود فعالیت های شناختی مغز موثر است (Goss et al., 2003). Culter و همکاران (2005) گزارش کردند که در TBI، درمان به صورت رهایش مداوم پروژسترون بسیار موثرتر از تزریق مداوم روزانه همان دز می باشد (Cutler et al., 2005). تحقیقات دیگر نشان داده که تزریق پروژسترون هم قبل از انسداد شریان مغزی میانی (MCAO)82 و هم در طول پرفیوژن مجدد، باعث کاهش آسیب ایسکمی مغزی در موش های اوارکتومی شده می گردد (Murphy et al., 2002). علاوه بر این پروژسترون خارجی با حفظ CBF در حین انسداد یا با افزایش زودرس پرفیوژن مجدد باعث کاهش آسیب می گردد (Murphy et al., 2002). در پژوهشی دیگر که روی مدل TBI انجام شده، یک رابطه معکوس بین سطح سرمی پروژسترون و درصد خیز مغزی، مشاهده شد (Wright et al., 2007). هم چنین مشاهده شد در موش های صحرایی نر، تجویز پروژسترون قبل و بعد از شروع ایسکمی کانونی گذرای مغزی، باعث کاهش آسیب و نقایص نورولوژیک می گردد (Alkayed et al., 2001).
1-9-2) مکانیسم های حفاظت عصبی پروژسترون
مکانیسم های آثار حفاظت عصبی پروژسترون عبارتند از:
1- اثر بر کاهش خیز مغزی، 2- اثر بر میلین دار شدن مجدد 83 و ترمیم، 3- اثر بر استرس اکسیداتیو، 4- اثر بر التهاب:
پروژسترون و متابولیت های فعال آن از آنتاگونیست های قوی التهاب CNS و خیز مغزی بعد از TBI می باشند، بنابراین در مهار رهایش سیتوکین ها و مهار فعالیت و مهاجرت سلول های ایمنی نقش دارند. مطالعه ای نشان داد که پروژسترون باعث کاهش فاکتور NFκB پس از TBI در کورتکس مغز موش های صحرایی نر می شود (Pettus et al., 2005). هم چنین گزارش شده درمان با پروژسترون باعث کاهش بیان سیتوکین های التهابی IL-1β و TNF-α در مغز بعد از اعمال ضربه مغزی گردید (He et al., 2004a). مطالعات in vitro نشان داد TNF-αوINF-γ باعث فعال شدن میکروگلیا شده و تجویز پروژسترون، فعالیت میکروگلیایی را مهار می کند (Drew and Chavis, 2000). علاوه بر این پروژسترون بیانiNOS وNO القا شده با TNF-α را کاهش داده و دژنراسیون نورونی و آپوپتوز را مهار می کند (Drew and Chavis, 2000).
5- اثر بر آپوپتوز و ترمیم DNA: ثابت شده که پروژسترون می تواند باعث کاهش آپوپتوز در نورون ها پس از TBI گردد. در سطح بیان ژن، پروژسترون هم باعث کاهش غلظت هسته ای و هم کاهش بیان ژن های هدف NFκB می شود که خود در آغاز التهاب و آپوپتوز ناشی از TBI، نقش دارد. سایر آنزیم های پیش برنده التهاب مانند کاسپاز 3 84 نیز با درمان پروژسترون کاهش می یابد (Djebaili et al., 2005). 6- اثر بر گاما آمینو بوتیریک اسید (GABA)85: مدارکی هست که نشان می دهد پروژسترون باعث تظیم افزایشیGABA-A ، یک میانجی عصبی در CNS، می شود. مهار به واسطه GABA باعث کاهش تحریک سمی القا شده توسط آسیب به وسیله رهایش گلوتامات یا سایر میانجی های عصبی تحریکی می شود (Brann et al., 2005).

1-3) حیوان های مورد آزمایش
در این پژوهش مداخله ای- تجربی که در دانشکده پزشکی افضلی پور دانشگاه علوم پزشکی انجام شد از 210 سر موش صحرایی ماده نژادALBINO WISTAR با وزن 250-200 گرم استفاده شد. حیوان ها در حیوان خانه دانشکده پزشکی و در شرایط درجه حرارت 22-20 درجه سانتی گراد، رطوبت 60-40 درصد و دوره 12 ساعته تاریکی و روشنایی نگهداری شده و دسترسی آزاد به آب و غذا داشتند.
حیوانات به طور تصادفی به 10 جفت گروه (گروه حیوانات مخصوص بررسی خیز مغزی و گروه حیوانات مخصوص بررسی سلول های حاوی مولکول های سیتوکین پژوهش و یافته های هیستوپاتولوژی) تقسیم شدند. در هر گروه بررسی خیز مغزی 6 سر و در هر گروه بررسی فاکتورهای مولکولی و هیستوپاتولوژی 15سر موش صحرایی قرار گرفت.
شاخص هایی که در آن ها اندازه گیری شد عبارت بودند از:
1- محتوای آب مغز (BWC)86 24 ساعت پس از TBI در هر 10 گروه
2- درصد سلول های مغزی دارای مولکول p-STAT-3، 24 ساعت پس از TBIدر هر 10 گروه
3- درصد سلول های مغزی دارای مولکول SOCS-3، 24 ساعت پس از TBIدر هر 10 گروه
4- درصد سلول های مغزی دارای NFκB-P52، 24 ساعت پس از TBI در هر 10 گروه
5- درصد سلول های مغزی دارای مولکولp-NFκB-P65 ، 24 ساعت پس از TBIدر هر 10 گروه
6- درصد سلول های مغزی دارای مولکول p-IκBα، 24 ساعت پس از TBIدر هر 10 گروه
7- درصد ادم بافتی، احتقان(پرخونی)، دژنراسیون نورونی، آپوپتوز نورونی و گلیوز، 24 ساعت پس از TBIدر هر 10 گروه
2-3) گروه های مورد مطالعه
1- گروه کنترل یا شم دست نخورده (Ctrl): موش های ماده ای که به طور کاذب تخمدان های آنها بر داشته شده، بیهوش شده و به طور کاذب تحت ضربه مغزی قرار می گرفتند.
2- گروه شم فاقد تخمدان (Sham+87OVX): موش های ماده ای که تخمدان های آن ها به صورت دو طرفه برداشته شده، بیهوش شده و به طور کاذب تحت ضربه مغزی قرار می گرفتند.
3- گروه ضربه مغزی (OVX+TBI): موش های ماده ای که تخمدان هایشان برداشته شده و تحت ضربه مغزی قرار گرفته اند.
4- گروه حلال یا 88Veh (OVX+TBI+Oil): به موش های صحرایی ماده فاقد تخمدان، هم حجم استروژن یا پروژسترون ( ml2/0)، حلال آن ها (روغن کنجد)، نیم ساعت بعد از جراحت مغزی به روش داخل صفاقی (ip) تزریق می شد (Soltani et al., 2009).
5- گروه حلال+حلال یاVeh+Veh (OVX+TBI+Oil+Oil): به موش های صحرایی ماده فاقد تخمدان، هم حجم استروژن و پروژسترون ( ml2/0)، حلال آنها (روغن کنجد)، نیم ساعت بعد از جراحت مغزی به روش داخل صفاقی (ip) تزریق می شد (Soltani et al., 2009) .
6- گروه استروژن با دز کم (OVX+TBI+E1) : به موش های صحرایی ماده فاقد تخمدان، استروژن با دز kg/gμ 3/33، نیم ساعت بعد از ترومای مغزی به میزان ml2/0 به روش داخل صفاقی تزریق می گردید (Soltani et al., 2009).
7- گروه استروژن با دز زیاد (OVX+TBI+E2) : به موش های صحرایی ماده فاقد تخمدان، استروژن با دز kg/ mg 1، نیم ساعت بعد از ترومای مغزی به میزان ml2/0 به روش داخل صفاقی تزریق می گردید (O'Connor et al., 2005).
8- گروه پروژسترون با دز کم (P1 OVX+TBI+): به موش های صحرایی ماده فاقد تخمدان، پروژسترون با دزkg / mg7/1، نیم ساعت بعد از ترومای مغزی به میزان ml2/0 به روش داخل صفاقی تزریق می شد (Soltani et al., 2009) .
9- گروه پروژسترون با دز زیاد (P2 OVX+TBI+): به موش های صحرایی ماده فاقد تخمدان، پروژسترون با دزkg / mg8، نیم ساعت بعد از ترومای مغزی به میزان ml2/0 به روش داخل صفاقی تزریق می گردید (O'Connor et al., 2005).
10- گروه ترکیبی استروژن با دز زیاد + پروژسترون با دز کم (OVX+TBI+E2+P1): به موش های صحرایی ماده فاقد تخمدان، استروژن با دزkg / mg1 و پروژسترون با دزkg / mg7/1، نیم ساعت پس از ترومای مغزی به میزان ml2/0 به روش داخل صفاقی تزریق می شد (Khaksari et al., 2010b) .
3-3) وسایل و مواد
1-3-3) وسایل
وسایل مورد استفاده در این پژوهش به دو دسته تقسیم شدند:
1-1-3-3) وسایل استفاده شده در آزمایشگاه التهاب عصبی
1-دستگاه القاء ضربه مغزی، ساخته شده در گروه فیزیولوژی دانشکده پزشکی …….، ایران
2- دستگاه اینتوباسیون89 ساخته شده در گروه فیزیولوژی دانشکده پزشکی ….، ایران
3- میز جراحی، ساخته شده در گروه فیزیولوژی دانشکده پزشکی …..، ایران
4- دستگاه فور، MEMMERT، آلمان
4- ترازوی آنالیتیک، SARTORIUS، با حساسیت 001/0 گرم و 0001/0 گرم، آلمان
5- ترازوی حساس الکتریکی، SARTORIUS ، با حساسیت 1 گرم، آلمان
6- ماشین مو تراش مخصوص حیوانات،MOSER ، آلمان
7- یخچال فریزر ارج، ایران
8- وسایل جراحی و اینتوباسیون شامل: پنس، قیچی، سوزن گیر، اسکالپل، تیغ بیستوری و کانول شماره 18
9- ظرف شیشه ای (دسیکاتور) برای بی هوش کردن حیوان، ایران
10-چراغ مخصوص جهت روشن نمودن محل جراحی
2-1-3-3) وسایل استفاده شده در آزمایشگاه ایمونوهیستوشیمی(IHC)90
1- COLD ROOM، شرکت بوران، ایران
2- دستگاه پاساژ بافت91 ،AUTOTECHNICON ، انگلستان
3-Oven Hot Box، GALLENKAMP، انگلستان
4- PARAFFIN DISPENSER PLUS، دید سبز، ایران
5- دستگاه برش بافت92، MICROTEC CUT 4050، آلمان
6- حمام بافت93،GFL ، آلمان
7- میکروسکوپ نوری،ZEISS ، آلمان
8- جار مخصوص رتریوال، آلمان
9- یخچال- فریزر ، ارج، ایران
10- قلم الماس، CENATOR، چین
11- ست سمپلر، EPPENDORFE ، آلمان
12- انواع سر سمپلر و میکروتیوب، CITOTEST، چین
13-ماژیک پرمننت، SHARPIO ، امریکا
14- انواع جعبه های اسلاید: شیشه ای، فلزی و چوبی
15- انواع ظروف آزمایشگاهی مانند پیپت، بشر، ارلن، استوانه مدرج، لوله فالکون و…
2-3-3) مواد
مواد مورد استفاده در این پژوهش به سه دسته تقسیم شدند:
1-2-3-3) مواد مورد استفاده در آزمایشگاه التهاب عصبی
1- اتر، SAMCHUN، کره
2- β-استرادیول، ابوریحان، ایران
3- پروژسترون، ابوریحان، ایران
4- روغن کنجد (حلال استروژن و پروژسترون)، ابوریحان، ایران
5- سیمان دندانپزشکی، مارلیک، ایران
6- حلال آکریل، آکروپاس، ایران
7- آمپول کتامین، ROTEXMEDICA، آلمان
8- آمپول گزیلوزین، ALFASAN، هلند
9- سرنگ انسولین،UNLOCK ، هند
10- سرنگ معمولی، سوپا، ایران
11- بتادین، بصیر طب، ایران
12- نخ های جراحی سیلک0/2 ، 0/3 و کاتگوت 4، سوپا، ایران
13- سرم نرمال سالین، رازی، ایران
14- تیغ بیستوری شماره 23، ISOMED، PRC
15- دستکش جراحی متوسط، MAXTER، مالزی
16- دستکش یک بار مصرف، آریاپلاست ، ایران
17- ماسک یک بار مصرف ، مهران، ایران
2-2-3-3) مواد مورد استفاده در آزمایشگاه ایمونوهیستوشیمی (IHC)
1- آنتی بادی اولیه94 (B-7) p-STAT-3،Mouse monoclonal IgG2b، Santa Cruz Biotechnology، امریکا
2- آنتی بادی اولیه (H-103) SOCS-3،Rabbit polyclonal IgG ، Santa Cruz Biotechnology، امریکا
3- آنتی بادی اولیه (C-5) NFκB p52 ،Mouse monoclonal IgG2a ، Santa Cruz Biotechnology، امریکا
4- آنتی بادی اولیه (F-6) p-NFκB p65 ،Mouse monoclonal IgG1، Santa Cruz Biotechnology، امریکا
5-آنتی بادی اولیه (B-9) p-IκBα ،Mouse monoclonal IgG2b ، Santa Cruz Biotechnology، امریکا
6- آنتی بادی ثانویه95Goat anti Mouse ،IgG-HRP ،SC-2005 ، Santa Cruz Biotechnology، امریکا
7-آنتی بادی ثانویه Goat anti Rabbit،IgG-HRP ،SC-2004 ، Santa Cruz Biotechnology، امریکا
8- اتانول (با درصد های 50،70،80، 96 و 100)، زکریای رازی، ایران
9- متانول، MERCK، آلمان
10- رنگ هماتوکسیلین، پویا، شیراز
11 -رنگ ائوزین،MERCK ، آلمان
12-گزیلول96، MERCK، آلمان
13-استون، MERCK، آلمان
14-مرکب RAPID، ROTRING، آلمان
15-اسلاید سیالینیزه ،THERMO ، آلمان
16-لامل،HIRSCHMANN ، آلمان
17- ماژیک NOVOPEN، LEICA، آلمان
18-تیغ بیستوری شماره 23، ISOMED، PRC
19-گاز غیر استریل، ثمین طب، ایران
20- چسب گزیلوفلوئید97، آلمان
21-محلول دی آمینو بنزیدین(DAB)98
22-محلول رقیق کننده آنتی بادی، داکو، آلمان
3-2-3-3) بافرهای مورد استفاد ه در آزمایشگاه IHC
1- بافر سیترات: 92/1 گرم پودر اسید سیتریک در یک لیترآب مقطر، 6 = pH.
2- بافر فسفات: 8 گرم پودر NaCl، ، 2/. گرم پودر KCl، 2/. گرم پودر KH2PO4 و 15/1 گرم پودر فسفات دی سدیک (Na2HPO4) در یک لیتر آب مقطر 4/7-2/7= pH.
4-3) روش های استفاده شده در پژوهش
1-4-3) روش برداشتن دو طرفه تخمدان99
جهت بیهوشی موش صحرایی ماده، کتامین mg/kg80 و گزیلوزین mg/kg10، به روش داخل صفاقی به حیوان تزریق شد. سپس حیوان را به پشت خوابانده و موهای قسمت تحتانی شکم را تراشیده و یک برش افقی به طول 3-2 سانتی متر ایجاد شد. پس از آن پوست، فاسیا و عضلات شکم باز شده، چربی ها و روده ها کنار زده شد تا رحم و لوله های رحمی دیده شوند. لوله رحم و پایه عروقی تخمدان با نخ کاتکوت 4 در ناحیه پروگزیمال مسدود گردید و از ناحیه دیستال قطع شد و همین عمل در مورد تخمدان سمت دیگر بدن تکرار شد. در انتها 2-1 میلی لیتر محلول سرم فیزیولوژی داخل شکم ریخته، عضلات و پوست به ترتیب با نخ سیلک دو صفر به روش پیوسته بخیه گردید (شکل1-3). محل زخم با محلول بتادین ضدعفونی شد و حیوانات تا 2 ساعت تحت مراقبت ویژه قرار می گرفتند (Wen et al., 2004).

تصویر1-3: اوارکتومی دو طرفه حیوان
2 -4-3) اینتوباسیون (لوله گذاری داخل نای)100
بعد از بی هوشی با اتر، حیوان بر روی سطح شیب داری قرار گرفت. در مرحله بعدی تمرکز نور لامپ (15W,6V) بر روی سطح پوست در منطقه ای که نای قرار داشت تنظیم شد. لازم به ذکر است که نور خروجی از لامپ توسط عدسی که بلافاصله بعد از لامپ قرار داشت تنظیم می شد، فاصله لامپ تا حیوان نیز توسط حرکت دادن خود لامپ تغییر می کرد و منبع تغذیه لامپ نیز یک ترانس بود که ولتاژ V220 شهری را به V6 تبدیل می کرد. بعد از اطمینان از قرارگیری صحیح حیوان بر روی سطح شیب دار و تمرکز نور لامپ مذکور بر روی نای حیوان، با بیرون آوردن زبان به کمک پنست و سپس مشاهده نای (سوراخی که به طور مداوم باز و بسته می شود)، لوله اینتوباسیون ویژه ای که برای این امر تهیه شده (کانول شماره 18)، به عمق 5 سانتی متر وارد نای شد. جهت اطمینان از قرارگرفتن صحیح لوله در داخل نای حیوان به شکم روی کف دست قرار داده، سر را نزدیک میز استیل برده، جلوی بینی و دهان را چند لحظه ای گرفته و بیرون آمدن بخار از لوله اینتوباسیون بر روی میز استیل، نشانگر قرار گرفتن لوله در داخل نای بود (شکل2-3).

تصویر 2-3: لوله گذاری داخل نای حیوان قبل از القای ضربه مغزی

3-4-3) القاء ضربه مغزی
دو هفته پس از اوارکتومی حیوان، و بعد از اطمینان از بی هوشی عمیق با اتر، موی سر حد فاصل بین دو چشم تا ناحیه بین دو گوش تراشیده شده، برشی در خط وسط در حد فاصل بین دو منطقه مذکور داده شد و پس از کنار زدن پوست و نسوج زیر پوستی و مشاهده استخوان جمجمه و خشک کردن ناحیه با اپلیکاتور، به منظور پخش یکنواخت ضربه بر روی جمجمه و هم چنین حفاظت حیوان از شدت ضربه، یک صفحه فلزی از جنس استیل به قطر10 میلیمتر و ضخامت 3 میلی متر به طور مرکزی در طول خط کرونال، بین برگما (محل اتصال استخوان های آهیانه ای و پیشانی) و لامبدا (محل اتصال استخوان های آهیانه ای و پس سری)، به وسیله چسب پلی اکریل امید به استخوان چسبانده شد (شکل3-3) (Marmarou et al., 1994, Soltani et al., 2009).

تصویر 3-3: پلیت گذاری سر حیوان پیش از اعمال ضربه مغزی

سپس حیوان بی هوش در وضعیت خوابیده به شکم بر روی تشک از جنس فوم با ضخامت 10 سانتی متر قرار داده شده و با استفاده از دستگاه القاء ضربه مغزی، ضربه مغزی منتشر به سر حیوان بی هوش وارد شد (O'Connor et al., 2005). نحوه عمل این دستگاه که بر اساس روش پیشنهادی مارمارو عمل می کند (Marmarou et al., 1994)، به این صورت است که از 6 عدد وزنه فلزی 50 گرمی که در مجموع ضربه 300 گرمی را ایجاد می کنند، استفاده شد. وزنه ها به صورت ستونی روی یک میله فلزی ردیف شدند که بعد از قرارگیری صحیح حیوان در محل ضربه، این میله از درون یک لوله استوانه شیشه ای به ارتفاع 2 متر، با فشردن یک دکمه بر سر حیوان به طور آزادانه فرود آمد (شکل 4-3). ترومایی که به سر حیوان توسط این وزنه ها از ارتفاع فوق وارد شد، از نوع متوسط 101 می باشد.
برای جلوگیری از برخورد ضربه دوم بر سرحیوان که ناشی از برگشت وزنه ها است، حیوان بعد از ضربه اول، سریعاً از محل دور شده، بلافاصله صفحه استیل از سر جدا گردیده و حیوان به دستگاه پمپ تنفسی وصل شد. پس از بخیه زدن ناحیه برش داده شده سر با نخ سیلک0/2 و ضدعفونی کردن با بتادین و برقراری تنفس خود به خودی، حیوان به قفس باز گردانده شد (O'Connor et al., 2005).

تصویر 4-3: دستگاه القاء ضربه مغزی

4-4-3) اندازه گیری میزان خیز مغزی با اندازه گیری محتوای آب مغز 102
محتوای آب مغز حیوان، 24 ساعت پس از القای ضربه مغزی به شرح زیر اندازه گیری شد. سر حیوان بعد از بی هوشی با اتر و قربانی کردن حیوان جدا شد، کل مغز به سرعت و بدون دستکاری زیاد خارج شد و وزن آن (وزن مرطوب)، اندازه گیری گردید. در مرحله بعد مغزها در کاغذ فویل قرار داده گرفت و به مدت 72 ساعت در درجه حرارت 70-60 درجه سانتی گراد در فور گذاشته شد. سپس مجددا وزن مغز (وزن خشک)، اندازه گیری گردید و با استفاده از فرمول زیر درصد آب مغز به عنوان شاخص خیز محاسبه شد (Koyama et al., 2004) .

5-4-3) روش اندازه گیری سلول های دارای مولکول های مسیر پیام رسانی سیتوکین ها
مرحله ابتدایی برای رنگ آمیزی اسلایدها به روشIHC جهت ارزیابی درصد سلول های حاوی مولکول های مسیر پیام رسانی سیتوکین ها، در این پژوهش استفاده شده، و یا رنگ آمیزی103H&E جهت بررسی متغیر های هیستوپاتولوژی، تهیه اسلاید طبق مراحل زیر می باشد:
1-5-4-3) فیکس104 بافت مغز
مدت 24 ساعت پس از القای ضربه مغزی، ابتدا حیوان با اتر بی هوش شده، قربانی گردیده و سپس مغز حیوان بدون دست کاری زیاد خارج می شد. با توجه به گروه هر حیوان، مغز آن در داخل ظرف پلاستیکی با برچسب ویژه اطلاعات، حاوی فرمالین 10 درصد قرار می گرفت (شکل 5-3 ). به این ترتیب، مغز که بافت نرمی هم دارد، بدون هیچ آسیبی، حفظ می شد.

تصویر 5-3: فیکس کردن مغز حیوانات در ظروف حاوی فرمالین 10%
2-5-4-3) قالب گیری105 (تهیه بلوک های پارافینی)
نمونه های مغز از داخل فرمالین خارج شده و با تیغ بیستوری، برش عرضی106 (موازی با سطح ضربه خورده) داده شد، مغز به سه قسمت نسبتاٌ مساوی تقسیم شده و با رعایت ترتیب پشت و روی بافت به کمک مرکب مخصوص علامت گذاری گردیده، در داخل سبد107های کوچک دو تکه مخصوص بافت قرار گرفت. در همین مرحله، هر یک از سبدها به صورت تصادفی یک کد108 دریافت می کردند که تا انتهای مراحل تهیه اسلاید تغییر نمی کرد و بنابراین کلیه مراحل به صورت کور109 انجام می شد. سپس این سبدها به منظور فیکس، آبگیری، الکل گیری (شفاف کردن) و آغشتگی بافت، مجموعاً به مدت 17ساعت در داخل دستگاه پاساژ بافت (شکل 6-3)، قرار گرفته و در داخل این دستگاه به ترتیب از داخل ظرف های مخصوص دستگاه عبور نموده و این مراحل را طی می کردند:
1- تکمیل فیکس بافت: با قرارگیری در فرمالین 10 درصد (دو مرحله).
2- آب گیری بافت: با قرار گیری در الکل از غلظت کم به زیاد یعنی الکل 70 درجه، الکل 80 درجه، الکل 96 درجه (دو مرحله)، الکل مطلق یا 100 درجه (دو مرحله).
3- الکل گیری بافت: با عبور از گزیلول.
4- آغشتگی بافت: با عبور از پارافین، پارافین در لابه لای بافت نفوذ کرده و بافتی محکم و قابل برش ایجاد می کند.
5- پس از خارج کردن نمونه بافت ها از دستگاه فوق، در فور با دمای 70-60 درجه قرار داده شدند برای اینکه بافت جهت قالب گیری، گرم باقی بماند. سپس با استفاده از دستگاه پارافین دیسپانسر (شکل 7-3)، که پارافین را در دمای حدود 60 درجه به صورت مذاب در می آورد و قالب های مخصوص، بافت مغز به صورت بلوک درآورده شد، به این ترتیب که با استفاده از دو قالب L شکل آلومینیومی، یک مستطیل در روی صفحه110 دستگاه دیسپانسر درست می شد. سپس برش های بافت با رعایت ترتیب علامت گذاری شده، در کف قالب قرار می گرفت و پارافین مذاب روی آنها ریخته می شد. ضمناً کد هر نمونه هم قبل از سفت شدن پارافین در داخل آن قرار می گرفت. پس از سفت شدن کامل بلوک در دمای اتاق، قالب از آن جدا می گردید و بلوکی حاوی بافت مغز باقی می ماند (شکل 8-3).

تصویر6-3: دستگاه TISSUE PROCESSOR

تصویر 7-3: دستگاه PARAFFIN DISPENSER

تصویر 8-3: بلوک های پارافینی حاوی بافت مغز با کدهای ویژه

3-5-4-3) برش گیری
هر بلوک، نیم ساعت قبل از برش گیری، داخل فریزر قرار می گرفت. سپس در داخل دستگاه میکروتوم (شکل 9-3)، فیکس شده و برش های 2 میکرونی داده می شد. پس از آن برش روی محلولی از آب و الکل 40 درصد قرار می گرفت تا چین های آن باز شوند و بعد روی اسلاید سیالینیزه قرار داده شده و با فرو بردن در آب گرم داخل دستگاه حمام بافت، چین های آن کاملاً باز می گردید. در پایان، با قلم الماس، کد مخصوص بلوک مربوطه روی اسلاید حک می شد. اسلاید به مدت یک ساعت در فور با دمای 60 درجه سانتی گراد و مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد قرار می گرفت تا برش بافت، خوب به اسلاید سیالینیزه بچسبد و طی مراحل رنگ آمیزی جدا نشود. بلوک برای استفاده های بعدی نگهداری می گردید.

