پاورپوینت کاربردهای بیوتکنولوژی

1
مقدمه و کاربردهای بیوتکنولوژی

2
Biotechnology
:Bio مربوط به زیست و موجودات زنده
‏‏Technology : فن آوری
Biotechnology : زیست فن آوری، فن آوری زیستی
تعریف: بهره برداری تجاری از ارگانیسمها یا اجزای آنها مانند آنزیمها

3
Multidisciplinary بودن بیوتکنولوژی
توجه: در بیوتکنولوژی مدرن، از زیست شناسی مولکولی کاربردی، استفاده زیادی می شود، اما Applied Molecular Biology معادل بیوتکنولوژی نیست (Bains, 1998)
Biological
Sciences
Chemical
Sciences
Engineering
Sciences
Bio-
technology
Bio-
chemistry
Chemical
Engineering
Bio-
engineering

4
تاریخچه
تولید ماست، پنیر، سرکه و مشروبات الکلی از 8000 سال پیش تاکنون
امکان بهبود طعم، قوام و کیفیت نگهداری مواد غذایی در اثر فعالیت میکروارگانیسمها
اولین ماده شیمیایی تولید شده بکمک بیوتکنولوژی: اتانول
تبدیل گلوکز به گلیسرول (بجای الکل) توسط مخمر آبجو بوسیله آلمانها در آغاز جنگ جهانی اول (1918-1914)
تولید استون- بوتانول از قندها توسط Clostridium acetobutylicum بوسیله انگلیسیها در جنگ جهانی اول
تولید اسید سیتریک از قندها توسط Aspergillus niger در سال 1923

5
تاریخچه، ادامه
کشف پنی سیلین حاصل ازPenicillium notatum و تخلیص آن در سال 1940
غربالگری پنی سیلیومها برای یافتن گونه های مولد مقدار بیشتری پنی سیلین ویافتنchrysogenum Penicillium
ایجاد موتاسیون دراین سویه بوسیله نیتروژن موستارد، UV و X-ray
غربالگری متناوب موتانتهای مولد پنی سیلین بیشتر و موتاسیون مجدد
کشف استرپتومایسین حاصل از Streptomyces griseus در سال 1944
 متداول شدن غربالگری گونه های جداشده از محیط بخصوص غربالگری از بین اکتینومیستها (مولد 90% از آنتی بیوتیکهای فعلی)

6
تاریخچه، ادامه
تولید پروتئین تک یاخته (SCP) در دهه 1960
کشت مقیاس وسیع سلولهای حیوانی در دهه 1960برای تولید واکسنهای ویروسی
تولید سلولهای Hybridoma از ادغام سلولهای myeloma و رده خاصی از لنفوسیتهای طحال برای تولید Monoclonal Antibodies در دهه 1980
کشت سلولهای گیاهی برای تولید مواد شیمیایی کشاورزی، دارویی، طعم دهنده و رنگی
بیوتکنولوژی مدرن: انقلاب حاصل از تکنولوژی DNA نوترکیب در دهه 1980 و امکان تولید پروتئینهای درمانی از میکروارگانیسمها، سلولهای گیاهی و حیوانی

7
کاربردهای کلی بیوتکنولوژی
داروسازی و پزشکی
صنایع (غذایی، شوینده، چرمسازی و نظامی )
کشاورزی
دامپروری
حفاظت محیط زیست

8
کاربردهای بیوتکنولوژیک میکروارگانیسمها
1- تولید سلولهای کامل یا توده زیستی (Biomass):
مواد تلقیحی (Inoculants):
حشره کشهای میکربی: Bacillus thuringiensis
کشتهای آغازکننده (Starter Cultures) برای تهیه لبنیات: Lactobacillus sp., Streptococcus cremoris
پروتئین تک یاخته (SCP): Probiotics
واکسنهای باکتریایی
2- تولید ترکیبات با وزن مولکولی پایین:
متابولیتهای اولیه
محصولات نهایی متابولیک: اتانول، استون، بوتانول، اسید لاکتیک
متابولیتهای اولیه اساسی: اسیدهای آمینه، ویتامینها، نوکلئوزیدها
متابولیتهای ثانویه: آنتی بیوتیکها، مایکوتوکسینها، پیگمانها
3- تولید ترکیبات با وزن مولکولی بالا:
پلی ساکاریدها
لیپیدها
پروتئینها (آنزیمها ، داروها ، فراورده های بیولوژیک)
4- فرایندهای وابسته به متابولیسم میکروارگانیسمها:
تغییروتبدیلات بیولوژیک (Biotransformations): استروئیدها، اسیدهای آمینه، سوربوز
تجزیه/ اکسیداسیون فاضلابها و مواید زاید سمی
استخراج مواد معدنی

