فعالیت های بیوشیمی میکروارگانیسم ها
اهداف
این بخش برای اموزش موارد زیر طراحی شده است :
1- ماهیت و فعالیت های برون آنزیم ها و درون آنزیم ها
2- فرآیندهای آزمایشی برای تمایزمیکروارگانیسم های روده ای
3- روندهای آزمون بیوشیمی برای تمایز میکروارگانیسم ها
مقدمه
میکروارگانیسم ها باید به دلایل مختلفی جداسازی و تعیین شوند ، از جمله :
1- تعیین پاتوژن های مسئول بیماری های عفونی .
2- انتخاب و جداسازی نژادهای میکروارگانیسم های تخمیری ضروری برای تولید صنعتی الکل ها ، حلال ها ، ویتامین ها ، اسید های ارگانیک ، آنتی بیوتیک ها و آنزیم های صنعتی.
3- جداسازی و توسعه نژادهای میکروبی مناسب ضروری برای تولید و افزایش کیفیت و طعم مواد غذایی خاص از جمله ماست ، پنیر و محصولات لبنی دیگر .
4- مقایسه فعالیت های بیوشیمی برای اهداف طبقه بندی .
برای انجام این کارها ، میکروبیولوژیست ها از این حقیقت حمایت کردند که ، مانند انسانها که دارای ویژگی ها و اثر انگشت های خاص هستند ، میکروارگانیسم ها همگی ویژگی های بیوشیمی مشخص خودشان را دارند . این اثر انگشت های بیوشیمی نامبرده شده ویژگی های کنترل شده توسط فعالیت آنزیمی سلول ها می باشد ، و آنها مسئول بیوانرژی ، بیوسنتز و تجزیه بیولوژیکی هستند .
مجموع کل این واکنش های شیمیایی به عنوان متابولیسم سلولی مشخص می شود ، و تغییر شکل بیوشیمی که در بیرون و داخل سلول اتفاق می افتد توسط کاتالیزور های بیولوژیکی به نام آنزیم ها کنترل می شود .
آنزیم های خارج سلولی ( برون آنزیم ها )
اینها در مواد خارج از سلول فعالیت می کنند .اکثر مواد مولکولی با وزن بالا (سنگین ) قادر به عبور از غشاهای سلولی نیستند و بنابراین این مواد خام – مواد غذایی مانند پلی ساکارید ها ، لیپید ها و پروتئین ها – باید به مواد مولکولی سبک ( کم وزن )- مواد مغذی – تنزل یابند قبل از آنکه به درون سلول منتقل شوند . به دلیل واکنش های موجود ، برون آنزیم ها عمدتاً آنزیم های آبکافتی (هیدرولیزی)هستند که مواد مولکولی سنگین را به بلوک های ساختاری شان با وارد کردن آب به درون مولکول کاهش می یابند . این مولکول های آزاد کوچکتر ، سپس به درون سلول منتقل و جذب می شوند .
آنزیم های درون سلولی (درون آنزیم ها )
این آنزیم ها درون سلول فعالیت می کنند و عمدتاً مسئول سنتز پروتوپلاسمی و تولید انرژی سلولی از مواد جذب شده هستند . توانایی سلول ها برای فعالیت بر مواد غذایی نفوذ کننده غشاهای سلولی وجود درون آنزیم های قادر به انتقال مواد خاص شیمیایی درون مواد ضروری را نشان می دهد .
این انتقال برای عملکرد و زنده ماندن سلولی ضروری است ، و اساس متابولیسم سلولی است . در نتیجه ی این روند های متابولیک ، محصولات متابولیک تشکیل می شوند و توسط سلول درون محیط دفع می شود . ارزیابی این محصولات نه تنها به تعیین سیستم های آنزیمی خاص کمک می کند و همچنین برای تعیین ، جداسازی و طبقه بندی میکروارگانیسم ها به کار می رود . نمودار v01 طرح خلاصه شده روندهای آزمایشی را نشان می دهد که برای آگاه کردن دانشجویان با فعالیت های آنزیمی درون سلولی و خارج سلولی میکروارگانیسم ها به کار رفته است .
نمودار v.1 فعالیت های بیوشیمیایی میکروارگانیسم ها
آنزیم های خارج سلولی ( هیدرولیز نشاسته – هیدرولیز لیپید – هییدرولیز کازئین – هیدرولیز ژلاتین ).