تصویر 9-3: دستگاه MICROTOM

4-5-4-3) رنگ آمیزی IHC
ایمونوهیستوشیمی یا ایمونوسیتوشیمی111 روشی برای تجمع آنتی ژن های خاص در بافت ها یا سلول ها براساس شناسایی آنتی ژن-آنتی بادی است. سابقه IHC به هفتاد سال قبل می رسد، لیکن در دهه 1990، شیوه عمومی استفاده از IHC در پاتولوژی جراحی کشف شد.Taylor و Burns اولین نمایش موفق آنتی ژن ها را در یک نمونه بافت پارافین اندود شده، ارائه دادند. با پیشرفت روش IHC، نقش آن در پاتولوژی تشخیصی با توجه به تشخیص و دسته بندی تومورها در پاتولوژی جراحی معلوم گردید. علاوه بر این IHC با شناسایی و نمایش مارکرهای پیش آگهی دهنده، مطابق با نیازها برای گزارش نیمه کمی نتایج پیشرفت کرد. این استفاده گسترده از IHC و نیازها برای مقایسه یافته های نیمه کمی وکیفی با افزایش تعداد آزمایشگاهها باعث تاکید بر استاندارد سازی IHC شد (Dabbs, 2013). در حال حاضر مراحل رنگ آمیزی IHC به ترتیب زیر است:
1- مرحله رتریوال112: ابتدا اسلاید در داخل فور60 درجه قرار می گرفت تا پارافین آن کاملاً ذوب شود. سپس مراحل آب دهی را انجام می دادیم. بدین ترتیب که اسلاید به ترتیب داخل ظرف های شیشه ای (بوکال) محتوی گزیلول، گزیلول – الکل (حاوی 50 درصد گزیلول و50 درصد الکل 100 درجه)، الکل 100 درجه، الکل 96 درجه، الکل 70 درجه و الکل 50 درجه، هر یک به مدت 2-1 دقیقه قرار گرفته و عبور داده می شد. در مرحله شفاف سازی، به منظور دپارافینه کردن اسلاید و حذف چربی، در گزیلول قرار می گرفت. مدت مکث حداقل 5 دقیقه و حداکثر چند روز می باشد. سپس اسلاید را داخل آب قرار می دادیم و در انتها اسلاید را داخل جار مخصوص (شکل10-3) گذاشته و آن را پر از بافر سیترات با 6=pH کرده و 25 تا 30 دقیقه به ترتیب زیر در داخل ماکروویو قرار می دادیم تا فرمالین و محل اتصال پروتئین به آنتی بادی هضم شود:
1- زمان کم – دمای بالا: 5 دقیقه در بالاترین دمای ماکروویو (دمای جوش آب) حدود w900 .
2-زمان زیاد -دمای پایین: 20 تا 25 دقیقه در پایین ترین دمای ماکروویو ، حدود w 180.
سپس جار حاوی اسلاید و محلول رتریوال داخل آب سرد قرار می گرفت تا سرد شوند.

تصویر 10-3: جار مخصوص رتریوال

2- مرحله پراکسیداز: محلول10 درصد آب اکسیژنه ( به ازای 9 سی سی الکل 100 درجه متانول، 1 سی سی آب اکسیژنه) را با سمپلر روی اسلاید در داخل اتاق تاریک و مرطوب، ریخته و به مدت 10 دقیقه صبر می کردیم. سپس اسلاید را به مدت 5 دقیقه داخل بافر فسفات قرار داده و دور محدوده بافت را با ماژیک داکو، خط113 می کشیدیم تا از اتلاف آنتی بادی و خشک شدن اسلاید حین رنگ آمیزی ممانعت کنیم.
3- مرحله آنتی بادی اولیه: آنتی بادی اولیه را که همیشه باید در یخچال با دمای 4- درجه سانتی گراد نگهداری شود، بر اساس غلظت های تایید شده بر روی کنترل مثبت نمونه های بافتی غیر از مغز، که در بروشور آنتی بادی برای هر مولکول ذکر شده، با محلول رقیق کننده آنتی بادی، رقیق و تست نموده و سپس با غلظت ست114 شده یعنی 1:200، اسلاید را در اتاق تاریک به مدت یک ساعت و 45 دقیقه انکوبه115 می نمودیم. سپس مجدداً اسلاید به مدت 5 دقیقه در بافر فسفات قرار می گرفت.
بافت کنترل مثبت مولکول ها از این قرار است:
STAT-3: بافت ریه (Neuclear and cytoplasmic staining)، SOCS-3: بافت تخمدان (Cytoplasmic staining)،-P52 NFκB: بافت آندومتر رحم (Cytoplasmic staining)،NFκB-P65: بافت روده بزرگ (Cytoplasmic staining) و IκBα: بافت پستان (Neuclear and cytoplasmic staining).
4-مرحله آنتی بادی ثانویه: آنتی بادی ثانویه را که همیشه باید در یخچال با دمای 4- درجه سانتی گراد نگهداری شود، پس از ست کردن میزان رقت، با محلول رقیق کننده آنتی بادی به صورت 1:200 رقیق نموده و آن را با استفاده از سمپلر روی اسلاید در اتاق تاریک ریخته و 45 دقیقه اسلاید را انکوبه نموده و سپس مجدداً اسلاید به مدت 5 دقیقه در بافر فسفات قرار می گرفت (شکل 11-3).

5-مرحله کروموژن (واکنش رنگی): اسلاید را در اتاق تاریک قرار داده و محلول 5 درصد کروموژن (به ازای هر 1000لاندا116 محلولDAB ،50 لاندا کروموژن) را با سمپلر روی آن ریخته و به مدت 5 تا 15 دقیقه صبر می کردیم. در صورت مثبت بودن واکنش، رنگ بافت به طلایی تا قهوه ای تغییر می کرد. سپس اسلاید با آب در داخل بوکال شستشو داده می شد.

تصویر11-3: آنتی بادی های اولیه و ثانویه خریداری شده از شرکت Santa Cruz Biotechnology

6-رنگ آمیزی هسته ها: اسلاید به مدت 30 ثانیه تا یک دقیقه، جهت رنگ آمیزی هسته ها در داخل رنگ هماتوکسیلین قرار گرفته، پس از آن در آب شسته شده و سپس مراحل آب گیری از اسلاید بدین صورت انجام می شد که اسلاید به ترتیب در بوکال های محتوی الکل 50 درجه، الکل 70 درجه و الکل 96 درجه (هر یک مدت30 ثانیه)، الکل 100 درجه و گزیلول- الکل (حاوی 50% گزیلول و 50% الکل 100 درجه)، (هر یک مدت 2-1 دقیقه) و نهایتاً گزیلول (به منظور الکل گیری و شفاف سازی)، به مدت 5 دقیقه قرار گرفته و عبور داده می شد.
7-مونت کردن117 اسلاید: اسلاید از گزیلول خارج شده با گاز بافت های اضافه آن را پاک کرده و با استفاده از چسب گزیلوفلوئید، یک لامل را روی قسمت حاوی بافت می چسباندیم . سپس کد اسلاید را با ماژیک با رنگ ثابت118 روی انتهای اسلاید نوشته و چند دقیقه صبر می کردیم تا کاملاً خشک شود.

6-4-3) روش استخراج اطلاعات از اسلاید ها:
با استفاده از میکروسکوپ نوری و با بزرگ نمایی 100 (با استفاده از روغن)، چهار فیلد مشابه، حاوی صد سلول، در زیر ناحیه ضربه خورده جهت شمارش سلولی توسط پاتولوژیست انتخاب شده و شمارش سلول های دارای هر یک از پنج مولکول مورد پژوهش و نیز شاخص های هیستوپاتولوژیک: احتقان119، ادم بافتی120، دژنراسیون نورونی121 ، آپوپتوز نورونی122 و گلیوز123 طبق فرم مخصوص (تصویر12-3)، انجام گردید.

تصویر 12-3: فرم جمع آوری اطلاعات پاتولوژی

5-3) تجزیه و تحلیل آماری
جهت آنالیز اطلاعات به دست آمده، در مورد مقایسه محتوای آب مغز، از آزمون ANOVA و جهت مقایسه بین گروه های مختلف، آزمون Tukey Post Hoc استفاده گردید. در مورد آنالیز درصد سلول های مغزی حاوی هر پنج مولکول و نیز یافته های هیستوپاتولوژی بررسی شده در این پژوهش، از آزمون ناپارامتری Kruskal-Wallis استفاده شد و در مورد مقایسه های بین گروهی این متغیرها، آزمون Mann-Whitney مورد استفاده قرار گرفت. تحلیل های آماری با استفاده ازSPSS19 انجام گردید و سطح معنی داری 05/0 در نظر گرفته شد.

الف) تغییرات خیز مغزی (BWC) در حیوانات گروه های مختلف:
در نمودار 1-4، تغییرات محتوای آب مغز در گروه های کنترل، شم، ضربه مغزی، حلال و حلال+حلال نشان داده شده است. محتوای آب مغز درگروه های TBI(%36/0±6/75)، Veh (%25/0±9/74) و Veh+Veh(%1/0±2/74)، نسبت به گروه کنترل با P<0.001 افزایش معنی دار داشته است. هم چنین گروه TBI با P<0.001، گروه Vehبا P<0.01 و گروه Veh+Veh با P<0.05 نسبت به گروه شم، افزایش معنی دار دارند.

نمودار1-4: مقایسه محتوای آب مغز (%) در گروه های مختلف مطالعه (n=6). یافته ها بر اساس Mean ± SEM گزارش شده است. *** P<0.001، اختلاف معنی دار گروه های TBI،Veh و Veh+Veh با گروه کنترل. ### P<0.001، اختلاف معنی دار گروهTBI با گروه شم. P<0.01 ##، اختلاف معنی دار گروهVeh با گروه شم. # P<0.05، اختلاف معنی دار گروهVeh+Veh با گروه شم. Ctrl (کنترل)، Sh (شم فاقد تخمدان)، TBI(ترومای مغزی)، Veh(حلال) و Veh+Veh (حلال+حلال).

در نمودار 2-4، تغییرات محتوای آب مغز در گروه های TBI، Veh،E1 و E2 نشان داده شده است. محتوای آب مغز در گروه های E1 (%23/0±73) و E2 (%36/0±7/72) نسبت به گروه TBI باP<0.001، کاهش معنی دار نشان داده است. هم چنین گروه E1 نسبت به گروه Veh با P<0.01، کمتر و معنی دار است و گروه E2 با P<0.001، نسبت به گروه Veh کاهش معنی دار داشته است.

نمودار2-4: مقایسه محتوای آب مغز (%) در گروه های TBI،Veh، E1و E2 (n=6). یافته ها بر اساس Mean ± SEM گزارش شده است. *** P<0.001، اختلاف معنی دار گروه هایE1 و E2 با گروه TBI. P<0.01 ## ، اختلاف معنی دار گروه E1 با گروه Veh. P<0.001 ###، اختلاف معنی دار گروه E2 با گروه Veh. TBI(ترومای مغزی)، Veh (حلال) ،E1 (استروژن با دز کم) و E2 (استروژن با دز زیاد).

تغییرات محتوای آب مغز در گروه های TBI، Veh، P1 و P2 در نمودار 3-4 نشان داده شده است. محتوای آب مغز در گروه های P1 (%42/0±3/72) و P2 (%47/0±5/72) نسبت به گروه های TBI وVeh کمتر و معنی دار است (P<0.001).

نمودار3-4: مقایسه محتوای آب مغز (%) در گروه های TBI، Veh، P1و P2 (n=6). یافته ها بر اساس Mean ± SEM گزارش شده است. ***P<0.001، اختلاف معنی دار گروه های P1 و P2 با گروه TBI . ### P<0.001، اختلاف معنی دار گروه های P1 و P2 با گروه Veh. TBI(ترومای مغزی)، Veh (حلال) ، P1(پروژسترون با دز کم) و P2(پروژسترون با دز زیاد).

در نمودار 4-4 تغییرات محتوای آب مغز در گروه های TBI، Veh+Vehو E2+P1 نشان داده شده است. محتوای آب مغز در گروه P1 E2+ (%13/0±3/73) نسبت به گروه TBI باP<0.001 و نسبت به گروه Veh+Veh باP<0.05 ، اختلاف معنی دار نشان داده است.

نمودار4-4: مقایسه محتوای آب مغز (%) در گروه های TBI، Veh+Vehو E2+P1 (n=6). یافته ها بر اساس Mean ± SEM گزارش شده است. ***P<0.001 ، اختلاف معنی دار گروه E2+P1 با گروه TBI. P<0.05 # ، اختلاف معنی دار گروه E2+P1 با گروه .Veh+Veh TBI(ترومای مغزی)، Veh+Veh (حلال+حلال) و E2+P1 (استروژن با دز زیاد+پروژسترون با دز کم).

در نمودار 5-4، مقایسه تغییرات محتوای آب مغز در چهار گروه درمانی منفرد استروئیدهای جنسی یعنی: E1 ، E2،P1 و P2 نشان داده شده است. محتوای آب مغز در گروه P1 نسبت به سه گروه دیگر کمتر است، اما معنی دار نمی باشد.

نمودار5-4: مقایسه محتوای آب مغز (%) در چهار گروه درمانی E1 ، E2،P1 و P2 (n=6). یافته ها بر اساس Mean ± SEM گزارش شده است. E1 (استروژن با دز کم)، E2 (استروژن با دز زیاد)، P1 (پروژسترون با دز کم) و ) P2پروژسترون با دز زیاد(.

در نمودار 6-4، محتوای آب مغز در سه گروه درمانی E2، P1 و گروه ترکیبی (P1 E2+) نشان داده شده است. محتوای آب مغز در گروه E2 نسبت به گروه درمانی ترکیبی E2+P1 (%13/0±3/73) کمتر است اما معنی دار نمی باشد. هم چنین محتوای آب مغز در گروه P1 نسبت به گروه E2+P1 باP<0.05 کاهش معنی دار نشان داده است.

نمودار6-4: مقایسه محتوای آب مغز (%) در سه گروه درمانی E2، P1و P1 E2+ (n=6). یافته ها بر اساس Mean ± SEM گزارش شده است.* P<0.05 ، اختلاف معنی دار گروهP1 با گروه E2+P1. E2 (استروژن با دز زیاد)، P1(پروژسترون با دز کم) و E2+P1 (استروژن با دز زیاد+پروژسترون با دز کم).

ب) یافته های مولکولی با روش رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی(IHC)
درصد p-STAT-3 Positive Cells در گروه های مختلف حیوانات:

تصویر 13-4: مقایسه سلول های p-STAT-3مثبت یافت شده در مغز با رنگ آمیزی IHC (100×) در گروه های مختلف: A) Sham، ↙: یک میکروگلیای p-STAT-3مثبت. B) TBI، ↙: ادم بافتی. C) Veh ، ↙: یک آستروسیت p-STAT-3 مثبت. D) Veh+ Veh، ↙: یک نورون حاوی p-STAT-3.

تصویر 14-4: مقایسه سلول های p-STAT-3مثبت یافت شده در مغز با رنگ آمیزی IHC (100×) در گروه های مختلف: A) E1، ↙: یک میکروگلیای p-STAT-3 مثبت. B) E2، ↙: نورون های IHC منفی. C) P1، ↙: یک میکروگلیای دارای.p-STAT-3 D) P2، ↙: یک میکروگلیای حاوی p-STAT-3.

میانگین تعداد p-STAT-3 positive cells یافت شده در مغز، با رنگ آمیزی به روش IHC، در گروه های کنترل، شم، ضربه مغزی، حلال و حلال+حلال در نمودار 7-4 آورده شده است. درصد سلول هایی که p-STAT-3 آنها مثبت است، در گروه هایTBI (%66/0±6/3)، Veh(%33/0±3/3) و Veh+Veh(%57/0±3) نسبت به گروه کنترل و شم بیشتر است، اما این افزایش فقط در گروه TBI نسبت به گروه کنترل، معنی دار می باشد (P<0.05).

نمودار7-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های p-STAT-3مثبت یافت شده در مغز (%) در گروه های مختلف مطالعه. یافته ها بر اساس Mean ± SEM گزارش شده است.* P<0.05، اختلاف معنی دار گروه TBI با گروه کنترل. Ctrl (کنترل)، Sh (شم فاقد تخمدان)، TBI(ترومای مغزی)، Veh (حلال) و Veh+Veh(حلال+حلال).

در نمودار 8-4، میانگین تعداد p-STAT-3 positive cells یافت شده درگروه های TBI، Veh،E1 و E2 مقایسه شده است. درصد سلول هایی که p-STAT-3 مثبت می باشند، درگروه های E1 (%66/0±6/2) و E2 (%33/0±3/1) نسبت به گروه هایTBI و Veh کمتر می باشد و کاهش درگروه E2 نسبت به گروهVeh معنی دار است (P<0.05).

نمودار8-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های p-STAT-3 مثبت مغز (%) در گروه های TBI،Veh ،E1 و E2. یافته ها بر اساس Mean ± SEM گزارش شده است. *P<0.05 ، اختلاف معنی دار گروهE2 با گروهVeh . TBI(ترومای مغزی)، Veh (حلال) ،E1 (استروژن با دز کم) و E2 (استروژن با دز زیاد).

میانگین تعداد سلول هایی در مغز که p-STAT-3 آنها مثبت است، درگروه های TBI، Veh،P1 و P2 در نمودار 9-4 نشان داده شده است. درصد سلول های p-STAT-3 مثبت در گروه های P1 (%33/0±3/2) و P2(%33/0±3/2) نسبت به گروه TBI و Vehکمتر است، اما معنی دار نمی باشد.

نمودار9-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های p-STAT-3مثبت در مغز (%) در گروه های TBI، Veh ، P1و P2. یافته ها بر اساس Mean ± SEM گزارش شده است. TBI(ترومای مغزی)، Veh (حلال)، P1(پروژسترون با دز کم) و P2 (پروژسترون با دز زیاد).

میانگین تعداد p-STAT-3 positive cells یافت شده با روشIHC در مغز گروه های TBI، Veh+Veh و E2+P1 در نمودار 10-4 نشان داده شده است. درصد سلول هایp-STAT-3 مثبت در گروه های P1 E2+ (%88/0±6/2) نسبت به گروه های TBI وVeh+Veh کاهش یافته است، گرچه از نظر آماری معنی دار نمی باشد.

نمودار10-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های p-STAT-3 مغز (%) در گروه های TBI، Veh+Vehو E2+P1. یافته ها بر اساس Mean ± SEM گزارش شده است. TBI (ترومای مغزی)، Veh+Veh(حلال+حلال) و E2+P1 (استروژن با دز زیاد+پروژسترون با دز کم).

در نمودار 11-4، میانگین تعداد سلول هایی در مغز که p-STAT-3 آنها مثبت است، در چهار گروه تحت درمان با E1 ، E2،P1 و P2 نشان داده شده است. درصد سلول های p-STAT-3 در گروه E2 (%33/0±3/1) نسبت به سه گروه دیگر کمتر می باشد اما فاقد معنی داری آماری است.

نمودار11-4: مقایسه میانگین تعداد سلول ها یp-STAT-3 مثبت مغز (%) در چهار گروه E1 ، E2،P1 و P2. یافته ها بر اساس Mean ± SEM گزارش شده است. E1(استروژن با دز کم)، E2 (استروژن با دز زیاد)، P1 (پروژسترون با دز کم) و ) P2پروژسترون با دز زیاد(.

نمودار 12-4، میانگین تعداد p-STAT-3 positive cells یافت شده در مغز را در سه گروه درمانی E2،P1 و P1 E2+ نشان می دهد. تعداد سلول های دارایp-STAT-3 در گروه ترکیبی افزایش یافته است، اگرچه فاقد معنی داری می باشد.

نمودار12-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های p-STAT-3 مغز (%) در سه گروه درمانی E2،P1 و P1 E2+. یافته ها بر اساسMean ± SEM گزارش شده است. E2 (استروژن با دز زیاد)،P1 (پروژسترون با دز کم) و E2+P1(استروژن با دز زیاد+پروژسترون با دز کم(.

 درصدSOCS-3 Positive Cells در گروه های مختلف حیوانات:

تصویر 15-4: مقایسه سلول های SOCS-3مثبت یافت شده در مغز با رنگ آمیزیIHC (100×) در گروه های مختلف: A) Sham، ↙: یک آستروسیت SOCS-3 مثبت. B) TBI، ↙: یک نورون SOCS-3مثبت. C) Veh، ↙: نورون های SOCS-3 مثبت. D) Veh+ Veh، ↙: نورون های حاوی SOCS-3.

تصویر 16-4: مقایسه سلول های SOCS-3مثبت یافت شده در مغز با رنگ آمیزیIHC (100×) در گروه های مختلف: A)E1 ، ↙: نورون های SOCS-3 مثبت. B) E2، ↙: آستروسیت های دارای SOCS-3. C) P1 ، ↙: نورون های SOCS-3 مثبت. D) P2، ↙: یک میکروگلیای حاوی SOCS-3.

میانگین تعداد SOCS-3 positive cells یافت شده در مغز که با روش IHC به دست آمده، در گروه های کنترل، شم، ضربه مغزی، حلال و حلال+حلال در نمودار 13-4، نشان داده شده است. درصد سلول های SOCS-3 مثبت، در گروه TBI (%33/0±6/0) نسبت به گروه های کنترل و شم کاهش یافته و در گروه های Veh(%66/0±3/1) و Veh+Veh(%33/0±3/1) نسبت به گروه های دیگر بیشتر شده است اما هیچ کدام معنی دار نمی باشند.

نمودار 13-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های SOCS-3 مثبت مغز (%) در گروه های مختلف مطالعه. یافته ها بر اساس Mean ± SEM گزارش شده است. Ctrl (کنترل)، Sh (شم فاقد تخمدان)، TBI(ترومای مغزی)، Veh (حلال) و Veh+Veh (حلال+حلال).

در نمودار 14-4، میانگین تعداد سلول های SOCS-3 مثبت در مغز گروه های TBI، Veh،E1 و E2 نشان داده شده است. تعداد سلول هایSOCS-3 مثبت در گروه هایE1 (%33/0±6/2) و E2 (%33/0±6/4) نسبت به گروه هایTBI وVeh افزایش یافته و اختلاف هر دو گروه استروژن با گروه TBI باP<0.05 ، معنی دار است. هم چنین اختلاف گروه E2 با Veh نیز باP<0.05 ، معنی دار می باشد.

نمودار14-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های SOCS-3 مثبت مغز (%) در گروه های TBI،Veh ،E1 و E2. یافته ها بر اساس Mean ± SEM گزارش شده است. *P<0.05 ، اختلاف گروه های E1 وE2 با گروه TBI. # P<0.05، اختلاف گروه E2 با گروه Veh.
TBI (ترومای مغزی)، Veh (حلال) ،E1 (استروژن با دز کم) و E2(استروژن با دز زیاد).

میانگین تعداد SOCS-3 positive cells یافت شده در مغز گروه های TBI، Veh،P1 و P2 در نمودار 15-4 مقایسه شده است. تعداد سلول های SOCS-3مثبت در گروه های P1 (%15/1±3) و P2 (%33/0±3/2) نسبت به گروه های TBI و Veh، افزایش یافته است. اختلاف گروه P2 نسبت به گروه TBI باP<0.05 ، معنی دار است.

نمودار15-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های SOCS-3 مثبت مغز (%) در گروه هایTBI ، Veh، P1و P2. یافته ها بر اساس Mean ± SEM گزارش شده است. * P<0.05، اختلاف معنی دار گروه P2 با گروه TBI. TBI (ترومای مغزی)، Veh (حلال)، P1 (پروژسترون با دز کم) و P2(پروژسترون با دز زیاد).

در نمودار 16-4، میانگین تعداد SOCS-3 positive cells یافت شده در مغز گروه هایTBI، Veh+Vehو E2+P1 نشان داده شده است. تعداد سلول های SOCS-3 مثبت در گروه های P1 E2+ (%57/0±4/0) نسبت به گروه های TBI و Veh+Veh افزایش یافته و افزایش آن نسبت به هر دو گروه فوق معنی دار بوده است (P<0.05).

نمودار16-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های SOCS-3مثبت مغز (%) در گروه هایTBI، Veh+Vehو E2+P1. یافته ها بر اساس Mean ± SEM گزارش شده است.*P<0.05 ، اختلاف معنی دار گروه E2+P1 با گروه TBI. #P<0.05 ، اختلاف معنی دار گروه E2+P1 با گروه Veh+Veh.TBI (ترومای مغزی)، Veh+Veh (حلال+حلال) و E2+P1 (استروژن با دز زیاد+پروژسترون با دز کم).

میانگین تعداد سلول های مغزی که SOCS-3 مثبت هستند، در چهار گروه درمانی منفرد: E1 ، E2،P1 و P2 در نمودار 17-4 ، مقایسه شده است. تعداد سلول های SOCS-3 مثبت در گروه E2 (%33/0±6/4) نسبت به سه گروه دیگر بیشتر است و نسبت به گروه های E1 و P2، این افزایش، معنی دار می باشد (P<0.05).

نمودار17-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های SOCS-3مثبت مغز (%) در چهار گروه درمانی E1 ، E2،P1 وP2. یافته ها بر اساس Mean ± SEM گزارش شده است. *P<0.05 ، اختلاف معنی دار گروهE2 با گروه E1. # P<0.05، اختلاف معنی دار گروه E2 با گروه P2. E1 (استروژن با دز کم)، E2 (استروژن با دز زیاد)، P1 (پروژسترون با دز کم) و ) P2پروژسترون با دز زیاد(.

نمودار 18-4 میانگین تعداد SOCS-3 positive cells یافت شده در مغز با استفاده از روش IHC، در سه گروه درمانی E2،P1 و P1 E2+ مقایسه شده است. تعداد سلول های SOCS-3 مثبت درگروه E2 بیشتر است، اما اختلاف آن با هیچ یک از دو گروه، معنی دار نمی باشد.

نمودار18-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های SOCS-3مثبت مغز (%) در سه گروه درمانی E2،P1 و P1 E2+. یافته ها بر اساس Mean ± SEM گزارش شده است. E2 (استروژن با دز زیاد)، P1(پروژسترون با دز کم) و E2+P1(استروژن با دز زیاد+پروژسترون با دز کم).

درصد NFκB-P52 Positive Cells در گروه های مختلف حیوانات:

تصویر17-4: مقایسه سلول های NFκB-P52مثبت یافت شده در مغز با رنگ آمیزی IHC (100×) در گروه های مختلف: A) Sham، ↙: نورون های NFκB-P52 مثبت. B) TBI، ↙: یک میکروگلیای دارای NFκB-P52 . C) Veh، ↙: یک آستروسیت NFκB-P52 مثبت. D) Veh+ Veh، ↙: میکروگلیاهای حاوی NFκB-P52.

تصویر 18-4: مقایسه سلول های NFκB-P52مثبت یافت شده در مغز با رنگ آمیزی IHC (100×) در گروه های مختلف: A) E1، ↙: ادم بافتی. B) E2، ↙: سه میکروگلیای دارایNFκB-P52 . C) P1 ، ↙: یک آستروسیت NFκB-P52 مثبت. D ) P2، ↙: یک نورو ن حاوی NFκB-P52.

میانگین تعداد NFκB-P52 positive cells یافت شده در مغز که با روش IHC به دست آمده است، در گروه های کنترل، شم، ضربه مغزی، حلال و حلال+حلال در نمودار 19-4، نشان داده شده است. درصد سلول های NFκB-P52مثبت، در گروه های TBI(%10±4)، Veh(%57/0±5) و Veh+Veh(%1±5) نسبت به گروه های کنترل و شم افزایش یافته است، اما از نظر آماری معنی دار نمی باشد.

نمودار19-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های NFκB-P52مثبت مغز (%) در گروه های مختلف مطالعه. یافته ها بر اساس Mean ± SEM گزارش شده است. Ctrl (کنترل)، Sh (شم فاقد تخمدان)، TBI(ترومای مغزی)، Veh(حلال) و Veh+Veh (حلال+حلال).