9
تولید Biomass، مواد تلقیحی (Inoculants)
تولید مخمر نان و آبجو ((Saccharomyces cerevisiae بعنوان مایه تخمیر تهیه نان، شیرینی و مشروبات الکلی
تولید ریزوبیومهای همزیست برای گره سازی و تثبیت N دردانه های حبوبات و افزودن به خاک مناطق فاقد آنها مانند استرالیا
تولید هاگهای Penicillium roquefortii و گونه های مربوطه بعنوان مایه برای پنیرهای دارای رگه های آبی جهت ایجاد قوام وطعم ویژه
تولید Psedomonas syringae برای کاتالیزتشکیل هستک یخ و تشکیل برف مصنوعی در پیستهای اسکی
و یا جلوگیری از آسیب یخ به محصولات کشاورزی با استفاده از گونه های جهش یافته فاقد توانایی هسته زایی یخ

10
تولید Biomass، (SCP)ٍSingle Cell Protein
تعریف: سلولها یا پروتئینهای استخراج شده MO و کشت داده شده در مقیاس انبوه مورد استفاده درغذای انسان یا حیوان
دارا بودن پروتئین زیاد، چربی، کربوهیدرات، اسیدهای نوکلئیک، ویتامینها و مواد معدنی
اما محدود بودن توانایی انسان در هضم اسیدهای نوکلئیک نیاز به فرآوری و بیشتر بعنوان غذای دام
مواد خام مورد استفاده تولیدSCP: CO2، متان، متانول، اتانول، قندها،هیدروکربنهای نفت، ضایعات صنعتی و کشاورزی
میکروارگانیسمهای مورد استفاده تولید:SCP جلبکها، اکتینومیستها، سایر باکتریها، مخمرها، قارچهای رشته ای، قارچهی عالی تر

11
مثالهای SCP
1- کشت مداوم Methylophilus methylotrophus برروی متانول و آمونیاک در انگلستان با نام Pruteen® ، دارای80 % پروتئین خام و ویتامین زیاد، 2 برابر مغذی تر از سویا اما غیر اقتصادی
2- کشت قارچ venenatum Fusarium با جزء اصلی Mycoprotein و نام Quorn™
پروتئین زیاد، فیبر، چربی کم ، بدون کلسترول
بافت فیبری و مزه شبیه گوشت
17 سال سابقه مصرف دردنیا، گران و بیشترین مصرف توسط گیاهخواران

12
1- متابولیتهای اولیه، تولید در حین رشد (‏Trophophase)
محصولات نهایی متابولیک: اتانول، استون، بوتانول، اسید لاکتیک، 3و 2-بوتان دی ال، تولید در مقادیر غیر مورد نیاز سلول
متابولیتهای اساسی: اسیدهای آمینه ، ویتامینها ، نوکلئوزیدها ، تولید در مقادیر مورد نیاز سلول (در wild type)
2- متابولیتهای ثانویه ، تولید پس از توقف رشد (Idiophase) : آنتی بیوتیکها، مایکوتوکسینها، پیگمانها

ترکیبات با وزن مولکولی پایین

13
کینتیک تولید محصولات در رابطه با رشد سلولها
Concentration
Time
Biomass
Trophophase
Idiophase
Substrate
Primary Metabolite
Secondary Metabolite