آنزیم های درون سلولی (تخمیر کربوهیدرات – واکنش های تورنسل شیر – تولید سولفید هیدروژن – کاهش نیترات – واکنش های کاتالاز – تست اوره آز – تست اکسیداز )
تست IMViC ( ایندول – متیل قرمز – ووگس – پروسکوئر – مصرف سیترات ) ——-( آزمون های خاص برای جداسازی میکروارگانیسم های رو ده ای)————-(تست آهن – شکر سه گانه )
آزمایشاتی که در این بخش انجام خواهد شد می تواند به دو روش انجام شود . نوع کوتاه از تعداد محدود ارگانیسم ها برای نشان دادن محصول نهایی استفاده می کند که ناشی از فعالیت آنزیم در یک ماده اولیه است . ارگانیسم ها برای این نوع در تمرینات فردی طراحی شدند .
نوع طولانی یا متغیر شامل کاربرد 13 میکروارگانیسم است . این نوع یک بازنگری کامل از اثر انگشت های بیوشیمیایی ارگانیسم ها را ایجاد می کند و فرمتی برای جداسازی و شناسایی آن را فراهم می کند . این ارگانیسم ها برای به کار گیری به عنوان اساسی برای شناسایی میکروارگانیسم های شناخته نشده در آزمایش 3.1 انتخاب می شود . این نوع متغیر انتخاب شده است ، میکروارگانیسم های زیر برای مصرف پیشنها د شده اند :
اشرشیا کولی – آنتروباکتر گاز ساز – کلبسیلا پنومونی – شیگلا دیسنتریا – سالمونلا تیفوموریوم – پروتئوس وولگاریس – سدوموناس ائروگینوس – آلکالیژن فاسالیس – میکروکوک لتوس-استرپتوکوک لاکتیس – استافیلوکوک اورئوس – باسیلوس سرئوس – کورینباکتریم زروسیس
فعالیت های آنزیمی خارج سلولی میکروارگانیسم ها
هدف
تعیین توانایی میکروارگانیسم ها برای دفع آنزیم های خارج سلولی هیدرولیتیک از کاهش نشاسته پلی ساکارید ، تریبوترین لیپید و پروتئین های کازئین و ژلاتین .
قاعده کلی
به دلیل اندازه بزرگشان ، مواد غذایی مولکولی سنگین مانند پلی ساکارید ها ، لیپید ها و پروتئین ها قادر به نفوذ در غشای سلولی نیستند . این ماکرومولکول ها باید در ابتدا توسط آنزیم های خارج سلولی خاص درون بلوک های ساختاری شان هیدرولیز می شود . این مواد مولکولی سبک می تواند سپس به درون سلول منتقل می شود و برای سنتز پروتوپلاسمی و تولید انرژی استفاده می شود . فرآیندهای زیر برای بررسی فعالیت های برون آنزیمی میکروارگانیسم های مختلف طراحی شده است .
هیدرولیز نشاسته
نشاسته یک پلیمر با وزن مولکولی زیاد است که متشکل از مولکول های گلوکز متصل به پیوند های گلیکوزیدی است . کاهش این ماکرومولکول وجود آمیلاز آنزیم خارج سلولی را برای هیدرولیز درون پلی ساکارید های کوتاهتر به نام دکسترین ها و عمدتاً درون مولکول های مالتوز فراهم کرد . هیدرولیز نهایی این دی ساکارید ،که توسط مالتاز کاتالیز می شود ، مولکول های گلوکز حل شدنی ،با وزن مولکولی کم که می تواند درون سلول منتقل شود برای تولید انرژی از طریق روند گلیکولیز مصرف می شود . در این روند آزمایشی ، آگار نشاسته برای تعیین فعالیت های هیدرولیتیک این برون آنزیم ها استفاده می شود . این محیط متشکل از آگار مواد مغذی مکمل یافته با نشاسته است که به عنوان ماده اولیه پلی ساکارید به کار می رود . شناسایی فعالیت هیدرولیتیک دوره رشد با انجام تست نشاسته برای تعیین وجود یا عدم نشاسته در محیط انجام می شود . نشاسته در وجود ید از رنگ آبی – سیاه برای محیط بهره مند می شود ، که نشاندهنده ی عدم آنزیم های تقسیم نشاسته است و ارائه دهنده ی نتایج منفی است . اگر نشاسته هیدرولیز شود ، منطقه آشکار هیدرولیز رشد ارگانیسم را احاطه می کند . این یک نتیجه مثبت است .