در نمودار 20-4، میانگین تعداد سلول هایNFκB-P52 مثبت مغز درگروه های TBI، Veh، E1 وE2 نشان داده شده است. تعداد سلول های NFκB-P52 مثبت در گروه های E1 (%66/0±6/2) و E2 (%33/0±6/1) نسبت به گروه های TBI و Veh کاهش یافته است و این کاهش در گروه E2 نسبت به گروه Veh معنی دار می باشد (P<0.05).

نمودار20-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های NFκB-P52 مثبت مغز (%) در گروه های TBI،Veh ، E1 و E2. یافته ها بر اساس Mean ± SEM گزارش شده است. * P<0.05، اختلاف معنی دار گروه E2 با گروهVeh . TBI(ترومای مغزی)، Veh (حلال) ،E1 (استروژن با دز کم) و E2(استروژن با دز زیاد).

در نمودار 21-4، میانگین تعداد NFκB-P52 positive cells مغز در گروه های TBI، Veh،P1 و P2 مقایسه شده است. تعداد سلول های NFκB-P52مثبت در گروه های P1 (%1±4) و P2 (%15/1±4) نسبت به گروه های TBI و Vehکاهش یافته است، اما فاقد معنی داری می باشد.

نمودار21-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های NFκB-P52 مثبت مغز (%) در گروه هایTBI،Veh ، P1و P2. یافته ها بر اساس Mean ± SEM گزارش شده است. TBI(ترومای مغزی)، Veh (حلال)، P1(پروژسترون با دز کم) و P2(پروژسترون با دز زیاد).

در نمودار 22-4 میانگین تعداد سلول هایی در مغز که NFκB-P52 مثبت دارند، در گروه های TBI، Veh+Veh و E2+P1 نشان داده شده است. تعداد سلول های NFκB-P52مثبت در گروه های P1 E2+ (%33/0±3) نسبت به گروه های TBI وVeh+Veh کاهش نشان داده است.

نمودار22-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های NFκB-P52مثبت مغز (%) در گروه هایTBI، Veh+Vehو E2+P1. یافته ها بر اساس Mean ± SEM گزارش شده است. TBI(ترومای مغزی)، Veh+Veh (حلال+حلال) و E2+P1(استروژن با دز زیاد+پروژسترون با دز کم).

در نمودار23-4، میانگین تعداد NFκB-P52 positive cells یافت شده در مغز در چهار گروه درمانی منفرد: E1، E2،P1 و P2 مقایسه شده است. تعداد سلول های NFκB-P52 مثبت در گروه E2 (%33/0±6/1) نسبت به سه گروه دیگر کاهش بیشتری نشان داده است، اما معنی دار نمی باشد.

نمودار23-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های NFκB-P52مثبت مغز (%) در چهار گروه درمانی E1 ، E2،P1 و P2. یافته ها بر اساس Mean ± SEM گزارش شده است. E1(استروژن با دز کم)، E2 (استروژن با دز زیاد)، P1 (پروژسترون با دز کم) و ) P2پروژسترون با دز زیاد(.

میانگین تعداد NFκB-P52 positive cells یافت شده در مغز در سه گروه درمانی E2،P1 و P1 E2+ در نمودار 24-4 نشان داده شده است. تعداد سلول های NFκB-P52 در گروه E2کمتر از دو گروه دیگر است و با گروه ترکیبی، اختلاف معنی دار دارد (P<0.05).

نمودار24-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های NFκB-P52مثبت مغز (%) در سه گروه درمانی E2،P1 و P1 E2+. یافته ها بر اساس Mean ± SEM گزارش شده است. P<0.05 *، اختلاف معنی دار گروه E2 با گروه E2+P1. E2 (استروژن با دز زیاد)، P1 (پروژسترون با دز کم) و E2+P1 (استروژن با دز زیاد+پروژسترون با دز کم).

 درصد p-NFκB-P65 Positive Cells در گروه های مختلف حیوانات:

تصویر19-4: مقایسه سلول های p-NFκB-P65 مثبت یافت شده در مغز با رنگ آمیزی IHC (100×) در گروه های مختلف: A) Sham، ↙: یک آستروسیت p-NFκB-P65مثبت. B) TBI، ↙: یک نورون دارای p-NFκB-P65. C) Veh ، ↙: نورون های دارای p-NFκB-P65. D) Veh+ Veh، ↙: یک آستروسیت حاوی p-NFκB-P65.

تصویر20-4: مقایسه سلول های p-NFκB-P65مثبت یافت شده در مغز با رنگ آمیزی IHC (100×) در گروه های مختلف: A) E1، ↙: یک آستروسیت IHCمنفی. B) E2، ↙: یک میکروگلیای حاوی p-NFκB-P65. C)P1 ، ↙: یک میکروگلیای p-NFκB-P65 مثبت. D) P2، ↙: یک نورو ن IHCمنفی.

در نمودار 25-4، میانگین تعداد positive cells p-NFκB-P65یافت شده در مغز، که توسط آزمایش IHC به دست آمده، در گروه های کنترل، شم، ضربه مغزی، حلال و حلال+حلال نشان داده شده است. میانگین درصد سلول ها یp-NFκB-P65 مثبت در گروه های TBI(%52/1±9) ،Veh (%33/1±6/8) و Veh+Veh(%1±8) نسبت به گروه شم افزایش معنی دار یافته است (P<0.05).

نمودار25-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های p-NFκB-P65مثبت مغز (%) در گروه های مختلف مطالعه. یافته ها بر اساس Mean ± SEM گزارش شده است. * P<0.05، اختلاف معنی دار گروه شم با گروه کنترل. # P<0.05، اختلاف معنی دار گروه های TBI، Veh و Veh+Veh با گروه شم.Ctrl (کنترل)، Sh (شم فاقد تخمدان)، TBI (ترومای مغزی)، Veh (حلال) و Veh+Veh (حلال+حلال).

در نمودار26-4، میانگین تعداد سلول های مغزی که p-NFκB-P65مثبت دارند، در گروه های TBI، Veh،E1 و E2 نشان داده شده است. تعداد سلول های p-NFκB-P65 مثبت در گروه های E1 (%66/0±3/5) و E2 (%33/0±6/3) نسبت به گروه های TBI و Veh کاهش یافته است و این کاهش در گروه E2 نسبت به هر دوگروه TBI و Vehمعنی دار است (P<0.05).

نمودار26-4: مقایسه میانگین تعداد سلول ها ی p-NFκB-P65مثبت مغز (%) در گروه هایTBI ، Veh ،E1 وE2. یافته ها بر اساس Mean ± SEM گزارش شده است. * P<0.05، اختلاف معنی دار گروه E2 با گروه TBI. # P<0.05، اختلاف معنی دار گروهE2 با گروه Veh. TBI(ترومای مغزی)، Veh (حلال) ،E1 (استروژن با دز کم) و E2(استروژن با دز زیاد).

میانگین تعداد positive cells p-NFκB-P65یافت شده در مغز گروه های TBI، Veh،P1 و P2 در نمودار 27-4 نشان داده شده است. تعداد سلول های p-NFκB-P65مثبت در گروه های P1 (%33/0±6/5) و P2 (%66/0±6/5) نسبت به گروه های TBI و Veh کاهش یافته است، اما معنی دار نمی باشد.

نمودار27-4: مقایسه میانگین تعداد سلول هایp-NFκB-P65 مثبت مغز (%) در گروه های TBI، Veh،P1 و P2. یافته ها بر اساس Mean ± SEMگزارش شده است. TBI(ترومای مغزی)، Veh (حلال)، P1 (پروژسترون با دز کم) و P2 (پروژسترون با دز زیاد).

در نمودار 28-4 میانگین تعداد سلول هایی در مغز که p-NFκB-P65 مثبت دارند، درگروه های TBI، Veh+Vehو E2+P1 نشان داده شده است. تعداد سلول های p-NFκB-P65مثبت در گروه هایP1 E2+ (%57/0±5) نسبت به گروه های TBI و Veh+Veh کاهش نشان داده است، لیکن فاقد معنی داری می باشد.

نمودار28-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های p-NFκB-P65مثبت مغز (%) در گروه هایTBI، Veh+Vehو E2+P1. یافته ها بر اساس Mean ± SEM گزارش شده است. TBI(ترومای مغزی)، Veh+Veh (حلال+حلال) و E2+P1 (استروژن با دز زیاد+پروژسترون با دز کم).

میانگین تعداد p-NFκB-P65 positive cellsیافت شده در مغز، در چهار گروه درمانی منفرد: E1 ، E2،P1 و P2در نمودار 29-4، نشان داده شده است. تعداد سلول هایp-NFκB-P65 مثبت در گروه E2 (%33/0±6/3) نسبت به سه گروه دیگر کاهش بیشتری در این مولکول ایجاد کرده است. اختلاف گروه E2 با گروه هایP1 و P2 معنی دار می باشد (P<0.05).

نمودار29-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های p-NFκB-P65مثبت مغز (%) در چهار گروه درمانی منفرد E1 ، E2،P1 و P2. یافته ها بر اساس Mean ± SEM گزارش شده است. * P<0.05، اختلاف معنی دار گروه E2 با گروه های P1و P2. E1 (استروژن با دز کم)، E2 (استروژن با دز زیاد)، P1 (پروژسترون با دز کم) و ) P2پروژسترون با دز زیاد(.

در نمودار30-4، میانگین تعداد سلول های p-NFκB-P65 مثبت یافت شده در مغز، در سه گروه درمانی E2، P1و P1 E2+ نشان داده شده است. تعداد سلول هایp-NFκB-P65 مثبت در گروه E2، نسبت به دو گروه دیگر کمتر است و همان طور که قبلاً بیان شد، اختلاف آن ها معنی دار می باشد (P<0.05).

نمودار30-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های p-NFκB-P65مثبت مغز (%) در سه گروه درمانی E2، P1 و P1 E2+. یافته ها بر اساسMean ± SEM گزارش شده است. * P<0.05، اختلاف معنی دار گروه E2 با گروه E2 .P1 (استروژن با دز زیاد)، P1(پروژسترون با دز کم) و E2+P1 (استروژن با دز زیاد+پروژسترون با دز کم).

 درصد p-IκBα Positive Cells در گروه های مختلف حیوانات:

تصویر 21-4: مقایسه سلول های p-IκBα مثبت یافت شده در مغز با رنگ آمیزی IHC (100×) در گروه های مختلف: A) Sham، ↙: یک میکروگلیایp-IκBα مثبت. B) TBI، ↙: یک میکروگلیایp-IκBα مثبت. C) Veh، ↙: یک نورون p-IκBα مثبت. D) Veh+ Veh، ↙: نورو ن های p-IκBαمثبت.

تصویر22-4: مقایسه سلول های p-IκBα مثبت یافت شده در مغز با رنگ آمیزیIHC (100×) در گروه های مختلف: A) E1، ↙: ادم بافتی. B) E2، ↙: یک آستروسیت دارای p-IκBα. C) P1 ، ↙: یک آستروسیت p-IκBα مثبت. D) P2، ↙: یک نورونIHC منفی.

در نمودار 31-4، میانگین تعداد positive cells p-IκBα یافت شده در مغز، بدست آمده با روش IHC، درگروه های کنترل، شم، ضربه مغزی،حلال وحلال+حلال نشان داده شده است. تعداد سلول های p-IκBα مثبت، درگروه هایTBI (%57/0±3)، Veh(%66/0±6/2) و Veh+Veh(%66/0±6/2) نسبت به گروه های کنترل و شم افزایش یافته است، اما معنی دار نمی باشد.

نمودار31-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های p-IκBα مثبت مغز (%) در گروه های مختلف مطالعه. یافته ها بر اساس Mean ± SEM گزارش شده است. Ctrl (کنترل)، Sh (شم فاقد تخمدان)، TBI (ترومای مغزی)، Veh (حلال) و Veh+Veh (حلال+حلال).

در نمودار 32-4، میانگین تعداد سلول هایp-IκBα مثبت مغز در گروه های TBI، Veh،E1 وE2 مقایسه شده است. تعداد سلول های p-IκBα مثبت در گروه های E1 (%33/0±6/1) و E2 (%33/0±3/1) نسبت به گروه هایTBI و Veh کاهش یافته است و این کاهش فقط در گروه E2 نسبت به گروه TBI، معنی دار می باشد (P<0.05).

نمودار32-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های p-IκBα مثبت مغز (%) در گروه های TBI، Veh ،E1 و E2. یافته ها بر اساس Mean ± SEM گزارش شده است. * P<0.05، اختلاف معنی دار گروه E2 با گروه TBI .TBI(ترومای مغزی)، Veh (حلال)، E1 (استروژن با دز کم) و E2 (استروژن با دز زیاد).

در نمودار 33-4 میانگین تعداد positive cells p-IκBα یافت شده در مغز، در گروه های TBI، Veh،P1 و P2 نشان داده شده است. تعداد سلول های p-IκBαمثبت، در گروه های P1 (%33/0±6/1) و P2 (%57/0±2) نسبت به گروه های TBI و Vehکاهش یافته است. ضمناً کاهش ایجاد شده توسط گروه P1 بیشتر بوده است، اما معنی دار نمی باشد.

نمودار33-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های p-IκBα مغز (%) در گروه های TBI، Veh،P1 و P2. یافته ها بر اساسMean ± SEM گزارش شده است. TBI(ترومای مغزی)، Veh (حلال) ، P1(پروژسترون با دز کم) و P2 (پروژسترون با دز زیاد).

مقایسه میانگین تعداد سلول های مغز کهp-IκBα مثبت می باشند، در چهارگروه TBI، Veh+Veh و E2+P1 در نمودار 34-4 نشان داده شده است. تعداد سلول های p-IκBαدر گروه P1 E2+ (%88/0±3/1) نسبت به گروه های TBI وVeh+Veh کاهش نشان داده است، ولی فاقد معنی داری می باشد.

نمودار34-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های p-IκBαمغز (%) در گروه هایTBI ، Veh+Vehو E2+P1. یافته ها بر اساس Mean ± SEM گزارش شده است. TBI(ترومای مغزی)، Veh+Veh (حلال+حلال) و E2+P1 (استروژن با دز زیاد+پروژسترون با دز کم).

در نمودار 35-4، میانگین تعداد positive cells p-IκBα یافت شده در مغز، در چهار گروه درمانی منفرد استروئیدی: E1، E2،P1 و P2 نشان داده شده است. تعداد سلول های p-IκBα مثبت در گروه E2 (%33/0±3/1) نسبت به سه گروه دیگر کاهش بیشتری در این مولکول ایجاد کرده است، اما فاقد معنی داری می باشد.

نمودار35-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های p-IκBα مثبت مغز (%) در چهار گروه درمانی E1 ، E2،P1 و P2. یافته ها بر اساس Mean ± SEM گزارش شده است. E1(استروژن با دز کم)، E2 (استروژن با دز زیاد)، P1 (پروژسترون با دز کم) و P2 (پروژسترون با دز زیاد).

نمودار36-4 میانگین تعداد positive cells p-IκBα یافت شده در مغز، در سه گروه درمانی E2، P1 و P1 E2+ را نشان می دهد. اختلاف تعداد سلول های p-IκBα مثبت در گروه های فوق نسبت به یکدیگر معنی دار نمی باشد.

نمودار36-4: مقایسه میانگین تعداد سلول های p-IκBαمثبت مغز (%) در سه گروه درمانیE2 ،P1 و P1 E2+. یافته ها بر اساس Mean ± SEM گزارش شده است. E2 (استروژن با دز زیاد)، P1(پروژسترون با دز کم) و E2+P1(استروژن با دز زیاد+پروژسترون با دز کم).

 آنالیز p-STAT-3 Positive Cells بر اساس نوع سلول:
یکی دیگر از آنالیزهای انجام شده در این پژوهش، در ارتباط با انواع سلول (آستروسیت، میکروگلیا و نورون) هایی است که مولکول p- STAT-3 آن ها مثبت است. در جدول 1-4 نتایج این آنالیز نشان داده شده است. همان طوری که در این جدول مشاهده می شود در گروه E2 و P2 بین سلول های مختلف، اختلاف معنی دار وجود دارد، یعنی در گروه تحت درمان با E2، مولکول p-STAT-3در سلول های آستروسیت و میکروگلیا مثبت بوده، برعکس هیچ نورونی، مولکول فوق را نشان نداده است(P<0.05). هم چنین در گروه تحت درمان با P2 نیز این نتیجه تکرار شده است، یعنی مشاهده مولکول p-STAT-3 در نورون ها نسبت به میکروگلیا وآستروسیت، صفر می باشد و اختلاف معنی دار ایجاد شده است (P<0.05).

جدول1-4: تجزیه و تحلیل رنگ آمیزی IHC برای مولکول p-STAT-3 در مغز موش های صحرایی به دنبال TBIدر سلول های مختلف مغزی تحت درمان با گروه های مختلف. یافته ها بر اساس Mean ± SEM گزارش شده است.

Percentage of Positive p-STAT-3 Cells
Treatment
Neuron
Microglia
Astrocyte

15/0 ±3/0
0 ±1
12/0 ±3/1
E1
0±0 *
0 ±1
23/0 ±3/0
E2
2/0 ±3/0
33/0 ±6/1
28/0 ±3/0
P1
0 ±0 #
0 ±1
42/0 ±3/1
P2
P<0.05 *، اختلاف معنی دار نورون با میکروگلیا. # P<0.05، اختلاف معنی دار نورون با آستروسیت و میکروگلیا. E1(استروژن با دز کم)، E2 (استروژن با دز زیاد)، P1 (پروژسترون با دز کم)، P2(پروژسترون با دز زیاد).

 آنالیز SOCS-3 Positive Cells بر اساس نوع سلول:
در جدول 2-4 نتایج آنالیز سلول هایSOCS-3 مثبت در گروه های درمانی این مطالعه ارائه شده است. همان طور که در این جدول مشاهده می شود، در گروه های درمانی E1،E2 و P2 بین سلول های مختلف، اختلاف معنی دار وجود دارد، یعنی نورون های تحت درمان با E1 کمتر از میکروگلیا وآستروسیت، مولکولSOCS-3 را نشان داده اند (P<0.05). هم چنین در گروه تحت درمان با E2 نیز این نتیجه تکرار شده است (P<0.05). برعکس، درگروه تحت درمان با P1، اگرچه اختلاف بین گروه ها وجود دارد اما به گونه ایست که نورون ها بیشتر از دو نوع سلول دیگر،SOCS-3 را نشان داده اند (P<0.05).

جدول 2-4: تجزیه و تحلیل رنگ آمیزی IHC برای مولکول SOCS-3 در مغز موش های صحرایی به دنبال TBI در سلول های مختلف مغزی تحت درمان با گروه های مختلف. یافته ها بر اساس Mean ± SEM گزارش شده است.

Percentage of Positive SOCS-3 Cells
Treatment
Neuron
Microglia
Astrocyte

0 ±0 *
0 ± 1
33/0 ±6/1
E1
0 ±1 #
0 ±2
33/0 ±6/1
E2
88/0 ±3/2
1/0 ±6/0
0±0 †
P1
3/0 ±3/0
15/0 ±3/1
11/0 ±6/0
P2
* P<0.05، اختلاف معنی دار نورون با آستروسیت و میکروگلیا.# P<0.05، اختلاف معنی دار نورون با میکروگلیا. † P<0.05، اختلاف معنی دار آستروسیت با نورون. E1 (استروژن با دز کم)، E2(استروژن با دز زیاد)، P1 (پروژسترون با دز کم)،P2 (پروژسترون با دز زیاد).

آنالیز NFκB-P52 Positive Cells بر اساس نوع سلول:
نتایج آنالیز سلول های P52-NFκB مثبت در بافت مغز در گروه های درمانی متفاوت، در جدول 3-4 آمده است. همانطورکه ملاحظه می شود، هیچ اختلاف معنی داری بین انواع سلول ها در چهار گروه فوق وجود ندارد.

جدول 3-4: تجزیه و تحلیل رنگ آمیزی IHC برای مولکول NFκB-P52 در مغز موش های صحرایی به دنبال TBI در سلول های مختلف مغزی تحت درمان با گروه های مختلف. یافته ها بر اساسMean ± SEM گزارش شده است.

Percentage of Positive NFκB-P52 Cells
Treatment
Neuron
Microglia
Astrocyte

0 ±0
66/0 ±3/1
66/0 ±3/1
E1
1/0 ±6/0
11/0 ±6/0
33/0 ±3/0
E2
0±2
57/0 ±1
57/0 ±1
P1
22/0 ±6/1
1/0 ±6/1
15/0 ±6/0
P2
E1 (استروژن با دز کم)، E2(استروژن با دز زیاد)، P1 (پروژسترون با دز کم)،P2 (پروژسترون با دز زیاد).

 آنالیز p-NFκB-P65 Positive Cellsبر اساس نوع سلول:
درجدول 4-4، سلول های مغزی مختلفp-NFκB-P65 مثبت، در چهار گروه درمانی منفرد، آنالیز شده اند. در گروه E1، آستروسیت نسبت به میکروگلیا و نورون، با P<0.05، مولکولp-NFκB-P65 را کمتر نشان داده است.

جدول 4-4: تجزیه و تحلیل رنگ آمیزی IHC برای مولکولp-NFκB-P65 در مغز موش های صحرایی به دنبال TBI در سلول های مختلف مغزی تحت درمان با گروه های مختلف. یافته ها بر اساسMean ± SEM گزارش شده است.

Percentage of Positive p-NFκB-P65 Cells
Treatment
Neuron
Microglia
Astrocyte

0 ±2
57/0 ±3/0
13/0 ±2/0 *
E1
1/0 ±6/1
11/0 ±3/1
33/0 ±6/0
E2
24/0 ±1
57/0 ±3
22/0 ±6/1
P1
43/0 ±1
15/0 ±6/2
0 ± 2
P2
* P<0.05، اختلاف معنی دار آستروسیت با میکروگلیا و نورون. E1 (استروژن با دز کم)، E2(استروژن با دز زیاد)، P1 (پروژسترون با دز کم)، P2 (پروژسترون با دز زیاد).

آنالیز p-IκBα Positive Cells بر اساس نوع سلول:
نتایج آنالیز انواع سلول های p-IκBα مثبت، در چهار گروه درمانی، در جدول 5-4 نمایش داده شده است. همانطور که ملاحظه می شود در گروه P1، بین نورون و میکروگلیا، اختلاف معنی دار وجود دارد، بدین صورت که نورون ها نسبت به میکروگلیا، در پاسخ به درمان پروژسترون با دز کم، مولکول p-IκBαکمتری نشان داده اند (P<0.05).

جدول 5-4: تجزیه و تحلیل رنگ آمیزی IHC برای مولکول p-IκBα در مغز موش های صحرایی به دنبال TBI در سلول های مختلف مغزی تحت درمان با گروه های مختلف. یافته ها بر اساس Mean ± SEMگزارش شده است.

Percentage of Positive p-IκBα Cells
Treatment
Neuron
Microglia
Astrocyte

0 ±3/0
57/0 ±1
13/0 ±3/0
E1
0 ± 3/0
5/0 ±1
11/0 ±3/0
E2
0 ±0 *
0 ±1
17/0 ±6/0
P1
43/0 ±3/0
15/0 ±3/0
23/0 ± 3/1
P2
* P<0.05، اختلاف معنی دار نورون با میکروگلیا. E1 (استروژن با دز کم)، E2(استروژن با دز زیاد)، P1 (پروژسترون با دز کم)،P2 (پروژسترون با دز زیاد) .

ج) یافته های هیستوپاتولوژی124 با روش رنگ آمیزی H & E
تغییرات درصد ادم بافت مغز در گروه های مختلف حیوانات:

تصویر23-4: مقایسه ادم بافت مغز با رنگ آمیزیH&E (40×)، 24 ساعت پس از TBI در گروه های مختلف. E2 بیشتر از سایر گروه های درمانی منفرد، ادم را کاهش داده است. TBI(ترومای مغزی)، E1 (استروژن با دز کم)، E2 (استروژن با دز زیاد)،P1 (پروژسترون با دزکم) و P2 (پروژسترون با دز زیاد).

تغییرات ادم مغز که توسط یافته های هیستوپاتولوژی بدست آمده، در گروه های کنترل، شم، ضربه مغزی، حلال و حلال+حلال در نمودار 37-4 نشان داده شده است. ادم درگروه های TBI(%13/0±4/0)، Veh(%13/0±4/1) و Veh+Veh(%13/0±4/1) با P<0.001 نسبت به گروه کنترل بیشتر و معنی دار است. هم چنین گروه TBI با گروه شم با P<0.05 اختلاف معنی دار دارد و نهایتاً گروه های Vehو Veh+Vehنیز نسبت به گروه شم با P<0.001 کاهش معنی دار نشان داده اند.

نمودار 37-4: مقایسه میزان ادم بافت مغز (%) در گروه های مختلف مطالعه(n=15). یافته ها بر اساس mean ± SEM گزارش شده است. *** P<0.001 ، اختلاف معنی دار گروه TBI، Veh و Veh+Veh با گروه کنترل. # P<0.05، اختلاف معنی دار گروهTBI با گروه شم. ## P<0.01، اختلاف معنی دار گروه های Vehو Veh+Veh با گروه شم. Ctrl(کنترل)، Sh (شم فاقد تخمدان)، TBI(ترومای مغزی)، Veh (حلال) و Veh+Veh (حلال+حلال).

در نمودار 38-4، تغییرات ادم بافت مغز در گروه های TBI، Veh، E1 و E2 نشان داده شده است. ادم در گروه های E1 (%13/0±6/0) و E2 (%13/0±4/0)، نسبت به گروهTBI با اختلاف معنی داری کمتر است (P<0.01). هم چنین ادم در گروه E1 نسبت به گروهVeh با P<0.01 و در گروه E2 نسبت به گروه Veh با P<0.001 کاهش معنی دار نشان داده است.

نمودار38-4: مقایسه میزان ادم بافت مغز (%) در گروه هایTBI، Veh ،E1و E2 (n=15). یافته ها بر اساس mean ± SEM گزارش شده است. ** P<0.01، اختلاف معنی دار گروه های E1 و E2 با گروه TBI. ## P<0.01، اختلاف معنی دار گروه E1 با گروه Veh. ### P<0.001، اختلاف معنی دار گروه E2 با گروه .Veh TBI(ترومای مغزی)، Veh (حلال) ،E1 (استروژن با دز کم) و E2 (استروژن با دز زیاد).

در نمودار 39-4 تغییرات ادم بافت مغز در گروه های TBI، Veh،P1 و P2 نشان داده شده است. ادم مغز در گروه های P1 (%1/0±8/0) و P2 (%1/0±8/0) نسبت به گروه های TBIو Vehبا اختلاف معنی دار ، کاهش یافته است.

نمودار39-4: مقایسه میزان ادم بافت مغز (%) در گروه هایTBI،Veh ،P1 و P2 (n=15). یافته ها بر اساس mean ± SEM گزارش شده است.** P<0.01، اختلاف معنی دار گروه های P1 و P2 با گروه TBI. ## P<0.01، اختلاف معنی دار گروه های P1 و P2 با گروهVeh . TBI(ترومای مغزی)، Veh (حلال) ،P1 (پروژسترون با دزکم) و P2 (پروژسترون با دز زیاد).

در نمودار40-4 تغییرات ادم بافت مغز در گروه های TBI، Veh+VehوE2+P1 نشان داده شده است. ادم بافت مغز در گروه های P1 E2+ (%13/0±4/0) نسبت به گروه های TBI (P<0.01) و Veh+Veh کاهش یافته است (P<0.001).