14
محصولات میکربی با وزن مولکولی پایین

15
محصولات سنتی صنایع تخمیر: اتانول، استون، بوتانول، اسید لاکتیک
بی هوازی و مولد CO2
پر فروشترین محصول بیوتکنولوژی: الکل
توجه به جنبه های اقتصادی صنایع شیمیایی رقیب

محصولات نهایی متابولیک

16
تخمیر Fermentation
Frever: جوشان، CO2
از نظر بیوشیمی: تولید انرژی که مواد آلی= الکترون دهنده + الکترون گیرنده نهایی
از نظر بیوتکنولوژی: تولید محصولات با کشت انبوه MO
واژه جدید معادل: Bioprocess

17
Sugars
Pyruvic acid
Acetaldehyde
Ethanol
(Yeasts)
NADH + H+
NAD+
Lactic acid
Lactic acid bacteria
Acetyl-CoA
Acetoacetyl-CoA
Acetone
(Clostridium)
NAD+
Butyryl-CoA
Butanol (Clostridium)
-Acetolactic acid
Acetoin
2,3-Butanediol
(Klebsiella sp.)

18
متابولیتهای اولیه اساسی

ضروری برای رشد
تولید تنها به قدر نیاز
بیش تولیدآنها بوسیله تغییر تنظیم متابولیک (Overproduction)

19
متابولیتهای اولیه اساسی تجاری

20
روشهای اصلی افزایش تولید متابولیتهای اولیه بوسیله تنظیمهای متابولیک
1- وقفه مهار بازخوردی(Feedback Inhibition): وقفه مهار فعالیت آنزیم کلیدی بوسیله محصولات نهایی
2- وقفه سرکوب (Repression):
وقفه سرکوب سنتز آنزیمهای مسیر متابولیک بوسیله محصولات نهایی
3- حذف واکنشهای بیوشیمیایی رقیب
4- تغییر نفوذ پذیری غشای سیتوپلاسمی

21
Aspartate
Aspartate semi-aldehyde
Homoserine
dehydrogenase
Homoserine
Methionine
Mutation 3
Cystathionine
-synthase
Threonine
Mutation 1
Isoleucine
Repression of
enzyme synthesis
Mutation 2
Feedback
Inhibition of
enzyme activity
مهندسی متابولیک بیوسنتز ترئونین برای overproduction آن

22
مراحل تنظیم متابولیک Overproduction ترئونین
1- تهیه موتانت غیرحساس به مهار بازخوردی ترئونین بر روی dehydrogenase Homoserine
2- تهیه موتانت فاقد قابلیت تبدیل ترئونین به ایزولوسین
الف- تجمع ترئونین در اثر عدم تبدیل
ب- عدم سرکوب سنتز آنزیم مبدل هوموسرین به ترئونین در اثر کاهش ایزولوسین
3- تهیه موتانت فاقد قابلیت تبدیل هوموسرین به متیونین

23
مکانیسمهای مراحل تنظیم متابولیک Overproduction ترئونین
1- موتاسیون اول:
ایجاد موتاسیون
افزودن آنالوگ ترئونین (amino,-hydroxy valerate-)
یافتن موتانتهای مقاوم به اثر مهار رشد این آنالوگ به روش Gradiant Plate
2- موتاسیون دوم:
ایجاد موتاسیون
یافتن موتانتهایی که فقط در صورت تغذیه با ایزولوسین رشد می کنند (Isoleucine Auxotrophs)
3- موتاسیون سوم:
ایجاد موتاسیون
یافتن Methionine Auxotrophs

24
Gradient Plate Technique
=آگار + آنالوگ10 ml
=آگار 10 ml
افزودن MO
منطقه رشد
موتانتهای مقاوم به آنالوگ

25
تغییر نفوذ پذیری غشا
امکان خروج محصول از سلول  کاهش Feedback Inhibition و Repression
مثال: افزایش تولید گلوتامات درCorynebacterium glutamicum با کاهش دادن بیوتین
مهار سنتز اسیدهای چرب غشا
یکپارچگی غشا↓
نفوذپذیری غشا به گلوتامات↑
 کاهش Feedback