هیدرولیز لیپید
لیپید ها ترکیباتی با وزن مولکولی با هستند که دارای مقادیر زیادی انرژی هستند . تجزیه لیپید ها از جمله گلیسرید ها با آنزیم های آبکافتی خارج سلولی انجام می گیرد که لیپاز(استراز) نام دارد که پیوندهای استر را این مولکول با افزودن آب تقسیم می شود و بلوک های ساختاری گلیسرین (یک الکل ) و اسید های چرب را تشکیل می دهد . نمودار 2101 این واکنش را نشان می دهد . هنگامی که درون سلول شبیه سازی می شود ، این بخش های اولیه از طریق تنفس هوازی برای تولید انرژی سلولی ، آدنوزین تری فسفات می تواند بیشتر از طریق متابولیز دگرگون شود . این بخش ها همچنین برای سنتز دیگر سلول های پرتوپلاسمی وارد مجراهای متابولیک می شوند .در این روند آزمایشی ، آگار تریبوترین برای نشان دادن فعالیت های هیدرولیتیک لیپاز برون آنزیم ها به کار رفت .محیط کشت متشکل از آگار مواد مغذی مکمل با تریبوترین تری گلیسیرید به عنوان ماده اولیه لیپید می باشد . تریبوترین یک امولسیون تشیکل می دهد وقتی که در آگار پراکنده می شود ؛ یک محیط ناشفاف ایجاد می کند که برای مشاهده فعالیت برون آنزیمی ضروری است . تلقیح و دوره نهفتگی محیط کشت پلیت آگار دفع کننده لیپاز ناحیه لیپولیز را نشان می دهد ، که با منطقه شفاف پیرامون رشد باکتریایی نشان داده می شود . این عدم شفافیت نتیجه واکنش هیدرولیتیک حاصل از گلیسرول حل شدنی و اسید های چرب است ، و نشان دهنده ی واکنش مثبت برای هیدرولیز لیپید است . در غیاب آنزیم های لیپولیتیک ، محیط کشت شفافیت خود را حفظ می کند . این یک واکنش منفی است .
هیدرولیز کازئین
کازئین ، پروتئین اصلی شیر ، یک ماکرومولکول متشکل از زیر واحد های آمینو اسید است که توسط پیوندهای پپتیدی به هم متصل اند(CO-NH ) . قبل از شبیه سازی آنها درون سلول ، پروتئین ها باید مرحله به مرحله درون پپتون ها ، پلی پپتید ها ، دی پپتید ها و درون بلوک های ساختاری شان و آمینو اسید ها تجزیه ششوند . این روند تبدیل شدن به پپتین یا پروتولئیز نام دارد ، و توسط آنزیم های خارج سلولی به نام پروتئاز ها میانجی گری می کند . عملکرد این پروتئاز ها تقسیم پیوند پپتید CO-NH با وارد کردن آب به درون مولکول است . این واکنش سپس آمینو اسید ها را آزاد کرد ، همانگونه که در نمودار 2102 نشان داده شده است .
آمینو اسید های حل شدنی ، با وزن مولکولی کم ، از طریق غشای سلولی درون منبع آمینو اسید برای مصرف در سنتز ساختاری و عملکردی پروتئن های سلولی منتقل می شود . دراین روند آزمایشی ، آگار شیر برای نشان دادن فعالیت هیدرولیتیک این برون آنزیم ها استفاده شد . این محیط کشت متشکل از آگار مواد مغذی مکمل با شیر است که حاوی کازئین مواد اولیه پروتئین است . مانند پروتئین های دیگر ، پروتئین شیر تعلیق کلوئیدی است که محیط کشت شفافیت و رنگش را نشان می دهد ، زیرا اشعه های نور را نسبت به انتقال دهنده های آنها منحرف می کند . ( می شکند ) . تلقیح و دوره نهفتگی محیط کشت پلیت آگار ، ارگانیسم های ترشح کننده پروتئاز ها ، منطقه پروتئولیز را نشان می دهد ، که توسط مناطق شفاف پیرامون رشد باکتریایی نشان داده می شود . این فقدان شفافیت ناشی از واکنش هیدرولیتیکی حاصل از آمینو اسید های غیر کلوئیدی ، حل شدنی است و واکنش مثبت را نشان می دهد . در غیاب فعالیت پروتئاز ، محیط کشت پیرامون رشد ارگانیسم تیره و ناشفاف باقی می ماند که یک واکنش منفی است .