نمودار40-4: مقایسه میزان ادم بافت مغز (%) در گروه های TBI، Veh+Vehو E2+P1 (n=15). یافته ها بر اساسmean ± SEM گزارش شده است. ** P<0.01، اختلاف معنی دار گروه E2+P1 با گروهTBI. ### P<0.001، اختلاف معنی دار گروهE2+P1 با گروه Veh+Veh. TBI(ترومای مغزی)،Veh+Veh (حلال+حلال) و E2+P1 (استروژن با دز زیاد+ پروژسترون با دز کم).

در نمودار41-4، تغییرات ادم بافت مغز در چهار گروه درمانی E1، E2،P1 و P2نشان داده شده است. میزان ادم بافت مغز در گروه E2 نسبت به دو گروه درمانی پروژسترون، کمتر است و از نظر آماری معنی دار می باشد(P<0.05).

نمودار41-4: مقایسه میزان ادم بافت مغز (%) در چهار گروه درمانی E1، E2،P1 و P2 (n=15). یافته ها بر اساس mean ± SEM گزارش شده است. * P<0.05، اختلاف معنی دار گروه E2 با گروه P1. # P<0.05، اختلاف معنی دار گروه E2 با گروه P2. E1(استروژن با دز کم)، E2 (استروژن با دز زیاد)، P1 (پروژسترون با دز کم) و ) P2پروژسترون با دز زیاد(.

مقایسه تغییرات ادم بافت مغز در سه گروه درمانی E2،P1 وP1 E2+ در نمودار 42-4 نشان داده شده است. میزان ادم بافت مغز در گروهP1 نسبت به دو گروه دیگر دارای تفاوت معنی دار است(P<0.05).

نمودار 42-4: مقایسه میزان ادم بافت مغز (%) در سه گروه درمانی E2،P1 و P1 E2+ (n=15). یافته ها بر اساس mean ± SEM گزارش شده است. * P<0.05، اختلاف معنی دار گروه E2 با گروه P1. #P<0.05 ، اختلاف معنی دار گروه E2+P1با P1. E2 (استروژن با دز زیاد)، P1(پروژسترون با دزکم) و E2+P1(استروژن با دز زیاد + پروژسترون با دز کم).

تغییرات درصد احتقان بافت مغز در گروه های مختلف حیوانات:

تصویر24-4: مقایسه احتقان بافت مغز با رنگ آمیزیH&E (40×)، 24 ساعت پس از TBI در گروه های مختلف. E1 بیشتر از سایر گروه های درمانی منفرد، احتقان را کاهش داده است. TBI(ترومای مغزی)، E1 (استروژن با دز کم)، E2 (استروژن با دز زیاد)،P1 (پروژسترون با دزکم) و P2 (پروژسترون با دز زیاد).

در نمودار43-4، تغییرات احتقان مغز که در مطالعات هیستوپاتولوژی بدست آمده، در گروه های کنترل، شم، ضربه مغزی، حلال و حلال+حلال نشان داده شده است. احتقان در گروه Veh (%35/0±9/1) با P<0.01 و در گروه Veh+Veh (%23/0±8/1) با P<0.05 نسبت به گروه کنترل افزایش معنی دار نشان داده است. اگر چه افزایش احتقان در گروه های Veh وVeh+Veh نسبت به گروه شم نیز وجود دارد اما این اختلاف از نظر آماری معنی دار نمی باشد.

نمودار 13-4: مقایسه میزان احتقان بافت مغز (%) در گروه های مختلف مطالعه(n=15). یافته ها بر اساس mean ± SEM گزارش شده است. ** P<0.01، اختلاف معنی دار گروهVeh با گروه کنترل. * P<0.05، اختلاف معنی دار گروه Veh+Vehبا گروه کنترل. Ctrl (کنترل)، Sh (شم فاقد تخمدان)، TBI(ترومای مغزی)،Veh (حلال) وVeh+Veh (حلال+حلال).

در نمودار 44-4، مقایسه تغییرات احتقان بافت مغز در گروه های TBIو Veh با گروه های تحت درمان با استروژن: E1و E2 نشان داده شده است. احتقان در گروه E1 (%15/0±7/0) نسبت به گروه هایTBI و Veh کمتر و معنی دار است(P<0.05).

نمودار44-4: مقایسه میزان احتقان بافت مغز (%) در گروه هایTBI، Veh،E1و E2 (n=15). یافته ها بر اساس mean ± SEM گزارش شده است. * P<0.05، اختلاف معنی دار گروه E1 با گروه TBI. # P<0.05، اختلاف معنی دار گروه E1 با گروه Veh. TBI(ترومای مغزی)، Veh(حلال) ،E1 (استروژن با دز کم) و E2(استروژن با دز زیاد).

تغییرات احتقان بافت مغز در گروه های TBIو Veh، در مقایسه با گروه های تحت درمان با پروژسترون:P1 و P2 در نمودار 45-4 نشان داده شده است. احتقان در گروه های P1 (%25/0±4/1) و P2 (%27/0±2) نسبت به گروه TBI و Vehکمتر است، اما معنی دار نمی باشد.

نمودار45-4: مقایسه میزان احتقان بافت مغز (%) در گروه هایTBI، Veh،P1 و P2 (n=15). یافته ها بر اساس mean ± SEM گزارش شده است. TBI (ترومای مغزی)، Veh (حلال) ، P1(پروژسترون با دز کم) و P2(پروژسترون با دز زیاد).

در نمودار 46-4 تغییرات احتقان مغز در گروه های TBI، Veh+VehوE2+P1 نشان داده شده است. احتقان مغز در گروه های P1 E2+ (%21/0±1/1) نسبت به گروه های TBI وVeh+Veh کاهش یافته و این کاهش نسبت به گروه Veh+Veh با P<0.05 معنی دار بوده است.

نمودار46-4: مقایسه میزان احتقان بافت مغز (%) در گروه هایTBI، Veh+Vehو E2+P1 (n=15). یافته ها بر اساس mean ± SEM گزارش شده است. * P<0.05، اختلاف معنی دار گروه E2+P1 با گروه.Veh+Veh TBI (ترومای مغزی)، Veh+Veh (حلال+حلال) و E2+P1 (استروژن با دز زیاد+پروژسترون با دز کم).

در نمودار 47-4 تغییرات احتقان بافت مغز در چهار گروه درمانی منفرد: E1، E2،P1 و P2نشان داده شده است. میزان احتقان مغز در گروه E1 (%15/0±7/0) نسبت به هر سه گروهE2 ،P1 (P<0.05) وP2 (P<0.01)، کمتر و معنی دار است.

نمودار47-4: مقایسه میزان احتقان بافت مغز (%) در چهار گروه درمانی E1 ، E2،P1 و P2 (n=15). یافته ها بر اساس mean ± SEM گزارش شده است. * P<0.05، اختلاف معنی دار گروه E1 با گروه E2.# P<0.05، اختلاف معنی دار گروه E1 با گروه P1. †† P<0.01، اختلاف معنی دار گروه E1 با گروه P2. E1(استروژن با دز کم)، E2 (استروژن با دز زیاد)، P1 (پروژسترون با دز کم)و ) P2پروژسترون با دز زیاد(.

تغییرات احتقان بافت مغز در سه گروه درمانی E2،P1 وP1 E2+ در نمودار 48-4 نشان داده شده است. میزان احتقان بافت مغز درگروه E2+P1 نسبت به دوگروه دیگر کمتر و فاقد معنی داری آماری است.

نمودار48-4: مقایسه میزان احتقان بافت مغز (%) در سه گروه درمانی E2،P1 و P1 E2+ (n=15). یافته ها بر اساسmean ± SEM گزارش شده است. E2 (استروژن ض1با دز زیاد)،P1 (پروژسترون با دز کم) و E2+P1(استروژن با دز زیاد+پروژسترون با دز کم).

تغییرات درصد دژنراسیون نورونی در گروه های مختلف حیوانات:

تصویر25-4: مقایسه دژنراسیون نورونی در بافت مغز با رنگ آمیزیH&E (40×)، 24 ساعت پس از TBI در گروه های مختلف. E2 بیشتر از سایر گروه های درمانی منفرد، دژنراسیون را کاهش داده است. TBI(ترومای مغزی)، E1 (استروژن با دز کم)، E2 (استروژن با دز زیاد)،P1 (پروژسترون با دزکم) و P2 (پروژسترون با دز زیاد).

در نمودار 49-4، تغییرات دژنراسیون نورون های مغز که از مطالعات هیستوپاتولوژی بدست آمده است، در گروه های کنترل، شم، ضربه مغزی، حلال و حلال+حلال نشان داده شده است. دژنراسیون نورون ها درگروه های TBI(%37/0±1/2)، Veh(%43/0±4/2) و Veh+Veh(%27/0±3/2) نسبت به گروه کنترل و شم به صورت معنی داری افزایش نشان می دهد(P<0.01).

نمودار49-4: مقایسه میزان دژنراسیون نورون های مغز (%) در گروه های مختلف مطالعه (n=15). یافته ها بر اساس mean ± SEM گزارش شده است. ** P<0.01، اختلاف معنی دار گروه های TBI، Vehو Veh+Veh با گروه کنترل. ## P<0.01، اختلاف معنی دار گروه های TBI،Vehو Veh+Veh با گروه شم. Ctrl (کنترل)، Sh (شم فاقد تخمدان)، TBI(ترومای مغزی)، Veh (حلال) وVeh+Veh (حلال+حلال).

تغییرات دژنراسیون نورون های مغز در گروه های TBI، Veh،E1 و E2 در نمودار 50-4 نشان داده شده است. میزان دژنراسیون نورون در گروهE2 (%13/0±4/1) نسبت به گروه هایTBI وVeh کمتر است و از نظر آماری معنی دار می باشد(P<0.01).

نمودار50-4: مقایسه میزان دژنراسیون نورون های مغز (%) در گروه هایTBI، Veh، E1و E2 (n=15). یافته ها بر اساس mean ± SEM گزارش شده است. P<0.05 *، اختلاف معنی دار گروه E2 با گروه TBI. # P<0.05، اختلاف معنی دار گروه E2 با گروهVeh. TBI(ترومای مغزی)، Veh (حلال) ،E1 (استروژن با دز کم) و E2(استروژن با دز زیاد).

در نمودار 51-4 تغییرات دژنراسیون نورون های مغز در گروه های TBI، Veh،P1 و P2 نشان داده شده است. میزان دژنراسیون نورون در گروه های P1 (%39/0±2) و P2 (%24/0±9/1) نسبت به گروه های TBI و Vehکمتر است، اما این اختلاف معنی دار نمی باشد.

نمودار51-4: مقایسه میزان دژنراسیون نورون های مغز (%) در گروه هایTBI، Veh،P1 و P2 (n=15). یافته ها بر اساس mean ± SEM گزارش شده است. TBI(ترومای مغزی)، Veh (حلال) ، P1(پروژسترون با دز کم) و P2(پروژسترون با دز زیاد).

تغییرات دژنراسیون نورون های مغز در گروه های TBI، Veh+Veh و E2+P1 در نمودار 52-4 نشان داده شده است. میزان دژنراسیون نورون در گروه های E2+P1 (%21/0±4/1) نسبت به گروه های TBI و Veh+Veh کاهش یافته است اما از نظر آماری معنی دار نمی باشد.

نمودار52-4: مقایسه میزان دژنراسیون نورون های مغز (%) در گروه هایTBI، Veh+Vehو E2+P1 (n=15). یافته ها بر اساس mean ± SEM گزارش شده است. * P<0.05، اختلاف معنی دار گروه E2+P1 با گروه Veh+Veh. TBI(ترومای مغزی)، Veh+Veh (حلال+حلال) و E2+P1 (استروژن با دز زیاد+پروژسترون با دز کم).

در نمودار 53-4 تغییرات دژنراسیون نورون های مغز در چهار گروه درمانی منفرد: E1 ، E2،P1 و P2نشان داده شده است. میزان دژنراسیون نورون در گروه E2 (%13/0±4/1) نسبت به سه گروه دیگر کمتر است، اما معنی دار نمی باشد.

نمودار53-4: مقایسه میزان دژنراسیون نورون های مغز (%) در چهار گروه درمانیE1 ، E2،P1 و P2 (n=15). یافته ها بر اساس mean ± SEM گزارش شده است. E1(استروژن با دز کم)، E2 (استروژن با دز زیاد)، P1 (پروژسترون با دز کم) و ) P2پروژسترون با دز زیاد(.

در نمودار54-4، تغییرات دژنراسیون نورون های مغز در سه گروه درمانی E2،P1 و P1 E2+ نشان داده شده است. میزان دژنراسیون نورون در سه گروه فوق تفاوت معنی داری ندارد.

نمودار 54-4: مقایسه میزان دژنراسیون نورون های مغز (%) در سه گروه درمانی E2،P1 و P1 E2+ (n=15). یافته ها بر اساسmean ± SEM گزارش شده است. E2 (استروژن با دز زیاد)، P1 (پروژسترون با دز کم) و E2+P1(استروژن با دز زیاد+پروژسترون با دز کم).

 تغییرات درصد آپوپتوز نورونی در گروه های مختلف حیوانات:

تصویر26-4: مقایسه آپوپتوز نورونی در بافت مغز با رنگ آمیزیH&E (40×)، 24 ساعت پس از TBI در گروه های مختلف. E2 بیشتر از سایر گروه های درمانی منفرد، آپوپتوز را کاهش داده است. TBI(ترومای مغزی)، E1 (استروژن با دز کم)، E2 (استروژن با دز زیاد)،P1 (پروژسترون با دزکم) و P2 (پروژسترون با دز زیاد).

تغییرات آپوپتوز نورون های مغز که توسط آزمایش های هیستوپاتولوژی بدست آمده، در گروه های کنترل، شم، ضربه مغزی، حلال و حلال+حلال در نمودار 55-4 نشان داده شده است. میزان آپوپتوز نورون در گروه های TBI (%35/0±4/2)، Veh(%32/0±4/2) و Veh+Veh(%38/0±7/2) نسبت به گروه کنترل و شم، بیشتر شده است. افزایش میزان آپوپتوز نورون در گروه هایTBI، Veh و Veh+Veh نسبت به گروه کنترل و شم، معنی دار می باشد.

نمودار55-4: مقایسه میزان آپوپتوز نورون های مغز (%) در گروه های مختلف مطالعه (n=15). یافته ها بر اساس mean ± SEM گزارش شده است. ** P<0.01، اختلاف معنی دار گروه های TBI، Vehو Veh+Veh با گروه کنترل. ## P<0.01، اختلاف معنی دار گروه های TBI،Vehو Veh+Veh با گروه شم. Ctrl (کنترل)، Sh (شم فاقد تخمدان)، TBI(ترومای مغزی)، Veh (حلال) و Veh+Veh (حلال+حلال).

در نمودار56-4، تغییرات آپوپتوز نورون های مغز در گروه های TBI، Veh،E1 و E2 نشان داده شده است. آپوپتوز نورونی در گروه هایE1 (%26/0±9/1) وE2 (%25/0±5/1) نسبت به گروه هایTBI و Veh کمتر می باشد، اما فقط گروه E2 با گروه های فوق با P<0.05، اختلاف معنی دار دارد.

نمودار56-4: مقایسه میزان آپوپتوز نورون های مغز (%) در گروه هایTBI،Veh ،E1و E2 (n=15). یافته ها بر اساس mean ± SEM گزارش شده است. * P<0.05، اختلاف معنی دار گروه E2 با گروه TBI. # P<0.05، اختلاف معنی دار گروه E2 با گروه Veh. TBI(ترومای مغزی)، Veh (حلال) ،E1 (استروژن با دز کم) و E2 (استروژن با دز زیاد).

تغییرات آپوپتوز نورون های مغز در گروه های TBI، Veh،P1 و P2 در نمودار 57-4 نشان داده شده است. میزان آپوپتوز نورون در گروه P1 (%46/0±6/2) نسبت به گروه های TBI و Veh اندکی افزایش و در گروه P2 (%44/0±1/2) نسبت به گروه های TBI و Vehکاهش یافته است، اما هیچ یک معنی دار نمی باشند.

نمودار57-4: مقایسه میزان آپوپتوز نورون های مغز (%) در گروه هایTBI، Veh، P1و P2 (n=15). یافته ها بر اساس mean ± SEM گزارش شده است. TBI(ترومای مغزی)، Veh (حلال) ، P1(پروژسترون با دز کم) و P2(پروژسترون بادز زیاد).

در نمودار 58-4 تغییرات آپوپتوز نورون های مغز درگروه های TBI، Veh+Veh و E2+P1 نشان داده شده است. میزان آپوپتوز نورون در گروه های E2+P1 (%47/0±2/2) نسبت به گروه های TBI و Veh+Veh کاهش یافته است، لیکن فاقد معنی داری می باشد.

نمودار58-4: مقایسه میزان آپوپتوز نورون های مغز (%) در گروه هایTBI ، Veh+Vehو E2+P1 (n=15). یافته ها بر اساس mean ± SEM گزارش شده است. TBI(ترومای مغزی)، Veh+Veh (حلال+حلال) و E2+P1 (استروژن با دز زیاد+پروژسترون با دز کم).

تغییرات آپوپتوز نورون های مغز در چهارگروه درمانی منفرد: E1، E2،P1 و P2در نمودار 59-4، نشان داده شده است. میزان آپوپتوز نورونی در گروه E2 نسبت به سه گروه دیگر کمتر است، اما معنی دار نمی باشد.

نمودار59-4: مقایسه میزان آپوپتوز نورون های مغز (%) در چهار گروه درمانی E1، E2،P1 و P2 (n=15). یافته ها بر اساس mean ± SEM گزارش شده است. * P<0.05، اختلاف معنی دار گروه E2 با گروهP1. E1(استروژن با دز کم)، E2 (استروژن با دز زیاد)، P1 (پروژسترون با دز کم) و )P2پروژسترون با دز زیاد(.

در نمودار60-4، میزان آپوپتوز نورون های مغز در سه گروه درمانی E2،P1 وP1 E2+ نشان داده شده است. میزان آپوپتوز نورون در گروه E2 کمتر می باشد. همان طوری که قبلاً اشاره گردید، اختلاف گروه E2 با گروه P1 با P<0.05، معنی دار است.

نمودار60-4: مقایسه میزان آپوپتوز نورون های مغز (%) در سه گروه درمانی E2،P1 و P1 E2+ (n=15). یافته ها بر اساسmean ± SEM گزارش شده است. * P<0.05، اختلاف معنی دار گروه E2 با گروهP1. E2 (استروژن با دز زیاد)، P1 (پروژسترون با دز کم)و E2+P1(استروژن با دز زیاد+پروژسترون با دز کم).

تغییرات درصد گلیوز در گروه های مختلف حیوانات:

تصویر27-4: گلیوز بافت مغز با رنگ آمیزیH&E (40×)، 24 ساعت پس از TBI در گروه درمانیP2 .

در نمودار61-4، درصد گلیوز بافت مغز، به دست آمده در آزمایش هیستوپاتولوژی، در گروه های مختلف مطالعه نشان داده شده است. بین گروه های مختلف، اختلاف آماری معنی دار وجود ندارد.

نمودار61-4: مقایسه میزان گلیوز در بافت مغز (%) در گروه های مختلف مطالعه (n=15). یافته ها بر اساس mean ± SEM گزارش شده است. Ctrl (کنترل)، Sh (شم فاقد تخمدان)، TBI(ترومای مغزی)، Veh (حلال)،Veh+Veh (حلال+حلال)، E1 (استروژن با دز کم) ، E2 (استروژن با دز زیاد)، P1 (پروژسترون با دز کم)، P2 (پروژسترون با دز زیاد) و E2+P1 (استروژن با دز زیاد+پروژسترون با دز کم).