هیدرولیز ژلاتین
اگرچه ارزش ژلاتین به عنوان یک منبع غذایی سوال بر انگیز است ( یک پروتئین ناکامل است ، فاقد تریپتوفان آمینو اسید ضروری ) ، ارزش آن در تعیین گونه های باکتریایی به خوبی شناخته شده است . ژلاتین پروتئین تولید شده توسط هیدرولیز کلاژن است ، یک بخش اصلی از بافت ها و تاندون های پیوندی در انسان ها و جانداران دیگر . زیر دمای 25 درجه سانتیگراد ، ژلاتین ویژگی های ژلی آن را حفظ می کند و به صورت جامد وجود دارد ؛ در دمای بیش از 25 درجه سانتیگراد ژلاتین مایع است .
مایع شدن توسط برخی میکروارگانیسم هایی که قادر به تولید آنزیم خارج سلولی پروتئولیتیک به نام ژلاتیناز هستند رخ می دهد ، که برای هیدرولیز این پروتئین برای آمینو اسید ها فعالیت می کند ، هنگامی که این تجزیه رخ می دهد ، حتی دمای بسیار کم 4 درجه سانتیگراد نمی تواند ویژگی ژل مانند آن را حفظ کند .
در این روند آزمایشی ، شما از تیوب های عمیق ژهاتین مواد غذایی برای نشان دادن فعالیت هیدرولیتیکی این آنزیم ، ژهاتیناز استفاده می کنید . محیط کشت حاوی آبگوشت مغذی مکمل با ژلاتین 12 % است . این غلظت بالای ژلاتین ناشی از محیط کشت خشک است و همچنین به عنوان ماده اولیه برای فعالیت ژلاتینئاز به کار می رود .
تلقیح و دوره نهفتگی به مدت 48 ساعت ، محیط کشت در یک یخچال به مدت 30 دقیقه با دمای 4 درجه سانتیگراد قرار می گیرد . محیط کشت که به صورت مایع باقی می ماند ژلاتیناز تولید می کند و هیدرولیز سریع ژلاتین را نشان می دهد . کل محیط کشت جامد شده به مدت 5 روز دیگر دوباره کشت می شود . به مدت 30 دقیقه در یخچال قرار می گیرد تا میعان مشاهده شود . محیط کشتی که به صورت مایع باقی می ماند نشان دهنده ی هیدرولیز تدریجی زلاتین است .
مواد و متریال ها
محیط کشت
محیط کشت ابگوشت سویا تریپتیکاز 24 تا 48 ساعته اشرشیا کولی ، باسیل سرئوس ، سودوموناس ائروگینوس و استافیلوکوک اورئوس . محیط کشت ابگوشت سویا تریپتیکاز 24 تا 48 ساعته 13 ارگانیسم از پیش برای نوع بلند فهرست شدند.
واسطه ها
نوع کوتاه : 2 پلیت از هر آگار نشاسته ؛ آگار تریبوترین و آگار شیر ؛ و 3 لوله عمیق ژلاتین مواد غذایی که برای گروه دانشجویان طراحی شد .
نوع بلند : 4 پلیت از هر آگار نشاسته ؛ آگار تریبوترین و آگار شیر ؛ و 14 لوله عمیق ژلاتین مواد غذایی که برای گروه دانشجویان طراحی شد .
واکنشگر: ( محلول ید گرم )
تجهیزات :
چراغ بونزن ، حلقه و سوزن مایه کوبی ( تلقیح ) ، مداد برای علامت گذاری روی ظزوف شیشه و یخچال .
فرآیند ها :
1- پلیت های آگار نشاسته ؛ آگار تریبوترین و آگار شیر برای مایه کوبی ( تلقیح ) را به صورت زیر اماده کنید :
الف . فرایند کوتاه : با استفاده از دو پلیت هر محیط کشت ، پایین هر ظرف کوچک مخصوص کشت میکرب را به دو بخش تقسیم کنید . بخش ها را به ترتیب با اشرشیا کولی ، باسیل سرئوس ، سودوموناس ائروگینوس و استافیلوکوک اورئوس علامت گذاری کنید .
ب ) فرایند بلند : مرحله 1 الف را تکرار کنید ، پایین 3 پلیت را به سه بخش تقسیم کنید و پایین یک پلیت در 4 بخش برای هر محیط کشت مورد نیاز ، 13 ارگانیسم آزمایش را منطبق کنید .
2 – با اسستفاده از روش استریل ، یک مایه کوبی تک خطی از هر ارگانیسم آزمون را در سطح آگار بخش های به درستی علامت گذاری شده در هر پلیت آگار را ایجاد کنید .
3 – با استفاده از روش استریل ، هر ارگانیسم را در لوله عمیق ژلاتین که به درستی غلامت گذاری شده را به منظور آسیب به مایه کوبی ، را تلقیح کنید .
4 – کل پلیت ها را در یک حالت معکوس برای 24 تا 48 ساعت در 37 درجه سانتیگراد تلقیح کنید . (کشت دهید ) . محیط کشت لوله عمیق ژلاتین را به مدت 48 ساعت کشت دهید . کل محیط های کشت منفی را به مدت 5 روز دیگر دوباره کشت دهید . ( مایه کوبی کنید ) .
مشاهدات و نتایج
هیدرولیز نشاسته :
1 – محیط کشت پلیت آگار نشاسته را با محلول ید گرم غرق کنید ، اجازه دهید ید در تماس با محیط کشت به مدت 30 ثانیه قرار گیرد و مقدار اضافی را بیرون بیرون بریزید .
2- محیط کشت برای وجود یا عدم رنگ آبی – سیاه پیرامون رشد هر ارگانیسم مورد آزمایش را بررسی کنید . نتایج خود را در فهرستی ثبت کنید .
3- بر اساس مشاهدات تان ، هر ارگانیسمی که قادر به هیدرولیز نشاسته است را ثبت و مشخص کنید .
به تصویر شماره 15 در جایگذاری رنگ پلیت برای شرح این واکنش ها رجوع کنید .
هیدرولیز لیپید
1 – محیط های کشت پلیت آگار تریبیوتیرین برای وجود و فقدان منطقه شفاف یا ناحیه لیپولیز پیرامون رشد هر ارگانیسم را بررسی کنید . نتایج خود را در فهرستی ثبت کنید .
به تصویر شماره16 در جایگذاری رنگ پلیت برای شرح این واکنش ها رجوع کنید .جدول شماره 1
هیدرولیز تریبوترین
هیدرولیز نشاسته
انواع باکتری
نتایج (+) یا (-)
شکل محیط کشت
نتایج (+) یا (-)
شکل محیط کشت
E.coli
E.aerogenes
k.pnemuniae
s.dysentriae
s.typhimurium
p.vulgaris
p.aeruginosa
A.faecalis
M.luteus
S.lactis
S.aureus
B.cereus
C.xerosis
هیدرولیز کازئین :
1 – محیط های کشت پلیت آگار شیر را برای وجود و فقدان منطقه شفاف یا ناحیه پروتئولیز پیرامون رشد هر ارگانیسم آزمون باکتریایی را بررسی کنید . نتایج خود را در فهرستی ثبت کنید .
2- بر اساس مشاهدات تان ، هر ارگانیسمی که قادر به هیدرولیز کازئین پروتئین شیر بودند را ثبت و مشخص کنید .
هیدرولیز ژلاتین
1 – کل محیط های کشت لوله عمیق ژلاتین را در یخچال در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه قرار دهید .
2- کل محیط های کشت را برای تعیین مایع بودن یا جامد بودن محیط کشت بررسی کنید . نتایج خود را در فهرستی ثبت کنید .
3 – بر اساس مشاهدات تان در ادامه دوره مایه کوبی 2 و 7 روزه ، هر ارگانیسمی که قادر به هیدرولیز ژلاتین بودند و سرعت هیدرولیز را ثبت و مشخص کنید .
هیدرولیز ژلاتین
هیدرولیز کازئین
انواع باکتری
سرعت هیدرولیز (آهسته یا سریع )
مایع شدن (+) یا (-)
نتایج (+) یا (-)
شکل محیط کشت
E.coli
E.aerogenes
k.pnemuniae
s.dysentriae
s.typhimurium
p.vulgaris
p.aeruginosa
A.faecalis
M.luteus
S.lactis
S.aureus
B.cereus
C.xerosis
تخمیر کربوهیدرات
هدف :
تعیین توانایی میکروارگانیسم ها برای تجزیه و تخمیر کربوهیدرات ها با تولید یک اسید یا اسید و گاز .