بحث:
خیز مغزی کنترل نشده، علت بسیاری از ناتوانی ها و مرگ و میرهای همراه با TBI است.(Stein et al., 2008) التهاب، باعث بیان سریع واسطه های التهابی مثل سیتوکین ها، کموکین ها و پروستاگلاندین ها می شود (Simi et al., 2007a). مطالعات قبلی انجام شده در این گروه، اثرات استروئیدهای جنسی بر روی مقدار سیتوکین هاب التهابی را مورد بررسی قرار داد و مشخص شد که تغییر در میزان سیتوکین های التهاب زا از قبیل IL-1،IL-6 و TNF-α در سیستم عصبی مرکزی، یکی از مکانیسم های احتمالی حفاظت عصبی این استروئیدها می باشد (Khaksari et al., 2010b, Sarkaki et al., 2013). از آن جایی که گزارش شده است که این استروئیدها می توانند مسیر پیام رسانی125سیتوکین ها را علاوه بر مکانیسم فوق تحت تاثیر قرار دهند (Khaksari et al., 2010b)، بنابراین مطالعه حاضر به این منظور انجام شد که آیا هورمون های استروئیدی جنسی زنانه می توانند، از طریق مکانیسم های جدید برشمرده در بالا با اثر بر پیام رسانی سیتوکین ها عملکرد آن ها را تحت تاثیر قرار داده و از این طریق اثرات ضد التهابی بعد از TBI را اعمال کنند؟
در این مطالعه: 1- خیز مغزی به وسیله اندازه گیری محتوای آب مغز (با استفاده از وزن خشک و وزن مرطوب مغز) بررسی گردید، 2- سلول های حاوی مولکول هایSTAT-3 (مولکول انتقال دهنده پیام و فعال کننده رونویسی شماره 3)، SOCS-3 (مولکول سرکوب گر انتقال پیام سیتوکین شماره 3)، دایمرهایP65 فسفریله و P52 مربوط به NFκB (فاکتور هسته ایκB ) و پروتئین مهاری IKB-α 126با روش ایمونوهیستوشیمی (IHC)، مورد مطالعه قرار گرفت. 3- – فاکتورهای هیستوپاتولوژیک: ادم بافتی، احتقان، دژنراسیون نورونی، آپوپتوز نورونی و گلیوز (تجمع سلول های گلیا در واکنش CNS به انواع آسیب) با روش رنگ آمیزی H&E مورد بررسی قرار گرفت.
الف) اثر استروئیدهای جنسی بر روی خیز مغزی بعد از TBI
نتایج این مطالعه نشان داد که اولاً بعد از TBI، خیز مغزی افزایش پیدا می کند و ثانیاً هر دو استروئید جنسی، خیز مغزی را در مقایسه با حلال کاهش می دهند. یعنی مصرف انفرادی هریک از این استروئیدهای جنسی دارای اثر حفاظت عصبی بعد از ترومای مغزی می باشد. میزان کاهش خیز مغزی در دز های کم (E1) و زیاد (E2) استروژن، به ترتیب 9/1% و 2/2% می باشد. هم چنین مقادیر کاهش خیز مغزی برای دزهای کم (P1) و زیاد (P2) پروژسترون، به ترتیب 6/2% و 4/2% درصد بود. علاوه بر این مصرف ترکیبی یا توام E2+P1، نیز کاهش خیز مغزی را به دنبال داشت، که اثر مهاری آن کمتر از دز کم پروژسترون بوده، اما مشابه با اثر دز زیاد استروژن می باشد، این بدین معنی است که استروژن اثر کاهشی پروژسترون را بر روی خیز مغزی تضعیف نموده است. از سوی دیگر اختلاف معنی دار بین استروئیدهای جنسی یعنی استروژن با پروژسترون و هم چنین بین دزهای مختلف این استروئیدها با یکدیگر وجود نداشت.
این یافته موافق با مطالعات انجام شده توسط دیگران می باشد. مطالعات حیوانی زیادی اثرات حفاظت عصبی استروئیدهای جنسی را بررسی کرده اند و نقش حفاظت عصبی را برای این استروئیدها نشان داده اند، مطالعه Chrisine و همکاران نشان داد که استروژن و پروژسترون سبب کاهش معنی دار محتوای آب مغزی در 24 ساعت پس از TBI می شود (Meffre et al., 2007). در مطالعه دیگری نیز مشخص شد که پروژسترون با کاهش سیتوکین های التهابی پس از TBI، کاهش ادم مغزی را موجب می شود (He et al., 2004a). هم چنین O`Connor و همکاران گزارش کردند که استروژن و پروژسترون سبب کاهش خیز مغزی و نفوذپذیری سد خونی- مغزی می شوند (O'Connor et al., 2005). Stein و همکاران نیز گزارشی را مبنی بر اینکه استروژن و پروژسترون منجر به کاهش خیز مغزی می شوند، تایید کردند (Stein, 2001). در یک مطالعه، اوارکتومی، آسیب ایسکمی مغزی را در موش های ماده افزایش داد و تزریق بلافاصله استرادیول، آثار حفاظت عصبی و ضدالتهابی را در مغز ایسکمی شده نشان داد (Szymczak et al., 2006). دزهای فارماکولوژیک 17-بتا استرادیول، وسعت آسیب را کم کرد و مرگ سلولی را در مغز کاهش داد (Zhang et al., 1998). نفوذپذیری سدخونی-مغزی در موش درمان شده با E2 کاهش یافت (Brown et al., 2010a). مطالعات انجام شده در گروه ما نشان داد که تزریق یک دز متفاوت استرادیول می تواند از تشکیل ادم (Shahrokhi et al., 2010) و تخریب سدخونی-مغزی پس از TBI، جلوگیری کند (Khaksari et al., 2010b). مطالعات نشان داده اند که التهاب عروق مغزی توسط استروژن، سرکوب شده و توسط پروژسترون و تستوسترون، افزایش می یابد (Sunday et al., 2006, Duckles and Krause, 2007). هم چنین شواهد پیشنهاد می کنند که استروئیدهای جنسی سبب تعدیل نفوذپذیری سد خونی- مغزی و افزایش کارایی میتوکندری ها می شوند که این آثار ممکن است تحت شرایط غیر طبیعی مانند جراحت و بیماری، تغییر نماید (Sunday et al., 2006). هم چنین مشخص شده است که استروژن و پروژسترون، پیامدهای ناشی از ضربه مغزی را کاهش می دهند (Stein, 2001, Vink and Van Den Heuvel, 2004). پروژسترون و متابولیت های آن در TBI و Stroke اثر حفاظتی دارند. علاوه بر این نشان داده شده است که پروژسترون تولید سیتوکین های التهابی را کاهش می دهد (VanLandingham et al., 2006). درمطالعه خاکساری و همکاران گزارش نمودند در گروه ترکیبی E2+P1، هم محتوای آب مغز و هم محتوای آبی ایوانز به طور معنی دار کاهش یافته بود (Khaksari et al., 2010b). اما نتایج مطالعه حاضر با نتایج برخی مطالعات دیگر از جمله اینکه پروژسترون در دزهای کم بر ادم ناشی از جراحت سر موثر است، اما ممکن است تداخل های پیچیده و وابسته به دز با مولکول هایی که بر فرایند التهاب موثرند، داشته باشد (O'Connor et al., 2005) و یا اینکه استروژن سبب بدتر شدن جراحت ایسکمی مغزی می شود و در حیوانات دیابتی التهاب عروق مغزی توسط استروژن بدتر می شود (Stirone et al., 2003)، مغایرت دارد. تعدادی دیگر از نتایج مخالف نتایج مطالعه ما عبارتند از: مصرف استروژن و پروژسترون در دزهای فیزیولوژیک به صورت توام در محیط in vitro مرگ نورونی را افزایش می دهد، با توجه به این که استروژن با افزایش تولید bcl2 نوروپروتکتیو است، اما پروژسترون با افزایش فعالیت JNK باعث آپوپتوز می شود (Koski et al., 2004). دز بالای پروژسترون باعث ایجاد خیز کمتر می شود (Stein, 2001). تجویز استرادیول موجب تشدید عوارض بعد از ایسکمی می شود.Hoffman نیز گزارش نموده است که پروژسترون در غیاب استروژن
باعث افزایش فیلتراسیون یاخته های التهابی و تشدید علائم بیماری شده و مرگ سلولی را موجب می گردد، اما هنگامی که استروژن و پروژسترون ترکیب می شوند علائم بیماری تشدید نشده و فیلتراسیون
یاخته های التهابی رخ نمی دهد (Hoffman et al., 2001). Koskiنیز بیان نموده است، مرگ سلولی ناشی از افزایش تولید TNF-α توسط استروژن کاهش یافته، در حالی که پروژسترون آن را افزایش
می دهد (Koski et al., 2004). پروژسترون هنگامی که به تنهایی مصرف شود، گیرنده های TNF-α را افزایش می دهد و باعث وخیم شدن التهاب می گردد، اما هنگامی که با استروژن همراه گردد، اثر مخرب آن کاهش می یابد (Hoffman et al., 2006b). دلایل احتمالی تفاوت نتایج مطالعه حاضر با دیگران می تواند ناشی از نوع ضربه مغزی (Feldman et al., 1992, Jones et al., 2005a)، مدت زمان مصرف دارو (Feldman et al., 1992, O'Connor et al., 2005)، دز دارو، روش مصرف دارو (Neumann-Haefelin et al., 2000, Liu et al., 2005a)، روش اندازه گیری شدت آسیب (O'Connor et al., 2005) و نوع حلال (Jones et al., 2005a)، باشد که ممکن است متابولیسم و اثر دارو را تحت تاثیر قرار دهد.
مکانیسم های احتمالی که به وسیله آنها استروئیدهای جنسی، ادم مغزی را در دز های کم و زیاد کاهش می دهند عبارتند از:
1-تولید پروتئین های ضد آپوپتوزی
2- کاهش تولید سیتوکین های التهابی از قبیل α TNF-
3- کاهش گیرنده سیتوکین ها (Marzi et al., 1996, Øren et al., 2001, Wise et al., 2001)
4-مهار پراکسیداسیون لیپیدی و تولید رادیکال های آزاد اکسیژن
5-ویژگی آنتی اکسیدانی (رفتگر رادیکال های آزاد اکسیژن)
6-اثر بر روی جریان خون از طریق تعدیل تشکیل NO
7-تنظیم بیان کانال آبی (آکواپورین)127 شماره 4
8- مهار فعالیت و بیان آنزیم های پرتئولیتیک متلاشی کننده ماتریکس خارج سلولی (MMPs)128
9-مهار عمل و بیان 129COX(ROOF and HALL, 2000, Liu et al., 2005a, O'Connor et al., 2005)
10- برخی از واسطه های ایمنی نظیرIL-1، IL-6،IL-8 ،IL-10 ،TNF-α و TGF-β به دنبال ایجاد ضربه مغزی افزایش می یابند که به عنوان عوامل ضدالتهابی و یا کموتاکسی عمل می کنند (Maegele et al., 2007b)، در حالی که مصرف استروئیدهای جنسی استروژن یا پروژسترون به صورت انفرادی (Sarkaki et al., 2013)یا ترکیبی (Khaksari et al., 2010b)، باعث کاهش سیتوکین های التهابی می شود.
ب) اثراستروئیدهای جنسی بر روی سلول های حاوی STAT-3 p-
مسیر JAK/STAT، یک مسیر اصلی پیام رسانی و واسطه گر پاسخ های سلولی به سیتوکین ها می باشد و نقش کلیدی در پاسخ داخل سلولی به سیتوکین ها بازی می کند (Aid et al., 2008). مولکول انتقال دهنده پیام و فعال کننده رونویسی شماره3 یا STAT-3، یکی از پروتئین های سیتوپلاسمی است که به عنوان فاکتور انتقال پیام و رونویسی عمل کرده و در پاسخ های طبیعی سلولی به سیتوکین ها و فاکتورهای رشد شرکت دارد. در پاسخ به تحریک گیرنده سیتوکینی،STAT-3 فعال شده و بیان ژن را القاء می کند، بدین ترتیب که به دنبال فسفریله شدن تیروزین توسط سیتوکین ها، پروتئین STAT-3 دایمر شده وارد هسته می گردد و ژنهای هدف خاصی را تحریک می کند. نتایج بخش دیگر این مطالعه نشان داد که بعد از ضربه مغزی سلول هایی کهp-STAT-3 آنها مثبت بود، یعنی حاوی مولکولp-STAT-3 بودند، بیشتر از گروه های کنترل و شم بود. به عبارت دیگر TBI افزایش این مولکول را که واسطه عملکرد سیتوکین های التهابی می باشد، افزایش می دهد. اگر چه مصرف هر دو دز استروژن ( E1و E2)، باعث کاهش سلول های حاوی مولکولp-STAT-3 می شد، اما فقط E2 دارای اختلاف معنی دار با حلال بود. از سوی دیگر این کاهش در این مولکول توسط دزهای مختلف پروژسترون نیز تکرار شده است، اما هیچ کدام از دزها اختلاف معنی دار با حلال نداشتند. در گروه ترکیبی تعداد سلول های حاوی مولکولp-STAT-3، اختلاف معنی دار با گروه حلال نداشت. این بدین معنی است که اثر غالب در این گروه با پروژسترون بوده به طوری که اثر کاهشی استروژن بر روی این مولکول، هنگام استفاده توام با پروژسترون از بین رفته است. در آنالیز اینکه تغییرات ایجاد شده برای مولکولp-STAT-3 در کدام یک از سه نوع سلول (آستروسیت، میکروگلیا و نورون)، رخ داده است، مشخص شد که تغییرات ایجاد شده توسط E1 وE2 ، در نورون ها اختلاف معنی دار با دو نوع سلول دیگر داشته است. با توجه به نتایج بالا نتیجه گیری می شود که هورمون های استروئیدی جنسی احتمالاً عمل حفاظت عصبی خود یا مهار خیز مغزی را از طریق کاهشp-STAT-3 در سلول های مختلف مغزی خصوصاً نورون ها انجام داده است. این بدین معنی است که یکی از مکانیسم های دخیل در عمل ضدالتهابی این استروئیدها تغییر در مسیر پیام رسانی سیتوکین های التهاب زا می باشد و از آن جا که در مطالعات قبلی گروه ما گزارش شد که این استروئیدهای جنسی، کاهش سیتوکین های التهابی را موجب می شود (Khaksari et al., 2010b, Sarkaki et al., 2013)، این مسیر اضافه بر مسیرهای قبلی بیان شده در مطالعات ما برای اثرات مفید این استروئیدها در مغز، مطرح است.
اگرچه درباره تغییرات p-STAT-3 پس از TBI، گزارشی وجود ندارد، اما گزارش های متفاوتی در ارتباط با افزایش بیان STAT-3 پس از ایسکمی یا التهاب وجود دارد که از جمله می توان این موارد را برشمرد: در مغز پس از ایسکمی، خصوصاً در نورون ها،STAT-3 فعال شده است (Di Domenico et al., 2012). STAT-3 و SOCS-3به وسیله محرکهای التهابی مانندLPS 130 و TNF-α فعال می شود (Aid et al., 2008). معلوم شده STAT-3 نقش مهمی در تنظیم پاسخ های بقا / آپوپتوز، تکثیر، تمایز، ایمنی و التهاب سلول دارد (Welte et al., 2003, Wang et al., 2007, Di Domenico et al., 2012). بیان STAT-3فسفریله، STAT-3 mRNA و SOCS-3، در موش های فاقد ژن COX پس از LPS افزایش یافت (Aid et al., 2008)و در مطالعه دیگری، دخالت STAT-3 در آسیب ایسکمی مغز و قلب، در in vivo و in vitro نشان داده شده است (Di Domenico et al., 2012).
آثار مزمن E2، از طریق تغییر در بیان ژن وساطت می شود در حالی که آثار حاد و سریع از طریق مکانیسم های غیر ژنومیک مانند تغییر در فسفریلاسیون پروتئین، ایجاد می گردند (O'Lone et al., 2004, Bryant et al., 2005). مطالعات اخیر پیشنهاد می کند که استروژن سریعاً مسیرهای پیام رسانی را فعال می کند که نهایتاً منجر به افزایش رونویسی ژن می گردد. درباره اثرات هورمون های استروئیدی جنسی بر روی بیان مولکول STAT-3 یا نورون های حاوی این مولکول، اطلاعاتی موجود نمی باشد، اگر چه ارتباط بین استروژن با این مولکول در موارد دیگر گزارش شده است از جمله: اثر حفاظتی استروژن درکاهش حجم ناحیه انفارکته131 پس از ایسکمی مغزی، از طریقp-STAT-3 می باشد (Björnström and Sjöberg, 2002) و مهارکننده فارماکولوژیک p-STAT-3، اثر حفاظتی استروژن را روی سایز ناحیه انفارکته132 ، کاهش داد (Dziennis et al., 2007). تستوسترون با هر دو منشا درونی و بیرونی باعث کاهش فعالیت STAT-3و بیان SOCS-3 میوکاردی پس از ایسکمی حاد و خونرسانی مجدد (رپرفیوژن)، می شود (Wang et al., 2009a). تفاوت های جنسی در فعالیت STAT-3 و بیان SOCS-3 قلبی پس از ایسکمی وجود دارد. تزریق تستوسترون بیرونی به قلب های نر عقیم و ماده، فعالیت STAT-3و سطوح SOCS-3 را در آنها کاهش داد (Wang et al., 2009a). گزارش شده است که استروژن با مسیر JAK/STAT اینترکشن می نماید، به طوری که گزارش شده است که هپاتیت C را از طریق مهار JAK/STAT تضعیف می کند (Leong et al., 2004b). علاوه بر این گزارش شده است، استروژن STAT دفسفریله را افزایش می دهد (Liu et al., 2002). هم چنین گزارش شده درکورتکس نورون های دخیل در التهاب ناشی از ایسکمی، بقای نورونی پس از مواجهه با محرومیت اکسیژن-گلوکز یا سمیت گلوتامات، از طریق فعال کردن مسیرهای پیام رسانی STAT-3وPI3K/AKT، افزایش یافت (Sharma et al., 2011). مطالعات، وجود تفاوت های جنسی را در تعدیل بیان پروتئین در پاسخ به کمبود STAT-3، نشان داده و بر نقش برجسته STAT-3 در دو شکلی جنسی133 تاکید کرده اند (Di Domenico et al., 2010). مطالعه دیگری اثر القایی استروژن را بر روی بیان دیگر مهارگران مسیرJAK/STAT مثل پروتئین مهارگر STAT های فعال شده134(PIAS) در سلول های میلوما، نشان داد (Wang et al., 2004). در یک مطالعه بیان انحصاری گیرنده بتای استروژن درهسته نورون و آستروسیت، نشان داده شد، پس استروژن می تواند از طریق یک مکانیسم ژنومیک کلاسیک در این دو نوع سلول عمل کند. در شرایط in vivo، سطوح STAT-3 فسفریله و اتصالDNA ، عمدتاً طی رپرفیوژن در نورون ها، میکروگلیاها و آستروسیت ها افزایش یافت (Dinapoli et al., 2010, Lei et al., 2011). هم چنین در این مطالعه، وجود گیرنده های بتای استروژن در میکروگلیای کشت شده، گزارش شده است که این خود دخالت مکانیسم غیر کلاسیک عمل استروژن را روی میکروگلیا نشان می دهد (Liu et al., 2005b).Li-Hong و همکارانش گزارش کردند، جنستین135 به عنوان یک استروژن گیاهی136، افزایش p-STAT را در مغز ایسکمی، مهار می کند (Li and Zhang, 2003). اینترکشن بین گیرنده استروژن و مسیر پیام رسانیSTAT-3 ، پایه مولکولی برای اثرات مهاری استروژن روی عملکرد IL-6 می باشد (Yamamoto et al., 2000). استروژن از طریق مهار افزایش p-STAT و فعالیت اتصال DNA ، التهاب را مهار می کند. مطالعات نشان داده استروژن با دو مکانیسم این عمل را انجام می دهد:1-مهار مسیرهای بالا دست تیروزین کیناز STAT-3 مانند JAKs . 2-مستقیماً با فسفریلاسیون تیروزین،STAT-3 را مهار می کند. بنابراین با توجه به مطالعه فوق می توان مطرح کرد که شاید کاهش STAT-3 که در مطالعه ما مشاهده شد، به علت مهار بالادست JAK باشد.
نتایج مخالف با مطالعه حاضر در ارتباط با اثر استروژن بر روی بیان مولکولSTAT-3 گزارش شده است: استروژن، فسفریلاسیونSTAT-3 را پس از ایسکمی موضعی، نسبت به رت های اوارکتومی شده افزایش داده است (Dziennis et al., 2007) .در موش های صحرایی مسن ایسکمی شده که افزایش نورودژنراسیون عصبی و افزایش تولید سیتوکین های پیش برنده التهاب را نشان دادند، در مقایسه با موش های صحرایی های جوان ایسکمی شده، طول زمان فعالیت STAT-3 کاهش یافته بود و این هم بر اثر حفاظتی STAT-3 درحفظ فیزیولوژی مغز تاکید می کند (Dinapoli et al., 2010). گزارش شده که تغییرات در سطوح پروتئین در مغز موش ماده با انسداد موقت شریان میانی مغز، نیز به کمبود اثر حفاظتی بواسطه STAT-3 وابسته است (Di Domenico et al., 2012). استرادیول P-STAT-3 را پس از ایسکمی در کورتکس موش های صحرایی ماده اوارکتومی شده افزایش داد. هم چنین نتایج این مطالعه نشان داد که فعالیت STAT-3 در نورون ها واقع شده است (Dziennis et al., 2007). مطالعه دیگر نشان داد که مهار STAT-3، کاهش سایز انفارکته ایجاد شده توسط استروژن را کاهش داد. این احتمال مطرح شده است که یکی از مکانیسم های دخیل در عمل ضد ایسکمی مغزی استروژن که به وسیله آن نورون ها را پس از ایسکمی حفاظت می کند، توسط STAT-3 اعمال می شود (Dziennis et al., 2007). دیگر اینکه اریتروپویتین مغز را علیه آپوپتوز ناشی از ایسکمی حفاظت می کند (Solaroglu et al., 2003) و تولید مجدد نورون های CNS را از طریق STAT-3 اعمال می کند (Kretz et al., 2005) و137 فاکتور تحریک کننده کلونی گرانولوسیت(GCSF) نیز مغز را پس از ایسکمی محافظت می کند و این حفاظت همراه با افزایش p-STAT-3و افزایش138 bcl2در سلول های بقا یافته می باشد (Komine-Kobayashi et al., 2005). هم چنین بقای نورونی پس از آسیب ایسکمی در موش با نورون فاقد STAT-3، آسیب دیده است .(Dziennis et al., 2007)
ج) اثر استروئیدهای جنسی بر روی سلول های حاوی SOCS-3
مولکول سرکوب گر انتقال پیام سیتوکین شماره 3 یا SOCS-3 یکی از اعضای جدید خانواده مهارگران انتقال پیام در مسیرJAK/STAT می باشد و قادر است فعالیت STAT-3 را مهارکند. نکته مهم اینکه فعال سازیSOCS-3 مستقل از STAT-3 نیز می تواند صورت گیرد (Meisel et al., 1996). در بخش دیگر این پژوهش که سلول های مغزی حاوی SOCS-3 ارزیابی شد، معرف این می باشد که هر دو دز استروژن مصرفی، تعداد سلول های حاوی این مولکول را افزایش داده اند، در حالی که فقط دز زیاد پروژسترون دارای این اثر بود. از سوی دیگر هنگامی که این دو استروئید باهم مصرف شدند، نتیجه مشابه با استروژن تکرار شد. این بدین معنی است که وقتی استروژن همراه با پروژسترون مصرف می شود، اثرات مفید آن بر روی افزایش SOCS-3 از بین نمی رود. هم چنین مقایسه استروئیدهای جنسی با یکدیگر نشان داد، دز زیاد استروژن باعث افزایش معنی داری در سلول های حاوی این مولکول در مقایسه با دز کم و هر دو دز پروژسترون می شود. این بدین معنی است که در گروه ترکیبی نیز میزانSOCS-3 در مقایسه با حلال، افزایش نشان می دهد. از آن جایی که مولکولSOCS-3 به عنوان مولکول های مهارکننده یا سرکوب گر مسیر پیام رسانی سیتوکین ها شناخته شده است، پس می توان نتیجه گرفت یکی از مکانیسم های احتمالی دخیل در عمل حفاظت عصبی استروئیدهای جنسی وکاهش خیز مغزی، تعدیل بیان ژن SOCS-3 است که وابسته به نوع سلول می باشد و از طریق آن، مسیر پیام رسانی سیتوکین ها را مهار می کنند.
در آنالیز این که تغییرات ایجادشده برای مولکولSOCS-3 در کدام یک از سه نوع سلول (آستروسیت، میکروگلیا و نورون)، رخ داده است، مشخص شد که تغییرات ایجاد شده توسط E1 در آستروسیت و میکروگلیا، اختلاف معنی دار با نورون داشته است. در حالی که در گروه E2، افزایش SOCS-3 ایجاد شده در میکروگلیا در مقایسه با نورون، معنی دار بود. با توجه به نتایج بالا نتیجه گیری می شود که هورمون های استروئیدی جنسی احتمالاً عمل حفاظت عصبی خود یا مهار خیز مغزی را از طریق افزایش درSOCS-3 در سلول های مختلف مغزی انجام داده اند، که کمترین افزایش در نورون ها مشاهده شد. یعنی بافت هدف استروژن ها برای افزایش این مولکول و به دنبال آن کاهش خیز مغزی، این دو نوع سلول مغزی: آستروسیت و میکروگلیا می باشد.
مقالات محدودی در مورد عملکرد SOCS-3 درمغز وجود دارد، این مولکول در شرایط فیزیولوژیک، در سطوح پایینی بیان می شود و برعکس، بیان آن در پاسخ به تحریکات التهابی افزایش می یابد (Wang and Campbell, 2002). مطالعات در موش، اهمیت مولکول های SOCS را در حفظ هومئوستازی توسط پاسخ های سلولی مربوط به سیتوکین های خاص یا فاکتورهای رشد در انواع مختلف سیستم های فیزیولوژیک، ثابت کرده است. سیتوکین ها طیف وسیعی از پاسخ های بیولوژیک را در CNS تعدیل می کنند به طوری که اعضای خانواده SOCS می توانند نقش ویژه ای در تنظیم پیام رسانی داخل سلولی توسط این عوامل در هر دو وضعیت طبیعی و بیماری داشته باشند (Wang and Campbell, 2002). علاوه بر این نقشSOCS-3 در تعدیل عمکردهای نوروایمونواندوکرین که توسط انواع سیتوکین ها مانند اعضای ابرخانواده های هورمون رشد و IL-6تحت تاثیر قرار می گیرد، ثابت شده است (Wang and Campbell, 2002). چندین مطالعه نشان دادند که سطوح SOCS-3 در مغز پس از تزریق محیطی سیتوکین های مختلف یا به دنبال تحریک ایمنی محیطی با LPS، تنظیم افزایشی می یابد (LeBel et al., 2000). IL-1 (Auernhammer et al., 1998) و IL-6 (Auernhammer and Melmed, 1999, Bousquet et al., 1999) ، به طور معنی داری باعث افزایش بیان ژن SOCS-3 در اندام های اطراف بطنی و هیپوتالاموس می شوند. وجود SOCS-3 در نورون های هیپوتالاموس و تنظیم افزایشی معنی دار آن توسط سیتوکین های مختلف، قویاً پیشنهاد می کند که این مولکول نقش مهمی در عملکردهای تعدیل کنندگی نورواندوکرین و نوروایمونواندوکرین وابسته به سیتوکین بازی می کند .(Wang and Campbell, 2002) محرک های التهاب، خودشان یا محصولاتشان می توانند بیان تنظیم کننده های فیدبک منفی مثل خانوادهSOCS ، آنزیم های آنتی اکسیدان و سیتوکین های ضد التهاب را القا کنند (Yang et al., 2007). در مطالعه ای بر روی ماهی، گزارش شد که تعدیل بیان ژن SOCS وابسته به نوع سلول و نوع سیتوکین می باشد (Wang and Secombes, 2008). گیرنده α استروژن، SOCS-2و SOCS-3 را در سلول های کبدی هم درin vivo و هم در in vitro افزایش داد (Leong et al., 2004b). در یک مطالعه استروژن mRNA SOCS-3 را در هسته های قوسی موش افزایش داد در حالی که پروژسترون آن را کم کرد (Steyn et al., 2008).
میکروگلیا با افزایش بیان SOCS، بطور معنی داری باعث کاهش پاسخ های IFN-ϒ گردید. برعکس، فقدان بیان SOCS-3 توسط نورون ها همراه با افزایش پاسخگویی این سلول ها بهIFN-ϒ بود (Campbell, 2005). SOCS فعالیت NFκB را سرکوب می کند. در صورت نقصSOCS-1 فعالیت NFκB افزایش یافته و سطوح TNF-αوNO افزایش می یابد (Kinjyo et al., 2002, Nakagawa et al., 2002).SOCS هم چنین P38MAPK را که بطور معنی داری در پاسخ به LPSیا TNF-αفعال شده، مهار می کند (Kinjyo et al., 2002, Chong et al., 2002). سیتوکین های ضدالتهابی نیز مسیر JAK/STAT را از طریق بیانSOCS بلوک می کند. IL-10، بیان SOCS-3 را القا می کند (Cassatella et al., 1999, Qasimi et al., 2006). آستروسیت و میکروگلیا می توانند IL-10 و SOCS-3 را بیان کنند (Ledeboer et al., 2002, Qin et al., 2007). مطالعات نشان داده اند که SOCS-3برخی از اعمال ضدالتهابی IL-10 را در سلول های گلیال وساطت می کند (Baker et al., 2009) و نقش حفاظتی در مدل های جانوری مولتیپل اسکلروزیس و ایسکمی مغزی بازی می کند (Raghavendra Rao et al., 2002, Li et al., 2006). SOCS-3 ناشی از IL-10 در جهت مهار پیام رسانی وابسته به JAK/STAT سیتوکین های التهابی شامل TNF-α ، IL-6 و IFN-ϒ عمل می کند (Starr et al., 1997, Naka et al., 1997, Donnelly et al., 1999). E2باعث افزایش بیان SOCS-3 در in vivo وin vitro شد (Liang et al., 2013). از آن جایی که استروژن مانند IL-10، باعث افزایش SOCS-3 شده است، می توان احتمال داد که مسیر عملکرد ضد التهاب مغزی استروژن پس از افزایش SOCS-3 همانند IL-10 باشد. E2یک تعدیل کننده مهم پاسخ التهاب عصبی خصوصاً از طریق اعمالش روی میکروگلیا (سلول های ساکن مغز) می باشد (Di Domenico et al., 2012). در in vivo درمان با E2 از فعالیت میکروگلیا و بسیج مونوسیت ها بدنبال تزریق LPS جلوگیری کرد (Vegeto et al., 2003) و بیان IL-1β متعاقب آسیب های ناشی ازسم خارجی را کاهش داد (Nordell et al., 2003). استروژن بیان کبدی SOCS-2 و SOCS-3را احتمالاً از طریق فعال کردن مسیرهای نسخه برداری موجب می شود (LEONG et al., 2004a) .در حالی که استروژن SOCS-1 و SOCS-3 را در موش های صحرایی فاقد تخمدان افزایش می دهد، پروژسترون باعث کاهش آن ها می گردد (He et al., 2004b). در مطالعه ای نشان داده شده است که E2،SOCS-3 را در پلاک های آترواسکلروزی افزایش داد (Liang et al., 2013). گزارش شده است که در سلول های قلبی، گیرنده بتای استروژن، واسطه برای عمل استروژن در اثرگذاری بر رویSTAT-3 و SOCS-3 و حفاظت قلبی پس از ایسکمی می باشد (Wang et al., 2009b).
د) اثراستروئیدهای جنسی بر روی سلول های حاوی NFκB
مولکول فاکتور هسته ای کاپا بی یاNFκB ، یک پروتئین مرکب به فرم های هومو و هترودایمر متشکل از پنج عضو از خانواده Rel می باشد شامل: NFκB1(p50)، NFκB2 (p52)، Rel A (p65)، Rel B و c-Rel (Rel). این مولکول دارای ترکیبات مختلف است و از اعضای خانواده فاکتورهای رونویسی می باشد. این خانواده عمدتاً در پاسخ های استرس، ایمنی و التهاب دخیلند و نقش محوری درالتهاب دارند و یکی از مسیرهای اصلی است که مواد التهاب زا آن را به کار می برند. یکی از این هترودایمرها، P65-P52 NFκB می باشد که درمسیر انتقال پیام سیتوکین ها وارد هسته شده و رونویسی از DNA را برای ژن ها خصوصاً ژن های دخیل در التهاب انجام می دهد (Kossmann et al., 1995).
یافته های این بخش پژوهش، که با روش IHC بدست آمده اند، نشان داد که تعداد سلول های دارای NFκB-P52، پس از ضربه مغزی نسبت به کنترل افزایش نشان داد، اما فاقد معنی داری بود. از سوی دیگر E2، باعث کاهش معنی دار تعداد سلول های حاوی NFκB-P52 گردید. هم چنین گروه های پروژسترون و ترکیبی نسبت به گروه های حلال مربوط به خود، اگرچه کاهش در تعداد سلول های حاوی این مولکول بوجود آوردند، اما این اختلاف معنی دار نبود. گروه E2 نسبت به گروه ترکیبی، کاهش معنی دار نشان داد و این بدین معنی است که پروژسترون با دز کم، مانع بروز اثر دز زیاد استروژن در گروه ترکیبی شده است.
در بخش آنالیز سلول های مغزی حاوی مولکول هایNFκB-P52 ، در چهار گروه درمانی، تفاوت معنی داری بین سه نوع سلول یافت نشد.
در بخش یافته های IHC مربوط به سلول های دارای مولکول p-NFκB-P65، مشخص شد پس از ضربه مغزی، افزایش معنی دار در تعداد سلول های حاوی این مولکول، ایجاد شده است. از طرف دیگر از بین درمان های مختلف، فقط استروژن با دز زیاد توانست، کاهش معنی دار در تعداد سلول های حاوی این مولکول ایجاد کند. در بخش آنالیز اطلاعات مربوط به سلول های مغزی دارای مولکولp-NFκB-P65 ، در گروه E1، اختلاف معنی دار بین آستروسیت با دو نوع سلول دیگر وجود داشت، به عبارت دیگر این سلول، بیشتر بافت هدف استروژن برای کاهش این مولکول می باشد. در توافق با یافته های پژوهش حاضر در یک مطالعهNFKB-P65 پس از TBI، افزایش یافت و در حیواناتی که پس از TBI، پروژسترون دریافت کرده بودند، میزان این مولکول کاهش یافت (Pettus et al., 2005).
κB NF- یک فاکتور نسخه برداری پیچیده است که نقش های دوگانه متضاد دارند. به طوری که گزارش های مخالف با مطالب فوق وجود دارد. به عنوان مثال بیان شده است فعال سازی این فاکتور منجر به بیان محصولاتی می شود که هم پیش برنده آپوپتوز و هم ضد آپوپتوز است و هم چنین هم ضد التهابی و هم پیش برنده التهاب هستند. اگر چه بسیاری از شرایط پاتولوژیک مثل آترواسکلروز، روماتیسم مفصلی139، بیماری التهابی روده و سرطان با فعال سازی NFκB جفت شده است.(Stice and Knowlton, 2008) NFκB بسته به طیفی از عوامل مثل ماهیت بیماری و سن حیوان، می تواند خطرزا یا محافظ باشد. در تشکیل هیپوکامپ بالغین، NFκB سمیت عصبی ناشی از الکل را تشدید می کند حال آنکه در نورون های درحال رشد مخچه، به عنوان محافظ عصبی عمل می نماید (Bonthius et al., 2008).
گزارش شده که اسید رتینوئیک، رونویسی به واسطه NFκBرا با مهار اتصال آن به DNA، متوقف می کند. بنابراین اثر ضد التهابی اسید رتینوئیک، که با سرکوب سطوح هسته ای زیر واحدهای P65 وNFκB P50 صورت می گیرد، از آنجایی که التهاب مغز یک فاکتور خطر برای بیماری نورودژنراتیو می باشد، می تواند به عنوان درمان جدیدی برای آسیب مغز و بیماری نورودژنراتیو مطرح شود (Choi et al., 2005).
E2فعالیت NFκB را در یک رده سلولی استئوبلاست از طریق اتصال گیرنده α استروژن با زیر واحدهایRel A وP50 بلوک می کند (Stein and Yang, 1995). استروژن می تواند NF-IL6 و NFκB را با مهاراتصال به DNA و متعاقباً مهار بیان ژن توسط آنها، مهار کند (Stein and Yang, 1995). در یک مطالعه بیانNFκB سلول های قلبی به طور معنی داری در گروه پرواستروس140(زمانی که استروژن در بالاترین سطح خود است)، کاهش یافته بود. از طرفی بیان NFκB قلبی به دنبال تروما، افزایش معنی دار در گروه های مت استروس141، دی استروس142، استروس143 و ovx نشان داد، ولی NFκB گروه پرواستروس در مقایسه با شم تفاوت معنی دار نداشت (Yang et al., 2006). در مطالعه ای پروژسترون که مونومر NFκB-P65 را پس از آسیب ایسکمی کم کرده بود، اتصال هترودایمر P50-65 را نیز کاهش داد و اتصال هومودایمر P50-50را افزایش داد، بنابراین رونویسی التهاب را به واسطه NFκB کم کرد (Brann et al., 2007). هم چنین استرادیول بیان ژن IL-6 را از طریق مهار فعالیت اتصالی DNA به فاکتورهای رونویسی NFκB را توسط گیرنده های استروژن سرکوب می کند (Samy et al., 1998). NFκB به دنبال ایسکمی فعال می شود (Muraoka et al., 1997) و استرادیول تولید سیتوکین را با مهار NFκB کاهش می دهد (Jones et al., 2003). اخیراً معلوم شده که پروژسترون به عنوان عامل ضدالتهاب می تواند فعالیت NFκB را مهار کند (Kondo et al., 1997). در مدل آسیب کورتکس فرونتال میانی (MFC)144 ، که باعث افزایش NFκB-P65 شد، پروژسترون بیان این فاکتور التهاب را کم کرد (Brann et al., 2007). در مطالعه دیگر بیان شده که استروئیدها به عنوان تعدیل کنندگان فعالیت NFκB شناخته شده اند (Kondo et al., 1997, Roquer et al., 2003). در بافت تولید مثلی ماده، ویژگی ضد التهابی پروژسترون شناسایی شده، جایی که پروژسترون از طریق مهار NFκB، باعث کاهشCOX-2 می گردد (Petersen et al., 2003, Kelly et al., 2005). پروژسترون مهار رونویسی به واسطه NFκB را به دو طریق انجام می دهد: 1-مسیر شناخته شده تر: افزایش تولید مهارگر درون زاد NFκB (IκB). 2-تشکیل هترودایمر گیرنده پروژسترون با NFκB-P65 در حضور پروژسترون که باعث مهار اتصال فاکتور رونویسی دیگر به محل اتصال آن می شود (Kondo et al., 1997).
ﻫ) اثراستروئیدهای جنسی بر روی سلول های حاوی p-IκBα
دایمرهای NFκB در سیتوزول سلولهای تحریک نشده، از طریق پیوند غیرکووالانسی با یک گروه پروتئین های مهاری به نام IκBs به حالت غیرفعال در می آیند. IκBα یکی از اعضای خانواده پروتئین های سلولی است که عمل آن مهار NFκB است.IκBα از طریق اتصال به NFκB باعث نگهداری فرم غیر فعال آن ها در داخل سیتوپلاسم می شود. علاوه بر این IκBα توانایی NFκB را برای اتصال به DNAنیز مهار می کند. سیگنال هایی که فعالیتNFκB را القا می کنند، سبب فسفریله شدنIκBα شده و بدنبال آن باعث تجزیه و تخریب توالی آنها وجدایی آن ها از NFκBمی شوند و به این ترتیب مجموعه NFκB اجازه فعالیت یافته و وارد هسته می گردد (Baeuerle, 1998). بدین ترتیب همه عواملی که موجب فسفریلاسیون مولکول IκBα می شوند، تحریک سنتز عوامل التهاب زا را موجب می گردند.
نتایج ناشی از بررسی تغییرات در سلول های حاوی مولکول IκBα نشان داد که از استروئیدهای جنسی فقط E2، توانست تعداد سلول های دارای IκBα را کاهش معنی دار دهد. یعنی با کاهش این مولکول توسط استروژن، کاهش تخریب آن به دست می آید که به طور معکوسی بیان گر افزایش مهار NFκB می باشد. به عبارت دیگر استروژن از یک طرف یاخته های حاوی دایمرهای NFκB را کاهش می دهد و از طرف دیگر با این عملی که بیان شد، باعث مهار NFκB می شود. هم چنین اختلاف معنی دار بین سلول های مختلف مغزی تحت درمان با استروژن مشاهده نشد.
در توافق با نتایج مطالعه حاضر، گزارش شده است که مسیر پیام رسانی سیتوکین ها می تواند تحت تاثیر هومون های استروئیدی جنسی زنانه قرار گیرد که از جمله می توان به مطالعات زیر اشاره کرد: استروژن می تواند القاء ژن های التهاب زا را از طرق زیر تضعیف کند:1- تداخل با اتصال NFκB به DNA؛ 2 -افزایش میزان های پایدار κB (فرم غیر فسفریله آن) در سیتوپلاسم ؛ 3- جلوگیری از انتقالNFκB به داخل هسته .(Shih et al., 2006)استروژن خونریزی زیر آراکنوئید را از طریق تداخل باNFκB ، مهار می کند و این یکی از مسیرهایی است که استروژن با التهاب مبارزه می کند (Shih et al., 2006).
در یک مطالعه فعالیت IKKα با LPS افزایش یافت و درمان با E2 ، فعالیت IKKα و تخریب IκBα را مهار نموده و نتیجه کلی این که مهار E2 از ورود به هسته NFκB، می تواند با بلوک فعالیت IKKα وساطت شود که منجر به کاهش تخریبIκBα می گردد (Simoncini et al., 2000). اگرچه گزارش شده است سطوح IκBα بیان شده در سلول های قلبی در دوره های مختلف استروس مشابه بود، لیکن بیان p-IκBα در گروه های OVX و دی استروس (که سطح استروژن پایین است)، پس از تروما افزایش معنی دار یافت. هم چنین بیان p-IκBα تغییری در گروه پرواستروس نداشت (Yang et al., 2006) .
سلولهای گلیال در عملکردهای بسیار متنوعی ﻣﺎﻧﻨﺪ: تنظیم متابولیسم نورونی، فعالیت نورونی، انتقال نورونی و شکل پذیری145سیناپسی دخیلند. به طور کلی اعمال استرادیول روی سلولهای گلیال برای حفظ هومئوستاز فیزیولوژیک، مهم است .سلولهای گلیال گیرنده های کلاسیک استروژن را بیان می کنند و در شرایط مختلف پاتولوژی این بیان افزایش می یابد. این می تواند باعث تسهیل اعمال استرادیول برای کاهش آسیب نورونی ﺷﻮد (Arevalo et al., 2010). هم چنین استرادیول وقایع انتقال پیام سریعی را در سلولهای گلیال از طریق گیرنده های غشایی استروژن، تنظیم فعالیت مسیرهای انتقال پیام کینازی اعمال می کند. به علاوه استرادیول با اعمال آنتی اکسیدانی مستقل از گیرنده نیز می تواند باعث کاهش استرس اکسیداتیو دخیل در فعالیت گلیاها شود (Wise et al., 2005, Johann and Beyer, 2013). بیش از دو دهه است که معلوم شده آستروسیت ها یکی از اهداف سلولی استرادیول در مغز هستند. این هورمون بیان مولکول های مختلفی را که مربوط به پاسخهای فیزیولوژی و پاتولوژی این سلولها هستند، تنظیم می کند. استرادیول هم چنین از طریق تغییر در بیان پروتئین های اسکلت ﺳﻠﻮﻟﯽ در این سلول ها می تواند رشد آکسونی و شکل پذیری سیناپسی را تنظیم کند. بیان شده است که آستروسیت ها اعمال حفاظت عصبی را با آزادسازی TGF-1β در پاسخ به استرادیول انجام می دهند (Arevalo et al., 2010). استرادیول با اثر بر میکروگلیاها نیز آثار ضد التهابی روی سیستم عصبی اعمال می ﮐﻨﺪ (Johann and Beyer, 2013). گیرنده های آلفا و بتا در آستروسیت ها و میکروگلیاها درشرایط پاتولوژی، کاهش رهایش سیتوکین های التهابی را موجب شده و از این طریق حفاظت عصبی را ایجاد می کنند. استرادیول به واسطﮥ مکانیسم های تنظیم نسخه برداری و مستقل از گیرنده، نیز آثار ضدالتهابی روی میکروگلیاها دارد (Arevalo et al., 2010, Johann and Beyer, 2013).
آستروسیت و میکروگلیا می توانند IL-10، گیرنده IL-10 و SOCS-3 را بیان می کنند (Qin et al., 2007). E2 یک تعدیل کننده مهم پاسخ التهاب عصبی خصوصاً از طریق اعمالش روی میکروگلیا (سلول های ساکن مغز) می باشد (Nordell et al., 2005). در یک مطالعه حضور آنزیم آروماتازP450 در آستروسیت ها گزارش شده است (Veiga et al., 2005). سطوح موضعی سیتوکین های التهابی مانند βIL-1 بعد از آسیب عصبی ناشی از ضربه، از دو منبع ناشی می شود: اول از فعالیت میکروگلیای موضعی و سرانجام از ورود ماکروفاژهای خون ( و محصولات آن ها) به داخل مغز که به علت تغییرات پیش رونده در BBB صورت می گیرد و از آن جایی که استروژن نفوذپذیری BBB را کم می کند، پس می تواند مهاجرت ماکروفاژها را به مغز کم کند (Vegeto et al., 2003) . مکانیسم استروژن: استروژن آثارش را نه فقط با اثر بر میکروگلیای موضعی، بلکه با کاهش منبع146 سلول های ایمنی فعال شده که از منابع در گردش به محل مرکزی آسیب آمده اند و هم چنین با حفظ یکپارچگی BBB و یا با اثر مستقیم روی ماکروفاژ/ مونوسیت ها اعمال می کند (Nordell et al., 2005). علاوه بر اثر مستقیم حفاظتی E2 روی نورون ها، شواهدی وجود دارد که استروژن آثار غیر مستقیمی نیز روی آستروسیت و میکروگلیا دارد که می تواند حفاظت عصبی E2را در ایسکمی مغزی تسهیل کند (Brann et al., 2007). بیان هر دو گیرنده آلفا و بتای استروژن در آستروسیت های کورتکس در in vivo نشان داده شده است(Dhandapani et al., 2005) . آستروسیت ها در عمل حفاظت عصبی استروژن نقش مهمی دارند (Brann et al., 2007). با توجه به اینکه دز های فیزیولوژیک استروژن در کشت آستروسیت-نورون، حفاظتی هستند، گواهی بر اثر حفاظتی استروژن بر روی آستروسیت است (Dhandapani and Brann, 2003). از آن جا که TGF-β اثر نوروپروتکتیو در ایسکمی مغزی دارد (Zhu et al., 2002)، احتمالاً استروژن از طریق تغییر در TGF-β1 در آستروسیت ها حفاظت عصبی را انجام داده است (Brann et al., 2007).
در بسیاری از اختلالات تخریب عصبی، پس از آسیب نورونی، میکروگلیاهای فعال شده فاکتورهای التهاب زا را ترشح می کنند که می تواند در پیشرفت آسیب عصبی دخیل باشد. استروژن می تواند فعالیت میکروگلیا را سرکوب کند و در نتیجه حفاظت عصبی ایجاد نماید (Bruce-Keller et al., 2000). اخیراً Wen و همکاران (Wen et al., 2004) نشان دادند که استرادیول پاسخ های التهابی را طی ایسکمی مغزی با سه مکانیسم کاهش می دهد: کاهش در فسفریلاسیون IκBα، کاهش فعالیت NFκB و مهار بیان iNOS147 اعمال می کند و به خصوص مهار iNOS مهم است چون پیشنهاد شده که به علت اینکه میکروگلیا مکان مهمی برای تولید iNOS است، القای مرگ نورونی توسط میکروگلیا ناشی از مکانیسمی دخیل در NO است (Gibbons and Dragunow, 2006)، بنابراین برای اعمال اثر حفاظت عصبی استروژن از طریق میکروگلیا مهم می باشد.