مبانی و اصول :
اکثر میکروارگانیسم ها انرژی شان را از طریق مجموعه های منظم و واکنش های آنزیمی منسجم ناشی از بیواکسیداسیون یک ماده اولیه ،غالباً یک کربوهیدرات، بدست می آورند .مجراهای اصلی به وجود آمده در نمودار 2201 نشان داده شده است .
ارگانیسم ها کربوهیدرات ها را به طور متفاوت بستگی به بخش های آنزیمی شان مصرف می کنند . برخی ارگانیسم ها قادربه تخمیر شکر ها از جمله گلوکز بی هوازی هستند ، در حالیکه دیگران از مجرای هوازی استفاده می کنند . هنوز دیگران ، بی هوازی های اختیاری ، دارای سر رشته آنزیمی برای مصرف مجراهای هوازی و بی هوازی هستند ، و برخی ارگانیسم ها فاقد توانایی اکسیداز گلوکز با هم هستند .
در تخمیر ، مواد اولیه از جمله کربوهیدرات ها و الکل ها متحمل شبیه سازی بی هوازی می شوند و یک اسید ارگانیک را تولید می کنند ( برای مثال ،اسید لاکتیک ، اسید فورمیک یا اسید استیک ) که همراه با گازهایی مانند هیدروژن و دی اکسید کربن خواهد بود . بی هوازی های
اختیاری معمولاً فرمنتر های کربوهیدرات نامیده می شوند . تخمیر با در نظر گرفتن تجزیه گلوکز به روش مجرای امبدن – میروف بهتر توصیف می شود ، همچنین به عنوان مجرای گلیکولیتیک شناخته شده است ، که در نمودار 2202 نشان داده شده است .
همانگونه که نمودار نشان می دهد ، یک مول گلوکز به دو مول اسید پیروویک تبدیل می شود ، که بخش میانجی اصلی تولید شده توسط تجزیه گلوکز می باشد . متابولیسم متعاقب پیروویت برای کل ارگانیسم ها یکسان نیست ، و تنوع محصولات نهایی باعث می شود که توانایی های متفاوت تخمیری شان تعیین و مشخص شود . که در نمودار 2203 قابل مشاهده است .
تجزیه تخمیری تحت شرایط بی هوازی در لوله آبگوشت تخمیر حاوی لوله دورهام انجام می شود ، یک شیشه نمونه درونی مبدل برای تعیین تولید گاز ، همانگونه که در نمودار 2204 نشان داده شده است . یک محیط کشت تخمیز کربوهیدرات معمول حاوی
1- ترکیبات آبگوشت مغذی برای حمایت از رشد کل ارگانیسم ها .
2- کربوهیدرات خاص که به عنوان ماده اولیه برای تعیین توانایی تخمیر ارگانیسم ها به کار می رود .
3- شاخص قرمز فنول ph ، که در ph خنثی قرمز است و در ph اسیدیک 608 زرد می شود ، که نشاندهنده ی مقدار کمی اسید است که موجب تغییر رنگ می شود .
ماهیت اصلی واکنش تخمیر و فعالیت شاخص آن را ضروری می سازد که همه ی محیط های کشت باید در ظرف مدت 48 ساعت مشاهده شود . تلقیح مبسوط واکنش های اسید تولید شده را توسط تولید آلکالی ( قلیایی ) را پنهان می کند زیرا فعالیت آنزیمی در ماده اولیه نسبت به کربوهیدرات .
با ادامه ی تلقیح ، کربوهیدرات هایی که با تولید زباله های اسیدی تخمیر می شود موجب می شود قرمز فنول به زرد بر گردد ، بنابراین نشاندهنده ی واکنش مثبت است . در برخی موارد ، تولید اسید همراه با تکامل تدریجی گاز (co2) است که به صورت یک حباب در لوله وارونه قابل مشاهده است . محیط های کشت که قادر به تخمیر ماده اولیه کربوهیدرات نبودند شاخص را تغییر نمی دادند ، و لوله ها قرمز به نظر می رسیدند ؛ و تکامل تدریجی گاز پیوسته نخواهد بود . این یک واکنش منفی است .
کمبود تخمیر کربوهیدرات با برخی ارگانیسم ها نباید به عنوان عدم رشد استنباط شود . ارگانیسم ها از مواد مغذی دیگر در محیط کشت به عنوان منابع انرژی استفاده می کنند . در بین این مواد مغذی پپتون هایی هستند که در آب آبگوشت مغذی وجود دارند . پپتون ها می توانند با آنزیم های میکروبی برای آمینو اسید ها تجزیه شوند که به طور آنزیمی توسط دامیناسیون اکسایشی به اسید های کتوامینو تبدیل شوند . سپس از طریق چرخه کربس برای تولید انرژی از طریق متابولیز دگرگون می شود . این واکنش ها آمونیا را آزاد می کند ، که در محیط کشت جمع می شود ، هیدروکسید آمونیوم (NH4OH ) را تشکیل می دهد و محیط قلیایی را تولید می کنند . هنگامی که این اتفاق می افتد ، قرمز فنول به قرمز پررنگ در محیط کشت پایه کنونی تبدیل می شوند . این مجرای متناوب تنفس هوازی در نمودار 2205 نشان داده شده است .
مواد
محیط های کشت
محیط های کشت آبگوشت سویا تریپتیکاز 24 تا 48 ساعته اشرشیا کولی ، الکالیژن فاسالیس ، سالمونلا تیفیمیریوم و استافیلوکوک اورئوس برای مدل کوتاه . محیط های کشت آبگوشت سویا تریپتیکاز 24 تا 48 ساعته 13 ارگانیسم قبلاً برای مدل بلند فهرست شد .
واسطه ها :
هر گروه دانشجویی طراحی شده : لاکتوز قرمز فنول ، دکستروز (گلوکز ) و آبگوشت ساکروز : 5 از کل برای نوع کوتاه ، 4 از کل برای مدل بلند .
تجهیزات : (چراغ بونزن ، حلقه و سوزن مایه کوبی ( تلقیح ) ، مداد برای علامت گذاری روی ظزوف شیشه . )
فرآیند ها :
1-با استفاده از روش استریل ، هر ارگانیسم آزمایشگاهی درون محیط کشت مناسب آن به منظور تلقیح حلقه ای را مایه کوبی کنید . در طول این مرحله مواظب باشید که لوله تخمیر را تکان ندهید ؛ تکان دادن لوله موجب فشار حباب هوا درون شیشه نمونه گاز وارونه می شود ، محیط کشت را تغییر می دهد و احتمالاً نتایج مثبت غلط را نشان می دهد . لوله آخر باید تحت کنترل باشد .
2-کل لوله ها را به مدت 24 تا 48 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد تلقیح کنید .
مشاهدات و نتایج
1- کل محیط های کشت آبگوشت کربوهیدرات را برای رنگ و وجود و فقدان حباب گاز بررسی کنید . نتایج خود را در فهرستی ثبت کنید .
2- بر اساس مشاهدات خود ، و مشخص و ثبت کنید که آیا هر ارگانیسم قادر به تخمیر ماده اولیه کربوهیدرات با تولید اسید یا اسید گاز می باشد یا خیر .
به تصویر شماره 17 در جاسازی رنگ – پلیت برای شرح این واکنش ها رجوع کنید .
پرسش های بازنگری
1- تمایز بین تنفس و تخمیر را مشخص کنید .
2- آیا کل میکروارگانیسم ها از اسید پیروویک به روشی مشابه استفاده می کنند ؟ توضیح دهید
3- مجرای استفاده شده برای تجزیه کربوهیدرات توسط بی هوازی های محض را توصیف کنید .
4- از داده های آزمایشی تان ، می دانید که p.aeruginosa از هیچ کربوهیدراتی در محیط کشت آزمون استفاده نمی کند . با توجه به این دیدگاه ، چگونه این ارگانیسم ها برای حفظ زیست پذیری شان انرژی تولید می کنند ؟
5- کلستریدیوم پرفرینژنز ، یک بی هوازی ضروری ، که قادر به مصرف کربوهیدرات های آزاد شده از بافت های آسیب دیده به عنوان یک منبع انرژی است . در طول روند عفونی ، مقادیر زیاد گاز در بافت های عفونی جمع می شود . آیا شما فکر می کنید که این گاز CO2 باشد ؟ توضیح دهید .
18