نتیجه گیری:
به طور خلاصه یافته های اصلی این پژوهش عبارتند از:
1-بعد از TBI خیز مغزی افزایش می یابد که این افزایش توسط مصرف انفرادی استروئیدهای جنسی (استروژن و پروژسترون) یا مصرف ترکیبی آن ها کاهش پیدا می کند. تفاوت در اثر مهاری این هورمون ها بر روی خیز مغزی مشاهده نشد.
2- تعداد سلول های p-STAT-3مثبت یافت شده در مغز در بعد از TBIافزایش نشان داد. این افزایش فقط توسط دز بالای استروژن مهار شد، که بیشترین اثر مهاری بر روی نورون ها در مقایسه با میکروگلیا یا آستروسیت ها اعمال می شد.
3- اگرچه تعداد سلول های SOCS-3 مثبت در مغز ، بعد از TBI تغییر پیدا نکرد، اما دز بالای استروژن و هم چنین ترکیب استروژن با پروژسترون افزایش در این سلول های با SOCS-3 مثبت را موجب شد. هم چنین اثر این دز استروژن، بیشتر از دز کم آن یا پروژسترون بود. یاخته هدف برای این اثر استروژن، میکروگلیا و آستروسیت بود.
4- تعداد سلول های NFκB-P52 مثبت مغز، تحت تاثیر TBI قرار نگرفت، اما استروژن با دز زیاد کاهش سلول های با NFκB-P52 مثبت را کاهش داد که این اثر کاهشی اختلاف معنی دار با گروه ترکیبی و غظت کم پروژسترون داشت و این اثر به طور یکسان بر روی هر سه نوع سلول مغزی اعمال شد.
5- تعداد سلول های p-NFκB-P65 مثبت یافت شده در مغز بعد از TBI افزایش یافت. دز بالای استروژن، کاهش این سلول ها را در بعد از TBI موجب شد. علاوه بر این اثر این دز زیاد استروژن، بیشتر از دز کم استروژن و هم چنین دو دز پروژسترون یا گروه ترکیبی بود. دز کم استروژن آستروسیت ها را برای اعمال اثر خود انتخاب نموده است.
6- درصد p-IκBα Positive Cells بعد از TBI، تغییر پیدا نکرد، اما دز بالای استروژن تعداد این سلول ها را کاهش داد، که این اثر مهاری آن به طور یکسانی بر روی یاخته های مختلف مغزی اعمال گردید.
7- E2 افزایش درصد ادم بافتی، دژنراسیون نورونی و آپوپتوز نورونی و E1 افزایش درصد احتقان پس از TBI را کاهش دادند.
با توجه به نتایج فوق، اولاً هورمون موثر ، دز زیاد استروژن می باشد که وقتی به صورت ترکیب با پروژسترون مصرف می شود در بسیاری از موارد اثرات آن از بین می رود و ثانیاً به نظر می رسد که یکی از مکانیسم های احتمالی حفاظت عصبی (کاهش خیز مغزی) استروژن بعد از TBI، از طریق اثرگذاری بر روی مسیر پیام رسانی سیتوکین های التهابی یعنی کاهش مولکول های p-STAT-3،NFκB-P52 ،p-NFκB-P65 و p-IκBα و یا افزایش SOCS-3 می باشد.
پیشنهادات:
1-بررسی های انجام شده در پژوهش حاضر که در برش اول مغز انجام شد، در برش های دوم و سوم مغز یعنی عمق بیشتری از مغز یا فاصله بیشتر از محل ضربه مغزی انجام شود.
2- مقدار مولکول های پروتئینی که در سلول ها به روش IHC بررسی شدند، توسط روش های دیگر از قبیل وسترن بلات یا الیزا در مغز پس از تروما، اندازه گیری شود.

فهرست منابع:

1-Abu-Taha, M., Rius, C., Hermenegildo, C., Noguera, I., Cerda-Nicolas, J. M., Issekutz, A. C., Jose, P. J., Cortijo, J., Morcillo, E. J. & Sanz, M. J. 2009. Menopause And Ovariectomy Cause A Low Grade Of Systemic Inflammation That May Be Prevented By Chronic Treatment With Low Doses Of Estrogen Or Losartan. J Immunol, 183, 1393-402.

2-Abul Abbas K, L. A., Pillali S. Cellular And Molecular Immunology.6th Edition Saunders. 2007. Cellular And Molecular Immunology.6th Edition Saunders., 301-430.

3-Aid, S., Langenbach, R. & Bosetti, F. 2008. Neuroinflammatory Response To Lipopolysaccharide Is Exacerbated In Mice Genetically Deficient In Cyclooxygenase-2. J Neuroinflammation, 5, 17-21.

4-Alkayed, N. J., Goto, S., Sugo, N., Joh, H.-D., Klaus, J., Crain, B. J., Bernard, O., Traystman, R. J. & Hurn, P. D. 2001. Estrogen And Bcl-2: Gene Induction And Effect Of Transgene In Experimental Stroke. The Journal Of Neuroscience, 21, 7543-7550.

5-An, J., Ribeiro, R. C., Webb, P., Gustafsson, J.-Å., Kushner, P. J., Baxter, J. D. & Leitman, D. C. 1999. Estradiol Repression Of Tumor Necrosis Factor-Α Transcription Requires Estrogen Receptor Activation Function-2 And Is Enhanced By Coactivators. Proceedings Of The National Academy Of Sciences, 96, 15161-15166.

6-Andelic, N., Sigurdardottir, S., Brunborg, C. & Roe, C. 2008. Incidence Of Hospital-Treated Traumatic Brain Injury In The Oslo Population. Neuroepidemiology, 30, 120-128

7-Arevalo, M.-A., Santos-Galindo, M., Bellini, M.-J., Azcoitia, I. & Garcia-Segura, L. M. 2010. Actions Of Estrogens On Glial Cells: Implications For Neuroprotection. Biochimica Et Biophysica Acta (Bba)-General Subjects, 1800, 1106-1112.

8-Auernhammer, C. J., Chesnokova, V., Bousquet, C. & Melmed, S. 1998. Pituitary Corticotroph Socs-3: Novel Intracellular Regulation Of Leukemia-Inhibitory Factor-Mediated Proopiomelanocortin Gene Expression And Adrenocorticotropin Secretion. Molecular Endocrinology, 12, 954-961.

9-Auernhammer, C. J. & Melmed, S. 1999. Interleukin-11 Stimulates Proopiomelanocortin Gene Expression And Adrenocorticotropin Secretion In Corticotroph Cells: Evidence For A Redundant Cytokine Network In The Hypothalamo-Pituitary-Adrenal Axis. Endocrinology, 140, 1559-66.

10-Baeuerle, P. A. 1998. Ikappab-Nf-Kappab Structures: At The Interface Of Inflammation Control. Cell, 95, 729-31.

11-Baker, B. J., Akhtar, L. N. & Benveniste, E. N. 2009. Socs1 And Socs3 In The Control Of Cns Immunity. Trends In Immunology, 30, 392-400.

12-Baldwin, A. S., Jr. 1996. The Nf-Kappa B And I Kappa B Proteins: New Discoveries And Insights. Annu Rev Immunol, 14, 649-83.

13-Behl, C. & Manthey, D. 2000. Neuroprotective Activities Of Estrogen: An Update. Journal Of Neurocytology, 29, 351-358.

14-Bermpohl, D., You, Z., Lo, E. H., Kim, H. H. & Whalen, M. J. 2007. Tnf Alpha And Fas Mediate Tissue Damage And Functional Outcome After Traumatic Brain Injury In Mice. Journal Of Cerebral Blood Flow & Metabolism, 27, 1806-1818.

15-BjöRnströM, L. & SjöBerg, M. 2002. Signal Transducers And Activators Of Transcription As Downstream Targets Of Nongenomic Estrogen Receptor Actions. Molecular Endocrinology, 16, 2202-2214.

16-Bondanelli, M., Ambrosio, M. R., Zatelli, M. C., De Marinis, L. & Degli Uberti, E. C. 2005. Hypopituitarism After Traumatic Brain Injury. European Journal Of Endocrinology, 152, 679-691.

17-Bonthius, D. J., Bonthius, N. E., Li, S. & Karacay, B. 2008. The Protective Effect Of Neuronal Nitric Oxide Synthase (Nnos) Against Alcohol Toxicity Depends Upon The No-Cgmp-Pkg Pathway And Nf-Κb. Neurotoxicology, 29, 1080-1091.

18-Bousquet, C., Susini, C. & Melmed, S. 1999. Inhibitory Roles For Shp-1 And Socs-3 Following Pituitary Proopiomelanocortin Induction By Leukemia Inhibitory Factor. Journal Of Clinical Investigation, 104, 1277-1285.

19-Brann, D. W., Dhandapani, K., Wakade, C., Mahesh, V. B. & Khan, M. M. 2007. Neurotrophic And Neuroprotective Actions Of Estrogen: Basic Mechanisms And Clinical Implications. Steroids, 72, 381-405.

20-Brann, D. W., Zamorano, P. L., De Sevilla, L. & Mahesh, V. B. 2005. Expression Of Glutamate Receptor Subunits In The Hypothalamus Of The Female Rat During The Afternoon Of The Proestrous Luteinizing Hormone Surge And Effects Of Antiprogestin Treatment And Aging. Neuroendocrinology, 81, 120-128.

21-Brown, C. M., Mulcahey, T. A., Filipek, N. C. & Wise, P. M. 2010a. Production Of Proinflammatory Cytokines And Chemokines During Neuroinflammation: Novel Roles For Estrogen Receptors Alpha And Beta. Endocrinology, 151, 4916-25.

22-Brown, C. M., Mulcahey, T. A., Filipek, N. C. & Wise, P. M. 2010b. Production Of Proinflammatory Cytokines And Chemokines During Neuroinflammation: Novel Roles For Estrogen Receptors Α And Β. Endocrinology, 151, 4916-4925.

23-Bruce-Keller, A. J., Keeling, J. L., Keller, J. N., Huang, F. F., Camondola, S. & Mattson, M. P. 2000. Antiinflammatory Effects Of Estrogen On Microglial Activation 1. Endocrinology, 141, 3646-3656.

24-Bryant, D. N., Bosch, M. A., Ronnekleiv, O. K. & Dorsa, D. M. 2005. 17-Beta Estradiol Rapidly Enhances Extracellular Signal-Regulated Kinase 2 Phosphorylation In The Rat Brain. Neuroscience, 133, 343-52.

25-Cadosch, D., Al-Mushaiqri, M. S., Gautschi, O. P., Chan, E., Jung, F. J., Skirving, A. P. & Filgueira, L. 2010. Immune Response Deviation And Enhanced Expression Of Chemokine Receptor Ccr4 In Tbi Patients Due To Unknown Serum Factors. Injury, 41, E4-9.

26-Campbell, I. L. 2005. Cytokine-Mediated Inflammation, Tumorigenesis, And Disease-Associated Jak/Stat/Socs Signaling Circuits In The Cns. Brain Res Brain Res Rev, 48, 166-77.

27-Cassatella, M. A., Gasperini, S., Bovolenta, C., Calzetti, F., Vollebregt, M., Scapini, P., Marchi, M., Suzuki, R., Suzuki, A. & Yoshimura, A. 1999. Interleukin-10 (Il-10) Selectively Enhances Cis3/Socs3 Mrna Expression In Human Neutrophils: Evidence For An Il-10-Induced Pathway That Is Independent Of Stat Protein Activation. Blood, 94, 2880-2889.

28-Cederberg, D. & Siesjö, P. 2010. What Has Inflammation To Do With Traumatic Brain Injury? Child's Nervous System, 26, 221-226.

29-Cerciat, M., Unkila, M., Garcia-Segura, L. M. & Arevalo, M. A. 2010. Selective Estrogen Receptor Modulators Decrease The Production Of Interleukin-6 And Interferon-Gamma-Inducible Protein-10 By Astrocytes Exposed To Inflammatory Challenge In Vitro. Glia, 58, 93-102.

30-Cernak, I., Stoica, B., Byrnes, K. R., Di Giovanni, S. & Faden, A. I. 2005. Report Role Of The Cell Cycle In The Pathobiology Of Central Nervous System Trauma. Cell Cycle, 4, 1286-1293.

31-Chen, H. Y., Chen, T. Y., Lee, M. Y., Chen, S. T., Hsu, Y. S., Kuo, Y. L., Chang, G. L., Wu, T. S. & Lee, E. 2006. Melatonin Decreases Neurovascular Oxidative/Nitrosative Damage And Protects Against Early Increases In The Blood-Brain Barrier Permeability After Transient Focal Cerebral Ischemia In Mice. Journal Of Pineal Research, 41, 175-182.

32-Chen, X., Li, Y., Kline, A., Dixon, C., Zafonte, R. & Wagner, A. 2005. Gender And Environmental Effects On Regional Brain-Derived Neurotrophic Factor Expression After Experimental Traumatic Brain Injury. Neuroscience, 135, 11-17.

33-Choi, J. S., Kim, S. J., Shin, J. A., Lee, K. E. & Park, E. M. 2008. Effects Of Estrogen On Temporal Expressions Of Il-1beta And Il-1ra In Rat Organotypic Hippocampal Slices Exposed To Oxygen-Glucose Deprivation. Neurosci Lett, 438, 233-7.

34-Choi, W. H., Ji, K. A., Jeon, S. B., Yang, M. S., Kim, H., Min, K. J., Shong, M., Jou, I. & Joe, E. H. 2005. Anti-Inflammatory Roles Of Retinoic Acid In Rat Brain Astrocytes: Suppression Of Interferon-Gamma-Induced Jak/Stat Phosphorylation. Biochem Biophys Res Commun, 329, 125-31.

35-Chong, M. M., Thomas, H. E. & Kay, T. W. 2002. Suppressor Of Cytokine Signaling-1 Regulates The Sensitivity Of Pancreatic Β Cells To Tumor Necrosis Factor. Journal Of Biological Chemistry, 277, 27945-27952.

36-Chong, Z. Z., Li, F. & Maiese, K. 2005. Oxidative Stress In The Brain: Novel Cellular Targets That Govern Survival During Neurodegenerative Disease. Progress In Neurobiology, 75, 207-246.

37-Clark, R. S. B., Kochanek, P. M., Chen, M., Watkins, S. C., Marion, D. W., Chen, J. U. N., Hamilton, R. L., Loeffert, J. & Graham, S. H. 1999. Increases In Bcl-2 And Cleavage Of Caspase-1 And Caspase-3 In Human Brain After Head Injury. The Faseb Journal, 13, 813.

38-Cotron Rs, K. V., Robbins Si 2003. Basic Pathology 7th Edition In Phyladelphia, Saunders Company. 47-58.

39-Csuka, E., Morganti-Kossmann, M. C., Lenzlinger, P. M., Joller, H., Trentz, O. & Kossmann, T. 1999. Il-10 Levels In Cerebrospinal Fluid And Serum Of Patients With Severe Traumatic Brain Injury: Relationship To Il-6, Tnf-Α, Tgf-Β1 And Blood-Brain Barrier Function. Journal Of Neuroimmunology, 101, 211-221.

40-Cutler, S. M., Pettus, E. H., Hoffman, S. W. & Stein, D. G. 2005. Tapered Progesterone Withdrawal Enhances Behavioral And Molecular Recovery After Traumatic Brain Injury. Exp Neurol, 195, 423-9.

41-Dabbs, D. J. 2013. Diagnostic Immunohistochemistry, Elsevier Health Sciences.

42-Dewitt, D. S. & Prough, D. S. 2003. Traumatic Cerebral Vascular Injury: The Effects Of Concussive Brain Injury On The Cerebral Vasculature. Journal Of Neurotrauma, 20, 795-825.

43-Dhandapani, K. M. & Brann, D. W. 2003. Neuroprotective Effects Of Estrogen And Tamoxifen In Vitro. Endocrine, 21, 59-66.
44-Dhandapani, K. M., Wade, F. M., Mahesh, V. B. & Brann, D. W. 2005. Astrocyte-Derived Transforming Growth Factor-{Beta} Mediates The Neuroprotective Effects Of 17{Beta}-Estradiol: Involvement Of Nonclassical Genomic Signaling Pathways. Endocrinology, 146, 2749-59.

45-Di Domenico, F., Casalena, G., Jia, J., Sultana, R., Barone, E., Cai, J., Pierce, W. M., Cini, C., Mancuso, C. & Perluigi, M. 2012. Sex Differences In Brain Proteomes Of Neuron‐Specific Stat3‐Null Mice After Cerebral Ischemia/Reperfusion. Journal Of Neurochemistry, 121, 680-692.

46-Di Domenico, F., Casalena, G., Sultana, R., Cai, J., Pierce, W. M., Perluigi, M., Cini, C., Baracca, A., Solaini, G., Lenaz, G., Jia, J., Dziennis, S., Murphy, S. J., Alkayed, N. J. & Butterfield, D. A. 2010. Involvement Of Stat3 In Mouse Brain Development And Sexual Dimorphism: A Proteomics Approach. Brain Res, 1362, 1-12.

47-Di Giovanni, S., Movsesyan, V., Ahmed, F., Cernak, I., Schinelli, S., Stoica, B. & Faden, A. I. 2005. Cell Cycle Inhibition Provides Neuroprotection And Reduces Glial Proliferation And Scar Formation After Traumatic Brain Injury. Proc Natl Acad Sci U S A, 102, 8333-8.

48-Dinapoli, V., Benkovic, S., Li, X., Kelly, K., Miller, D., Rosen, C., Huber, J. & O'callaghan, J. 2010. Age Exaggerates Proinflammatory Cytokine Signaling And Truncates Signal Transducers And Activators Of Transcription 3 Signaling Following Ischemic Stroke In The Rat. Neuroscience, 170, 633-644.

49-Djebaili, M., Guo, Q., Pettus, E. H., Hoffman, S. W. & Stein, D. G. 2005. The Neurosteroids Progesterone And Allopregnanolone Reduce Cell Death, Gliosis, And Functional Deficits After Traumatic Brain Injury In Rats. J Neurotrauma, 22, 106-18.

50-Donnelly, R. P., Dickensheets, H. & Finbloom, D. S. 1999. The Interleukin-10 Signal Transduction Pathway And Regulation Of Gene Expression In Mononuclear Phagocytes. Journal Of Interferon & Cytokine Research, 19, 563-573.

51-Drew, P. D. & Chavis, J. A. 2000. Female Sex Steroids: Effects Upon Microglial Cell Activation. J Neuroimmunol, 111, 77-85.

52-Duckles, S. P. & Krause, D. N. 2007. Cerebrovascular Effects Of Oestrogen: Multiplicity Of Action. Clin Exp Pharmacol Physiol, 34, 801-8.

53-Dziennis, S., Jia, T., Rønnekleiv, O. K., Hurn, P. D. & Alkayed, N. J. 2007. Role Of Signal Transducer And Activator Of Transcription-3 In Estradiol-Mediated Neuroprotection. The Journal Of Neuroscience, 27, 7268-7274.

54-Eldadah, B. A. & Faden, A. I. 2000. Caspase Pathways, Neuronal Apoptosis, And Cns Injury. J Neurotrauma, 17, 811-29.
55-Fan, L., Young, P. R., Barone, F. C., Feuerstein, G. Z., Smith, D. H. & Mcintosh, T. K. 1995. Experimental Brain Injury Induces Expression Of Interleukin-1β Mrna In The Rat Brain. Molecular Brain Research, 30, 125-130.

56-Fassbender, K., Schneider, S., Bertsch, T., Schlueter, D., Fatar, M., Ragoschke, A., Kühl, S., Kischka, U. & Hennerici, M. 2000. Temporal Profile Of Release Of Interleukin-1β In Neurotrauma. Neuroscience Letters, 284, 135-138.

57-Feldman, Z., Kanter, M. J., Robertson, C. S., Contant, C. F., Hayes, C., Sheinberg, M. A., Villareal, C. A., Narayan, R. K. & Grossman, R. G. 1992. Effect Of Head Elevation On Intracranial Pressure, Cerebral Perfusion Pressure, And Cerebral Blood Flow In Head-Injured Patients. Journal Of Neurosurgery, 76, 207-211.

58-Finnie, J. W. 2001. Animal Models Of Traumatic Brain Injury: A Review. Australian Veterinary Journal, 79, 628-633.

59-Gennarelli, T. A., Thibault, L. E., Adams, J. H., Graham, D. I., Thompson, C. J. & Marcincin, R. P. 1982. Diffuse Axonal Injury And Traumatic Coma In The Primate. Annals Of Neurology, 12, 564-574.

60-Gibbons, H. M. & Dragunow, M. 2006. Microglia Induce Neural Cell Death Via A Proximity-Dependent Mechanism Involving Nitric Oxide. Brain Research, 1084, 1-15.

61-Gopcevic, A., Mazul-Sunko, B., Marout, J., Sekulic, A., Antoljak, N., Siranovic, M., Ivanec, Z., Margaritoni, M., Bekavac-Beslin, M. & Zarkovic, N. 2007. Plasma Interleukin-8 As A Potential Predictor Of Mortality In Adult Patients With Severe Traumatic Brain Injury. The Tohoku Journal Of Experimental Medicine, 211, 387-393.

62-Goss, C. W., Hoffman, S. W. & Stein, D. G. 2003. Behavioral Effects And Anatomic Correlates After Brain Injury: A Progesterone Dose-Response Study. Pharmacology Biochemistry And Behavior, 76, 231-242.

63-Groswasser, Z., Cohen, M. & Keren, O. 1998. Female Tbi Patients Recover Better Than Males. Brain Inj, 12, 805-8.

64-Gül, Ş., Çelik, S. E., Kalaycı, M., Taşyürekli, M., Çokar, N. & Bilge, T. 2005. Dose-Dependent Neuroprotective Effects Of Melatonin On Experimental Spinal Cord Injury In Rats. Surgical Neurology, 64, 355-361.

65-Gwinnutt, C. & Carroll, C. 2005. Head Injury-Pathophysiology And Management: Pl Reilly, R. Bullock (Eds). Hodder Arnold: London, Uk, 2005, 501 Pp, Isbn: 0340-80724-5; Price£ 145.00. Cambridge Univ Press.

66-Hanke, J. & Sabel, B. A. 2004. L-Type Calcium Channel Antagonist Nifedipine Reduces Neurofilament Restitution Following Traumatic Optic Nerve Injury. Acta Neurochirurgica-Supplementum Then Supplement-Wien-, 89, 75-80.

67-He, J., Evans, C.-O., Hoffman, S. W., Oyesiku, N. M. & Stein, D. G. 2004a. Progesterone And Allopregnanolone Reduce Inflammatory Cytokines After Traumatic Brain Injury. Experimental Neurology, 189, 404-412.

68-He, J., Hoffman, S. W. & Stein, D. G. 2004b. Allopregnanolone, A Progesterone Metabolite, Enhances Behavioral Recovery And Decreases Neuronal Loss After Traumatic Brain Injury. Restorative Neurology And Neuroscience, 22, 19-31.

69-Heissmeyer, V., Krappmann, D., Hatada, E. N. & Scheidereit, C. 2001. Shared Pathways Of Ikappab Kinase-Induced Scf(Betatrcp)-Mediated Ubiquitination And Degradation For The Nf-Kappab Precursor P105 And Ikappabalpha. Mol Cell Biol, 21, 1024-35.

70-Helps, Y. L., Henley, G. & Harrison, J. E. 2008. Hospital Separations Due To Traumatic Brain Injury, Australia 2004-05, Australian Institute Of Health And Welfare Adelaide,, Australia.

71-Herson, P. S., Koerner, I. P. & Hurn, P. D. 2009. Sex, Sex Steroids, And Brain Injury. Semin Reprod Med, 27, 229-39.

72-Hildebrand, F., Pape, H. C. & Krettek, C. 2005. [The Importance Of Cytokines In The Posttraumatic Inflammatory Reaction]. Unfallchirurg, 108, 793-4, 796-803.

73-Hoffman, G., Le, W., Murphy, A. & Koski, C. 2001. Divergent Effects Of Ovarian Steroids On Neuronal Survival During Experimental Allergic Encephalitis In Lewis Rats. Experimental Neurology, 171, 272-284.

74-Hoffman, G. E., Merchenthaler, I. & Zup, S. L. 2006a. Neuroprotection By Ovarian Hormones In Animal Models Of Neurological Disease. Endocrine, 29, 217-231.

75-Hoffman, G. E., Merchenthaler, I. & Zup, S. L. 2006b. Neuroprotection By Ovarian Hormones In Animal Models Of Neurological Disease. Endocrine, 29, 217-31.

76-Hofman, K., Primack, A., Keusch, G. & Hrynkow, S. 2005. Addressing The Growing Burden Of Trauma And Injury In Low-And Middle-Income Countries. American Journal Of Public Health, 95, 13.

77-Hurn, P. D., Littleton-Kearney, M. T., Kirsch, J. R., Dharmarajan, A. & Traystman, R. J. 1995. Postischemic Cerebral Blood Flow Recovery In The Female: Effect Of 17β-Estradiol. Journal Of Cerebral Blood Flow & Metabolism, 15, 666-672.

78-Jennett, B. 1996. Epidemiology Of Head Injury. Journal Of Neurology, Neurosurgery, And Psychiatry, 60, 362.
79-Johann, S. & Beyer, C. 2013. Neuroprotection By Gonadal Steroid Hormones In Acute Brain Damage Requires Cooperation With Astroglia And Microglia. The Journal Of Steroid Biochemistry And Molecular Biology, 137, 71-81.

80-Jones, N. C., Constantin, D., Prior, M. J., Morris, P. G., Marsden, C. A. & Murphy, S. 2005a. The Neuroprotective Effect Of Progesterone After Traumatic Brain Injury In Male Mice Is Independent Of Both The Inflammatory Response And Growth Factor Expression. European Journal Of Neuroscience, 21, 1547-1554.

81-Jones, N. C., Prior, M. J. W., Burden‐Teh, E., Marsden, C. A., Morris, P. G. & Murphy, S. 2005b. Antagonism Of The Interleukin‐1 Receptor Following Traumatic Brain Injury In The Mouse Reduces The Number Of Nitric Oxide Synthase‐2€Positive Cells And Improves Anatomical And Functional Outcomes. European Journal Of Neuroscience, 22, 72-78.

82-Jones, W. K., Brown, M., Ren, X., He, S. & Mcguinness, M. 2003. Nf-Κb As An Integrator Of Diverse Signaling Pathways. Cardiovascular Toxicology, 3, 229-253.

83-Kadhim, H. J., Duchateau, J. & Sã(c)Bire, G. 2008a. Cytokines And Brain Injury: Invited Review. Journal Of Intensive Care Medicine, 23, 236-249.

84-Kadhim, H. J., Duchateau, J. & Sebire, G. 2008b. Cytokines And Brain Injury: Invited Review. J Intensive Care Med, 23, 236-49.

85-Kelly, D. F., Martin, N. A., Kordestani, R., Counelis, G., Hovda, D. A., Bergsneider, M., Mcbride, D. Q., Shalmon, E., Herman, D. & Becker, D. P. 1997. Cerebral Blood Flow As A Predictor Of Outcome Following Traumatic Brain Injury. Journal Of Neurosurgery, 86, 633-641.

86-Kelly, M. J., Qiu, J. & Rønnekleiv, O. K. 2005. Estrogen Signaling In The Hypothalamus. Vitamins & Hormones, 71, 123-145.

87-Kelso, M. L., Scheff, N. N., Scheff, S. W. & Pauly, J. R. 2011. Melatonin And Minocycline For Combinatorial Therapy To Improve Functional And Histopathological Deficits Following Traumatic Brain Injury. Neuroscience Letters, 488, 60-64.

88-Khaksari, H. M., Soltani, Z., Sarkaki Alireza, S. G. & Hajizadeh, S. 2010a. Effect Of Estrogen And Progesterone On Cytokines Levels At Different Time Intervals After Traumatic Brain Injury. Physiology And Pharmacology.

89-Khaksari, M., Soltani, Z., Shahrokhi, N., Moshtaghi, G. & Asadikaram, G. 2010b. The Role Of Estrogen And Progesterone, Administered Alone And In Combination, In Modulating Cytokine Concentration Following Traumatic Brain Injury. Canadian Journal Of Physiology And Pharmacology, 89, 31-40.
90-Kinjyo, I., Hanada, T., Inagaki-Ohara, K., Mori, H., Aki, D., Ohishi, M., Yoshida, H., Kubo, M. & Yoshimura, A. 2002. Socs1/Jab Is A Negative Regulator Of Lps-Induced Macrophage Activation. Immunity, 17, 583-591.

91-Klatzo, I. 1967. Neuropathological Aspects Of Braix Edema. Journal Of Neuropathology & Experimental Neurology, 26, 1-14.

92-Komine-Kobayashi, M., Zhang, N., Liu, M., Tanaka, R., Hara, H., Osaka, A., Mochizuki, H., Mizuno, Y. & Urabe, T. 2005. Neuroprotective Effect Of Recombinant Human Granulocyte Colony-Stimulating Factor In Transient Focal Ischemia Of Mice. Journal Of Cerebral Blood Flow & Metabolism, 26, 402-413.

93-Kondo, Y., Suzuki, K. & Sakuma, Y. 1997. Estrogen Alleviates Cognitive Dysfunction Following Transient Brain Ischemia In Ovariectomized Gerbils. Neuroscience Letters, 238, 45-48.

94-Koski, C. L., Hila, S. & Hoffman, G. E. 2004. Regulation Of Cytokine-Induced Neuron Death By Ovarian Hormones: Involvement Of Antiapoptotic Protein Expression And C-Jun N-Terminal Kinase-Mediated Proapoptotic Signaling. Endocrinology, 145, 95-103.

95-Kossmann, T., Hans, V. H., Imhof, H.-G., Stocker, R., Grob, P., Trentz, O. & Morganti-Kossmann, M. C. 1995. Intrathecal And Serum Interleukin-6 And The Acute-Phase Response In Patients With Severe Traumatic Brain Injuries. Shock, 4, 311-317.

96-Koyama, Y., Matsui, S., Itoh, S., Osakada, M., Baba, A. & Matsuda, T. 2004. The Selective Na+-Ca2+ Exchange Inhibitor Attenuates Brain Edema After Radiofrequency Lesion In Rats. Eur J Pharmacol, 489, 193-6.

97-Kretz, A., Happold, C. J., Marticke, J. K. & Isenmann, S. 2005. Erythropoietin Promotes Regeneration Of Adult Cns Neurons Via Jak2/Stat3 And Pi3k/Akt Pathway Activation. Molecular And Cellular Neuroscience, 29, 569-579.

98-Lebel, E. R., Vallières, L. & Rivest, S. 2000. Selective Involvement Of Interleukin-6 In The Transcriptional Activation Of The Suppressor Of Cytokine Signaling-3 In The Brain During Systemic Immune Challenges 1. Endocrinology, 141, 3749-3763.

99-Ledeboer, A., Breve, J. J., Wierinckx, A., Van Der Jagt, S., Bristow, A. F., Leysen, J. E., Tilders, F. J. & Van Dam, A. M. 2002. Expression And Regulation Of Interleukin‐10 And Interleukin‐10 Receptor In Rat Astroglial And Microglial Cells. European Journal Of Neuroscience, 16, 1175-1185.

100-Lei, C., Deng, J., Wang, B., Cheng, D., Yang, Q., Dong, H. & Xiong, L. 2011. Reactive Oxygen Species Scavenger Inhibits Stat3 Activation After Transient Focal Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury In Rats. Anesthesia & Analgesia, 113, 153-159.

101-Leong, G. M., Moverare, S., Brce, J., Doyle, N., Gren, K. S., Dahlman-Wright, K., Gustafsson, J.-Å., Ho, K. K. Y., Ohlsson, C. & Leung, K.-C. 2004a. Estrogen Up-Regulates Hepatic Expression Of Suppressors Of Cytokine Signaling-2 And -3 In Vivo And In VitroEndocrinology, 145.
Leong, G. M., Moverare, S., Brce, J., Doyle, N., SjöGren, K., Dahlman-Wright, K., Gustafsson, J.-A., Ho, K. K., Ohlsson, C. & Leung, K.-C. 2004b. Estrogen Up-Regulates Hepatic Expression Of Suppressors Of Cytokine Signaling-2 And-3 In Vivo And In Vitro. Endocrinology, 145, 5525-5531.

102-Li, H.-C. & Zhang, G.-Y. 2003. Inhibitory Effect Of Genistein On Activation Of Stat3 Induced By Brain Ischemia/Reperfusion In Rat Hippocampus. Acta Pharmacologica Sinica, 24, 1131-1136.

103-Li, Y., Chu, N., Rostami, A. & Zhang, G.-X. 2006. Dendritic Cells Transduced With Socs-3 Exhibit A Tolerogenic/Dc2 Phenotype That Directs Type 2 Th Cell Differentiation In Vitro And In Vivo. The Journal Of Immunology, 177, 1679-1688.

104-Liang, X., He, M., Chen, T., Wu, Y., Tian, Y., Zhao, Y., Shen, Y., Liu, Y. & Yuan, Z. 2013. 17beta-Estradiol Suppresses The Macrophage Foam Cell Formation Associated With Socs3. Horm Metab Res, 45, 423-9.

105-Liu, H.-W., Iwai, M., Takeda-Matsubara, Y., Wu, L., Li, J.-M., Okumura, M., Cui, T.-X. & Horiuchi, M. 2002. Effect Of Estrogen And At1 Receptor Blocker On Neointima Formation. Hypertension, 40, 451-457.

106-Liu, R., Wen, Y., Perez, E., Wang, X., Day, A. L., Simpkins, J. W. & Yang, S.-H. 2005a. 17β-Estradiol Attenuates Blood-Brain Barrier Disruption Induced By Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury In Female Rats. Brain Research, 1060, 55-61.

107-Liu, X., Fan, X. L., Zhao, Y., Luo, G. R., Li, X. P., Li, R. & Le, W. D. 2005b. Estrogen Provides Neuroprotection Against Activated Microglia‐Induced Dopaminergic Neuronal Injury Through Both Estrogen Receptor‐Α And Estrogen Receptor‐Β In Microglia. Journal Of Neuroscience Research, 81, 653-665.

108-Lu, K. T., Wang, Y. W., Yang, J. T., Yang, Y. L. & Chen, H. I. 2005. Effect Of Interleukin-1 On Traumatic Brain Injury-Induced Damage To Hippocampal Neurons. Journal Of Neurotrauma, 22, 885-895.

109-Lucas, S. M., Rothwell, N. J. & Gibson, R. M. 2006. The Role Of Inflammation In Cns Injury And Disease. British Journal Of Pharmacology, 147, S232-S240.

110-Maegele, M., Sauerland, S., Bouillon, B., Schäfer, U., Trübel, H., Riess, P. & Neugebauer, E. 2007a. Differential Immunoresponses Following Experimental Traumatic Brain Injury, Bone Fracture And "Two-Hit"-Combined Neurotrauma. Inflammation Research, 56, 318-323.
111-Maegele, M., Sauerland, S., Bouillon, B., Schafer, U., Trubel, H., Riess, P. & Neugebauer, E. A. 2007b. Differential Immunoresponses Following Experimental Traumatic Brain Injury, Bone Fracture And "Two-Hit"-Combined Neurotrauma. Inflamm Res, 56, 318-23.

112-Marmarou, A. 2004. The Pathophysiology Of Brain Edema And Elevated Intracranial Pressure. Cleve Clin J Med, 71 Suppl 1, S6-8.

113-Marmarou, A., Foda, M. A. A.-E., Brink, W. V. D., Campbell, J., Kita, H. & Demetriadou, K. 1994. A New Model Of Diffuse Brain Injury In Rats: Part I: Pathophysiology And Biomechanics. Journal Of Neurosurgery, 80, 291-300.

114-Marzi, M., Vigano, A., Trabattoni, D., Villa, M. L., Salvaggio, A., Clerici, E. & Clerici, M. 1996. Characterization Of Type 1 And Type 2 Cytokine Production Profile In Physiologic And Pathologic Human Pregnancy. Clin Exp Immunol, 106, 127-33.

115-Meffre, D., Pianos, A., Liere, P., Eychenne, B., Cambourg, A., Schumacher, M., Stein, D. & Guennoun, R. 2007. Steroid Profiling In Brain And Plasma Of Male And Pseudopregnant Female Rats After Traumatic Brain Injury: Analysis By Gas Chromatography/Mass Spectrometry. Endocrinology, 148, 2505-2517.

116-Meisel, C., Vogt, K., Platzer, C., Randow, F., Liebenthal, C. & Volk, H. D. 1996. Differential Regulation Of Monocytic Tumor Necrosis Factor-Alpha And Interleukin-10 Expression. Eur J Immunol, 26, 1580-6.

117-Mellergård, P., Åneman, O., Sjögren, F., Säberg, C. & Hillman, J. 2011. Differences In Cerebral Extracellular Response Of Interleukin-1β, Interleukin-6, And Interleukin-10 After Subarachnoid Hemorrhage Or Severe Head Trauma In Humans. Neurosurgery, 68, 12-19.

118-Miller, J. D., Becker, D. P., Ward, J. D., Sullivan, H. G., Adams, W. E. & Rosner, M. J. 1977. Significance Of Intracranial Hypertension In Severe Head Injury. Journal Of Neurosurgery, 47, 503-516.

119-Morganti-Kossman, M., Lenzlinger, P., Hans, V., Stahel, P., Csuka, E., Ammann, E., Stocker, R., Trentz, O. & Kossmann, T. 1997. Production Of Cytokines Following Brain Injury: Beneficial And Deleterious For The Damaged Tissue. Molecular Psychiatry, 2, 133-136.

120-Morganti-Kossmann, M. C., Satgunaseelan, L., Bye, N. & Kossmann, T. 2007a. Modulation Of Immune Response By Head Injury. Injury, 38, 1392-400.

121-Morganti-Kossmann, M. C., Satgunaseelan, L., Bye, N. & Kossmann, T. 2007b. Modulation Of Immune Response By Head Injury. Injury, 38, 1392-1400.

122-Mori, M., Tsukahara, F., Yoshioka, T., Irie, K. & Ohta, H. 2004. Suppression By 17beta-Estradiol Of Monocyte Adhesion To Vascular Endothelial Cells Is Mediated By Estrogen Receptors. Life Sci, 75, 599-609.

123-Muraoka, K.-I., Shimizu, K., Sun, X., Zhang, Y. K., Tani, T., Hashimoto, T., Yagi, M., Miyazaki, I. & Yamamoto, K.-I. 1997. Hypoxia, But Not Reoxygenation, Induces Interleukin 6 Gene Expression Through Nf-[Kappa] B Activation 1. Transplantation, 63, 466-470.

124-Murphy, S. J., Littleton-Kearney, M. T. & Hurn, P. D. 2002. Progesterone Administration During Reperfusion, But Not Preischemia Alone, Reduces Injury In Ovariectomized Rats. J Cereb Blood Flow Metab, 22, 1181-8.

125-Naka, T., Narazaki, M., Hirata, M., Matsumoto, T., Minamoto, S., Aono, A., Nishimoto, N., Kajita, T., Taga, T. & Yoshizaki, K. 1997. Structure And Function Of A New Stat-Induced Stat Inhibitor. Nature, 387, 924-929.

126-Nakagawa, R., Naka, T., Tsutsui, H., Fujimoto, M., Kimura, A., Abe, T., Seki, E., Sato, S., Takeuchi, O. & Takeda, K. 2002. Socs-1 Participates In Negative Regulation Of Lps Responses. Immunity, 17, 677-687.

127-Neumann-Haefelin, T., Kastrup, A., De Crespigny, A., Yenari, M., Ringer, T., Sun, G. & Moseley, M. 2000. Serial Mri After Transient Focal Cerebral Ischemia In Rats Dynamics Of Tissue Injury, Blood-Brain Barrier Damage, And Edema Formation. Stroke, 31, 1965-1973.

128-Nordell, V. L., Lewis, D. K., Bake, S. & Sohrabji, F. 2005. The Neurotrophin Receptor P75ntr Mediates Early Anti-Inflammatory Effects Of Estrogen In The Forebrain Of Young Adult Rats. Bmc Neuroscience, 6, 58.

129-Nordell, V. L., Scarborough, M. M., Buchanan, A. K. & Sohrabji, F. 2003. Differential Effects Of Estrogen In The Injured Forebrain Of Young Adult And Reproductive Senescent Animals. Neurobiology Of Aging, 24, 733-743.

130-O'connor, C. A., Cernak, I. & Vink, R. 2005. Both Estrogen And Progesterone Attenuate Edema Formation Following Diffuse Traumatic Brain Injury In Rats. Brain Research, 1062, 171-174.

131-O'donnell, M. E., Lam, T. I., Tran, L. Q., Foroutan, S. & Anderson, S. E. 2006. Estradiol Reduces Activity Of The Blood-Brain Barrier Na-K-Cl Cotransporter And Decreases Edema Formation In Permanent Middle Cerebral Artery Occlusion. Journal Of Cerebral Blood Flow & Metabolism, 26, 1234-1249.

132-O'lone, R., Frith, M. C., Karlsson, E. K. & Hansen, U. 2004. Genomic Targets Of Nuclear Estrogen Receptors. Molecular Endocrinology, 18, 1859-1875.

133-Obrenovitch, T. P. & Urenjak, J. 1997. Is High Extracellular Glutamate The Key To Excitotoxicity In Traumatic Brain Injury? Journal Of Neurotrauma, 14, 677-698.

134-Øren, A., White, L. R. & Aasly, J. 2001. Apoptosis In Neurones Exposed To Cerebrospinal Fluid From Patients With Multiple Sclerosis Or Acute Polyradiculoneuropathy. Journal Of The Neurological Sciences, 186, 31-36.

135-Pan, D. S., Liu, W. G., Yang, X. F. & Cao, F. 2007. Inhibitory Effect Of Progesterone On Inflammatory Factors After Experimental Traumatic Brain Injury. Biomed Environ Sci, 20, 432-8.

136-Pelligrino, D. A., Santizo, R., Baughman, V. L. & Wang, Q. 1998. Cerebral Vasodilating Capacity During Forebrain Ischemia: Effects Of Chronic Estrogen Depletion And Repletion And The Role Of Neuronal Nitric Oxide Synthase. Neuroreport, 9, 3285-3291.

137-Penkowa, M., Camats, J., Hadberg, H., Quintana, A., Rojas, S., Giralt, M., Molinero, A., Campbell, I. L. & Hidalgo, J. 2003. Astrocyte-Targeted Expression Of Interleukin‐6 Protects The Central Nervous System During Neuroglial Degeneration Induced By 6-Aminonicotinamide. Journal Of Neuroscience Research, 73, 481-496.

138-Perry, R. T., Collins, J. S., Wiener, H., Acton, R. & Go, R. C. 2001. The Role Of Tnf And Its Receptors In Alzheimer's Disease. Neurobiology Of Aging, 22, 873-883.

139-Petersen, S. L., Ottem, E. N. & Carpenter, C. D. 2003. Direct And Indirect Regulation Of Gonadotropin-Releasing Hormone Neurons By Estradiol. Biology Of Reproduction, 69, 1771-1778.

140-Pettus, E. H., Wright, D. W., Stein, D. G. & Hoffman, S. W. 2005. Progesterone Treatment Inhibits The Inflammatory Agents That Accompany Traumatic Brain Injury. Brain Research, 1049, 112-119.

141-Pinteaux, E., Trotter, P. & Simi, A. 2009. Cell-Specific And Concentration-Dependent Actions Of Interleukin-1 In Acute Brain Inflammation. Cytokine, 45, 1-7.

142-Planas, A., Gorina, R. & Chamorro, A. 2006. Signalling Pathways Mediating Inflammatory Responses In Brain Ischaemia. Biochemical Society Transactions, 34, 1267-1270.

143-Prewitt, A. K. & Wilson, M. E. 2007. Changes In Estrogen Receptor-Alpha Mrna In The Mouse Cortex During Development. Brain Research, 1134, 62-69.

144-Qasimi, P., Ming-Lum, A., Ghanipour, A., Ong, C. J., Cox, M. E., Ihle, J., Cacalano, N., Yoshimura, A. & Mui, A. L. 2006. Divergent Mechanisms Utilized By Socs3 To Mediate Interleukin-10 Inhibition Of Tumor Necrosis Factor Alpha And Nitric Oxide Production By Macrophages. J Biol Chem, 281, 6316-24.
145-Qin, H., Roberts, K. L., Niyongere, S. A., Cong, Y., Elson, C. O. & Benveniste, E. N. 2007. Molecular Mechanism Of Lipopolysaccharide-Induced Socs-3 Gene Expression In Macrophages And Microglia. The Journal Of Immunology, 179, 5966-5976.

146-Raghavendra Rao, V. L., Bowen, K. K., Dhodda, V. K., Song, G., Franklin, J. L., Gavva, N. R. & Dempsey, R. J. 2002. Gene Expression Analysis Of Spontaneously Hypertensive Rat Cerebral Cortex Following Transient Focal Cerebral Ischemia. Journal Of Neurochemistry, 83, 1072-1086.

147-Ralston, S. H., Russell, R. G. & Gowen, M. 1990. Estrogen Inhibits Release Of Tumor Necrosis Factor From Peripheral Blood Mononuclear Cells In Postmenopausal Women. J Bone Miner Res, 5, 983-8.

148-Ramilo, O., Saez-Llorens, X., Mertsola, J., Jafari, H., Olsen, K. D., Hansen, E. J., Yoshinaga, M., Ohkawara, S., Nariuchi, H. & Mccracken, G. H. 1990. Tumor Necrosis Factor Alpha/Cachectin And Interleukin 1 Beta Initiate Meningeal Inflammation. The Journal Of Experimental Medicine, 172, 497.

149-Reilly, P. 2007. The Impact Of Neurotrauma On Society: An International Perspective. Progress In Brain Research, 161, 3-9.

150-Roof, R. L. & Hall, E. D. 2000. Estrogen-Related Gender Difference In Survival Rate And Cortical Blood Flow After Impact-Acceleration Head Injury In Rats. Journal Of Neurotrauma, 17, 1155-1169.

151-Roquer, J., Campello, A. R. & Gomis, M. 2003. Sex Differences In First-Ever Acute Stroke. Stroke, 34, 1581-1585.

152-Rosenbaum, D., Zabramski, J., Frey, J., Yatsu, F., Marler, J., Spetzler, R. & Grotta, J. 1991. Early Treatment Of Ischemic Stroke With A Calcium Antagonist. Stroke, 22, 437-441.

153-Samy, T. A., Ayala, A., Catania, R. A. & Chaudry, I. H. 1998. Trauma-Hemorrhage Activates Signal Transduction Pathways In Mouse Splenic T Cells. Shock, 9, 443-450.

154-Sarkaki, A. R., Khaksari Haddad, M., Soltani, Z., Shahrokhi, N. & Mahmoodi, M. 2013. Time-And Dose-Dependent Neuroprotective Effects Of Sex Steroid Hormones On Inflammatory Cytokines After A Traumatic Brain Injury. Journal Of Neurotrauma, 30, 47-54.

155-Selladurai, B. M. & Reilly, P. 2007. Initial Management Of Head Injuries: A Comprehensive Guide, Mcgraw Hill.

156-Shahrokhi, N., Khaksari, M., Soltani, Z., Mahmoodi, M. & Nakhaee, N. 2010. Effect Of Sex Steroid Hormones On Brain Edema, Intracranial Pressure, And Neurologic Outcomes After Traumatic Brain Injury. Canadian Journal Of Physiology And Pharmacology, 88, 414-421.

157-Sharma, S., Yang, B., Xi, X., Grotta, J. C., Aronowski, J. & Savitz, S. I. 2011. Il-10 Directly Protects Cortical Neurons By Activating Pi-3 Kinase And Stat-3 Pathways. Brain Res, 1373, 189-94.

158-Shein, N. A. A., Doron, H., Horowitz, M., Trembovler, V., Alexandrovich, A. G. & Shohami, E. 2007. Altered Cytokine Expression And Sustained Hypothermia Following Traumatic Brain Injury In Heat Acclimated Mice. Brain Research, 1185, 313-320.

159-Shih, H. C., Lin, C. L., Lee, T. Y., Lee, W. S. & Hsu, C. 2006. 17beta-Estradiol Inhibits Subarachnoid Hemorrhage-Induced Inducible Nitric Oxide Synthase Gene Expression By Interfering With The Nuclear Factor Kappa B Transactivation. Stroke, 37, 3025-31.

160-Shlosberg, D., Benifla, M., Kaufer, D. & Friedman, A. 2010. Blood-Brain Barrier Breakdown As A Therapeutic Target In Traumatic Brain Injury. Nature Reviews Neurology, 6, 393-403.

161-Simi, A., Tsakiri, N., Wang, P. & Rothwell, N. 2007a. Interleukin-1 And Inflammatory Neurodegeneration. Biochemical Society Transactions, 35, 1122-1126.

162-Simi, A., Tsakiri, N., Wang, P. & Rothwell, N. J. 2007b. Interleukin-1 And Inflammatory Neurodegeneration. Biochemical Society Transactions, 35, 1122.

163-Simoncini, T., Maffei, S., Basta, G., Barsacchi, G., Genazzani, A. R., Liao, J. K. & De Caterina, R. 2000. Estrogens And Glucocorticoids Inhibit Endothelial Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Expression By Different Transcriptional Mechanisms. Circulation Research, 87, 19-25.

164-Solaroglu, I., Solaroglu, A., Kaptanoglu, E., Dede, S., Haberal, A., Beskonakli, E. & Kilinc, K. 2003. Erythropoietin Prevents Ischemia-Reperfusion From Inducing Oxidative Damage In Fetal Rat Brain. Child's Nervous System, 19, 19-22.

165-Soltani, Z., Khasksari, M., Shahrokhi, N., Nakhaei, N. & Shaibani, V. 2009. Effect Of Combined Administration Of Estrogen And Progesterone On Brain Edema And Neurological Outcome After Traumatic Brain Injury In Female Rats. Iranian Journal Of Endocrinology And Metabolism, 10, 629-638.

166-Starr, R., Willson, T. A., Viney, E. M., Murray, L., Rayner, J. R., Jenkins, B. J., Gonda, T. J., Alexander, W. S., Metcalf, D. & Nicola, N. A. 1997. A Family Of Cytokine-Inducible Inhibitors Of Signalling. Nature, 387, 917-921.

167-Stein, B. & Yang, M. X. 1995. Repression Of The Interleukin-6 Promoter By Estrogen Receptor Is Mediated By Nf-Kappa B And C/Ebp Beta. Mol Cell Biol, 15, 4971-9.

168-Stein, D. G. 2001. Brain Damage, Sex Hormones And Recovery: A New Role For Progesterone And Estrogen? Trends Neurosci, 24, 386-91.

169-Stein, D. G., Wright, D. W. & Kellermann, A. L. 2008. Does Progesterone Have Neuroprotective Properties? Annals Of Emergency Medicine, 51, 164-172.

170-Steyn, F. J., Anderson, G. M. & Grattan, D. R. 2008. Hormonal Regulation Of Suppressors Of Cytokine Signaling (Socs) Messenger Ribonucleic Acid In The Arcuate Nucleus During Late Pregnancy. Endocrinology, 149, 3206-3214.

171-Stice, J. P. & Knowlton, A. A. 2008. Estrogen, Nfκb, And The Heat Shock Response. Molecular Medicine, 14, 517.

172-Stiefel, M. F., Udoetuk, J. D., Spiotta, A. M., Gracias, V. H., Goldberg, A., Maloney-Wilensky, E., Bloom, S. & Le Roux, P. D. 2006. Conventional Neurocritical Care And Cerebral Oxygenation After Traumatic Brain Injury. Journal Of Neurosurgery, 105, 568-575.

173-Stirone, C., Duckles, S. P. & Krause, D. N. 2003. Multiple Forms Of Estrogen Receptor-Α In Cerebral Blood Vessels: Regulation By Estrogen. American Journal Of Physiology-Endocrinology And Metabolism, 284, E184-E192.

174-Sunday, L., Tran, M. M., Krause, D. N. & Duckles, S. P. 2006. Estrogen And Progestagens Differentially Modulate Vascular Proinflammatory Factors. Am J Physiol Endocrinol Metab, 291, E261-7.

175-Suzuki, S., Brown, C. M. & Wise, P. M. 2009. Neuroprotective Effects Of Estrogens Following Ischemic Stroke. Frontiers In Neuroendocrinology, 30, 201-211.

176-Suzuki, S., Tanaka, K. & Suzuki, N. 2008. Ambivalent Aspects Of Interleukin-6 In Cerebral Ischemia: Inflammatory Versus Neurotrophic Aspects. Journal Of Cerebral Blood Flow & Metabolism, 29, 464-479.

177-Szymczak, S., Kalita, K., Jaworski, J., Mioduszewska, B., Savonenko, A., Markowska, A., Merchenthaler, I. & Kaczmarek, L. 2006. Increased Estrogen Receptor Β Expression Correlates With Decreased Spine Formation In The Rat Hippocampus. Hippocampus, 16, 453-463.

178-Thurman, D. J., Alverson, C., Dunn, K. A., Guerrero, J. & Sniezek, J. E. 1999. Traumatic Brain Injury In The United States: A Public Health Perspective. The Journal Of Head Trauma Rehabilitation, 14, 602-615.

179-Tiwari-Woodruff, S., Morales, L. B. J., Lee, R. & Voskuhl, R. R. 2007. Differential Neuroprotective And Antiinflammatory Effects Of Estrogen Receptor (Er) Α And Erβ Ligand Treatment. Proceedings Of The National Academy Of Sciences, 104, 14813-14818.

180-Unterberg, A., Stover, J., Kress, B. & Kiening, K. 2004. Edema And Brain Trauma. Neuroscience, 129, 1019-1027.

181-Vanlandingham, J. W., Cutler, S. M., Virmani, S., Hoffman, S. W., Covey, D. F., Krishnan, K., Hammes, S. R., Jamnongjit, M. & Stein, D. G. 2006. The Enantiomer Of Progesterone Acts As A Molecular Neuroprotectant After Traumatic Brain Injury. Neuropharmacology, 51, 1078-1085.

182-Vecil, G. G., Larsen, P. H., Corley, S. M., Herx, L. M., Besson, A., Goodyer, C. G. & Yong, V. W. 2000. Interleukin-1 Is A Key Regulator Of Matrix Metalloproteinase‐9 Expression In Human Neurons In Culture And Following Mouse Brain Trauma In Vivo. Journal Of Neuroscience Research, 61, 212-224.

183-Vedder, H., Anthes, N., Stumm, G., Würz, C., Behl, C. & Krieg, J. C. 1999. Estrogen Hormones Reduce Lipid Peroxidation In Cells And Tissues Of The Central Nervous System. Journal Of Neurochemistry, 72, 2531-2538.

184-Vegeto, E., Belcredito, S., Etteri, S., Ghisletti, S., Brusadelli, A., Meda, C., Krust, A., Dupont, S., Ciana, P., Chambon, P. & Maggi, A. 2003. Estrogen Receptor-Alpha Mediates The Brain Antiinflammatory Activity Of Estradiol. Proc Natl Acad Sci U S A, 100, 9614-9.

185-Veiga, S., Azcoitia, I. & Garcia-Segura, L. M. 2005. Extragonadal Synthesis Of Estradiol Is Protective Against Kainic Acid Excitotoxic Damage To The Hippocampus. Neuroreport, 16, 1599-1603.

186-Verkman, A. S., Binder, D. K., Bloch, O., Auguste, K. & Papadopoulos, M. C. 2006. Three Distinct Roles Of Aquaporin-4 In Brain Function Revealed By Knockout Mice. Biochimica Et Biophysica Acta (Bba)-Biomembranes, 1758, 1085-1093.

187-Vilatoba, M., Eckstein, C., Bilbao, G., Frennete, L., Eckhoff, D. E. & Contreras, J. L. 2005. 17beta-Estradiol Differentially Activates Mitogen-Activated Protein-Kinases And Improves Survival Following Reperfusion Injury Of Reduced-Size Liver In Mice. Transplant Proc, 37, 399-403.

188-Vink, R. & Van Den Heuvel, C. 2004. Recent Advances In The Development Of Multifactorial Therapies For The Treatment Of Traumatic Brain Injury. Expert Opinion On Investigational Drugs, 13, 1263-1274.

189-Vink, R., Young, A., Bennett, C., Hu, X., Connor, C., Cernak, I. & Nimmo, A. J. 2003. Neuropeptide Release Influences Brain Edema Formation After Diffuse Traumatic Brain Injury. Brain Edema Xii. Springer.
190-Wahl, S. M. 2007. Transforming Growth Factor-Beta: Innately Bipolar. Curr Opin Immunol, 19, 55-62.

191-Wang, J. & Campbell, I. L. 2002. Cytokine Signaling In The Brain: Putting A Socs In It? Journal Of Neuroscience Research, 67, 423-427.

192-Wang, K. K., Larner, S. F., Robinson, G. & Hayes, R. L. 2006. Neuroprotection Targets After Traumatic Brain Injury. Current Opinion In Neurology, 19, 514-519.

193-Wang, L., Zhang, X., Farrar, W. L. & Yang, X. 2004. Transcriptional Crosstalk Between Nuclear Receptors And Cytokine Signal Transduction Pathways In Immunity. Cell Mol Immunol, 1, 416-24.

194-Wang, M., Wang, Y., Abarbanell, A., Tan, J., Weil, B., Herrmann, J. & Meldrum, D. R. 2009a. Both Endogenous And Exogenous Testosterone Decrease Myocardial Stat3 Activation And Socs3 Expression After Acute Ischemia And Reperfusion. Surgery, 146, 138-144.

195-Wang, M., Wang, Y., Weil, B., Abarbanell, A., Herrmann, J., Tan, J., Kelly, M. & Meldrum, D. R. 2009b. Estrogen Receptor Β Mediates Increased Activation Of Pi3k/Akt Signaling And Improved Myocardial Function In Female Hearts Following Acute Ischemia. American Journal Of Physiology-Regulatory, Integrative And Comparative Physiology, 296, R972-R978.

196-Wang, M., Zhang, W., Crisostomo, P., Markel, T., Meldrum, K. K., Fu, X. Y. & Meldrum, D. R. 2007. Endothelial Stat3 Plays A Critical Role In Generalized Myocardial Proinflammatory And Proapoptotic Signaling. American Journal Of Physiology-Heart And Circulatory Physiology, 293, H2101-H2108.

197-Wang, T. & Secombes, C. J. 2008. Rainbow Trout Suppressor Of Cytokine Signalling (Socs)-1, 2 And 3: Molecular Identification, Expression And Modulation. Molecular Immunology, 45, 1449-1457.

198-Welte, T., Zhang, S. S., Wang, T., Zhang, Z., Hesslein, D. G., Yin, Z., Kano, A., Iwamoto, Y., Li, E. & Craft, J. E. 2003. Stat3 Deletion During Hematopoiesis Causes Crohn's Disease-Like Pathogenesis And Lethality: A Critical Role Of Stat3 In Innate Immunity. Proceedings Of The National Academy Of Sciences, 100, 1879-1884.

199-Wen, Y., Yang, S., Liu, R., Perez, E., Yi, K. D., Koulen, P. & Simpkins, J. W. 2004. Estrogen Attenuates Nuclear Factor-Kappa B Activation Induced By Transient Cerebral Ischemia. Brain Research, 1008, 147-154.

200-Werner, C. & Engelhard, K. 2007. Pathophysiology Of Traumatic Brain Injury. British Journal Of Anaesthesia, 99, 4-9.
201-Wise, P. M., Dubal, D. B., Rau, S. W., Brown, C. M. & Suzuki, S. 2005. Are Estrogens Protective Or Risk Factors In Brain Injury And Neurodegeneration? Reevaluation After The Women's Health Initiative. Endocrine Reviews, 26, 308-312.

202-Wise, P. M., Dubal, D. B., Wilson, M. E., Rau, S. W. & BöTtner, M. 2001. Minireview: Neuroprotective Effects Of Estrogen-New Insights Into Mechanisms Of Action. Endocrinology, 142, 969-973.

203-Wise, P. M., Suzuki, S. & Brown, C. M. 2009. Estradiol: A Hormone With Diverse And Contradictory Neuroprotective Actions. Dialogues In Clinical Neuroscience, 11, 297.

204-Wright, D. W., Kellermann, A. L., Hertzberg, V. S., Clark, P. L., Frankel, M., Goldstein, F. C., Salomone, J. P., Dent, L. L., Harris, O. A. & Ander, D. S. 2007. Protect: A Randomized Clinical Trial Of Progesterone For Acute Traumatic Brain Injury. Annals Of Emergency Medicine, 49, 391-402. E2.

205-Xu, Y., Zhang, W., Klaus, J., Young, J., Koerner, I., Sheldahl, L. C., Hurn, P. D., Martinez-Murillo, F. & Alkayed, N. J. 2006. Role Of Cocaine- And Amphetamine-Regulated Transcript In Estradiol-Mediated Neuroprotection. Proc Natl Acad Sci U S A, 103, 14489-94.

206-Yamamoto, T., Matsuda, T., Junicho, A., Kishi, H., Saatcioglu, F. & Muraguchi, A. 2000. Cross-Talk Between Signal Transducer And Activator Of Transcription 3 And Estrogen Receptor Signaling. Febs Letters, 486, 143-148.

207-Yang, M. S., Min, K. J. & Joe, E. 2007. Multiple Mechanisms That Prevent Excessive Brain Inflammation. Journal Of Neuroscience Research, 85, 2298-2305.
208-Yang, S., Choudhry, M. A., Hsieh, Y.-C., Hu, S., Rue Iii, L. W., Bland, K. I. & Chaudry, I. H. 2006. Estrus Cycle: Influence On Cardiac Function Following Trauma-Hemorrhage. American Journal Of Physiology-Heart And Circulatory Physiology, 291, H2807-H2815.

209-Yao, Y. M., Redl, H., Bahrami, S. & Schlag, G. 1998. The Inflammatory Basis Of Trauma/Shock-Associated Multiple Organ Failure. Inflamm Res, 47, 201-10.

210-Zhang, X., Chen, Y., Jenkins, L. W., Kochanek, P. M. & Clark, R. S. 2005. Bench-To-Bedside Review: Apoptosis/Programmed Cell Death Triggered By Traumatic Brain Injury. Crit Care, 9, 66-75.

211-Zhang, Y.-Q., Shi, J., Rajakumar, G., Day, A. L. & Simpkins, J. W. 1998. Effects Of Gender And Estradiol Treatment On Focal Brain Ischemia. Brain Research, 784, 321-324.

212-Zhu, Y., Yang, G.-Y., Ahlemeyer, B., Pang, L., Che, X.-M., Culmsee, C., Klumpp, S. & Krieglstein, J. 2002. Transforming Growth Factor-Β1 Increases Bad Phosphorylation And Protects Neurons Against Damage. The Journal Of Neuroscience, 22, 3898-3909.
213-Ziebell, J. M. & Morganti-Kossmann, M. C. 2010. Involvement Of Pro-And Anti-Inflammatory Cytokines And Chemokines In The Pathophysiology Of Traumatic Brain Injury. Neurotherapeutics, 7, 22-30.

214-اقتصاد, خ. 1387. سرویس اقتصاد حمل و نقل خبرگزاری اقتصاد ایران.
215-پیری, ظ. ع. 1383. نگرش پزشکان و پرستاران بخش مراقبت های ویژه بیمارستان های دانشگاه علوم پزشکی ایران نسبت به اهدای عضو در مرگ مغزی در سال 1382. مجله دانشگاه علوم پزشکی ایران, 39, 106-97.

1 Traumatic Brain Injury
2 Intracranial injury
3 Blood Brain Barrier
4 Edema
5 Vasogenic edema
6 Cytotoxic edema
7 Intracranial Pressure
8 Cerebral Perfusion Pressure
9 Vasodilation
10 Interleukin
11 Tumour Necrosis Factor-α
12 Interferon
13 Transforming Growth Factor-β
14 Neuroprotection
15 Interleukin-1 receptor antagonist
16 Signal Ttransducer and Activator of Ttranscription-3
17 Suppressor Of Cytokine Signaling-3
18 Janus Kinase/Signal Transducer and Activator of Transcription
19 Lipopolysaccharide
20 Neuclear Factor kappa B
21 Inhibitory-κB factor
22 Signaling
23 Inhibitory κB Kinase α
24 Intreraction
25 c-Jun N-terminal Kinase
26 P38 MAP Kinase
27 Mitogen-Activated Protein Kinase
28 Estrogen Response Elements
29 Traumatic Brain Injury
30 Glasgow Coma Scale
31 Mild
32 Moderate
33 Severe
34 Local
35 Diffuse
36 Primary
37 Secondary
38 Diffuse Axonal Injury
39 Cerebral Blood Flow
40Traumatic axonal injuiy
41 Central Nervous System
42 Vasoparalysis
43 Oxidative stress
44 Reactive Oxygen Species
45 Blood Brain Barrier
46 Intra Cranial Pressure
47 Autolysis
48 Exocitotoxicity
49 Endocrine
50 Autocrine
51 Paracrine
52 N-Methyl-D-Aspartate
53 Plasticity
54c-Jun N-terminal Kinase
55 Signal Transducers and Activators Transcription-3
56 Suppressor of Cytokine Signaling-3
57 Protein Inhibitor of Activated STAT
58 Cytokine-Induced SH2 Protein
59 Interferon-ϒ
60 Hematopoesis
61 Intracellular Adhesion Molecule-1
62 Interferon-gamma-inducible Protein-10
63 Macrophage Chemoattractant Protein-1
64 Lipopolysaccharide
65 Neuclear Factor kappa B
66 Inhibitory-κB factor
67 Motif
68 IκB Kinase α
69 Proestrus
70 Metestrus
71 Global ischemia
72 Estrogen Receptores
73 Estrogen Response Elements
74 G Protein-Coupled Receptor-30
75 Extracellular Signal-Regulated Kinases
76 Protein Kinase G
77 phosphatidylinositol 3-kinase (PI3 kinase)/Akt
78 B-cell lymphoma 2

79 Cocaine & Amphetamine Regulated-Transcript
80 Plasticity
81 Inducible Nitric Oxide Synthase
82 Middle Cerebral Artery Occlusion
83 Remyelination
84 Caspase-3
85 Gamma-Amino Butyric Acid
86 Brain Water Content
87 Ovariectomy
88 Vehicle
89 Intubation
90 Immunohistochemistry
91 Tissue processor
92 Microtom
93 Tissue bath
94 Primary antibody
95 Secondary antibody
96 Xylene
97 Xylofluid
98 Diaminobenzidine
99 Bilateral Ovariectomy
100 Intubation
101 Moderate brain injury
102Brain Water Content
103 Hematoxilin & Eosine
104 Fixation
105 Blocking
106 Transverse section
107 Basket
108 Code
109 Blind
110 Plate
111 Immunocytochemistry
112 Retrieval
113 Labeling
114 setting
115 Incubate
116 1CC
117 Mounting
118 Permanent
119 Congestion
120 Edema stroma
121 Neuron degeneration
122 Neuron apoptosis
123 Gliosis
124 Histopathology
125 Signaling
126 Inhibitor-κB
127 Aquaporin
128 Matrix metalloproteinases
129 Cyclo-Oxygenase
130 Lipopolysaccaharide
131 Infarct volume
132 Infarct size
133 Dimorphism
134 Protein inhibitors of activated STATs
135 Genistein
136 Phitoestrogen
137 Granulocyte Colony Stimulating Factor
138 B-cell lymphoma 2

139 Rheumatoid arthritis
140 Proestrus
141 Metestrus
142 Diestrus
143 Estrus
144 Medial Frontal Cortex
145 Plasticity
146 Pool
147 Inducible Nitric Oxide Synthase
—————

————————————————————

—————

————————————————————

ا