26
برخی از روشهای انجام تنظیم متابولیک
تکنیکهای متداول ژنتیک و DNA نوترکیب
روش اول: Cloning ژن آنزیمها، بخصوص آنزیمهای Rate Limiting
ایجاد کپی های متعدد ژن
افزایش مقدار آنزیم
روش دوم: Clone ژنهای کلیه آنزیمهای یک مسیر بیوسنتز
به گونه ای که سنتز آنها تحت کنترل یک پیش برنده کاملا مشخص نظیرlac promoter باشد

27
متابولیتهای ثانویه (Idiolites)
تولید پس از توقف رشد (Idiophase)
غیر ضروری برای رشد
نقش نامشخص، احتمالا مزیت اکولوژیک و بقا
معروفترین: آنتی بیوتیکها
سایر: مایکو توکسینها، آلکالوئیدهای ارگو، سایکلوسپورین(فرونشاننده ایمنی)، fumagillin (مهارکننده رگزایی) و …
بیش از2500 آنتی بیوتیک، اکثرا از آکتینومیستها

28
تولید توسط تعداد کمی از میکروارگانیسمها
وابستگی شدید تولید آنها به شرایط محیطی
گروهی بودن تولید متابولیتهای با ساختمان مشابه توسط بعضی از میکروارگانیسمها، مثال: تولید 32 آنتراسیکلین توسط یک نژاد استرپتومایسس
متفاوت و متنوع بودن متابولیتهای ثانویه تولیدی توسط برخی از میکروارگانیسمها
تفاوت قابل ملاحظه با متابولیتهای اولیه در تنظیم بیوسنتز
متابولیتهای ثانویه، ادامه

29
افزایش تولید متابولیتهای ثانویه
1- Screening سویه های مولد مقدار بیشتر(40-30% تاثیر روی نتیجه نهایی) بخصوص از محیطهای نامتعارف: ارتفاعات ، مناطق سرد، آب دریا، بیابان، چشمه آب گرم ، زمینهای نفت خیز
2- ایجاد موتاسیون و انتخاب موتانتها بخصوص در جهت حذف کنترلهای تنظیمی
3- کلون ژنها، بخصوص ژنهای کنترل کننده کل مسیر بیوسنتز
4- افزودن پیشتازها و اسیدامینه های محرک
مثال:افزودن -aminoadipate  پنی سیلین↑

30
افزایش تولید متابولیتهای ثانویه، ادامه
5- بیوسنتز هدایت شده: افزودن پیشتاز  هدایت مسیر به تولید یک محصول
مثال: افزودن فنیل استیک اسید  بنزیل پنی سیلین↑ در مقابل سایر پنی سیلینها

31
موانع بیش تولید متابولیتهای ثانویه
عدم شناخت مسیر بیوسنتز (اغلب)  دشواری موتاسیون انتخابی
عدم شناخت کنترلهای تنظیمی
 استفاده از فن آوری DNA نوترکیب
تعیین توالی DNA تشخیص تعداد ژنهای دخیل و مراحل بیوسنتز

32
تولید ترکیبات با وزن مولکولی زیاد
پروتئینها
پلی ساکاریدها
لیپیدها

33
تولید پروتئینها
آنزیمهای Bulk ، توضیح مشروح بعدا
پروتئینهای با ارزش درمانی

فن آوری DNA نوترکیب  افزایش تولید پروتئینها  کاهش هزینه ها وسختی جداسازی

34
تولید پروتئینهای درمانی
هورمون رشد گاوی  افزایش تولید شیر گاو و سرعت رشد ماهی
موفقیت آمیزترین جنبه DNA نوترکیب: تهیه MO سنتز کننده پروتئینهای درمانی انسانی
مقادیر بسیار اندک پروتئینهای درمانی بخصوص هورمونها در بدن
عدم تخلیص یا حتی جداسازی بسیاری از آنها قبل از پیدایش دستکاری ژنها

35
برخی پروتئینهای درمانی

36
پروتئینهای درمانی، ادامه

37
پروتئینهای درمانی
بسیاری از پروتئینهای درمانی: گلیکوپروتئین
عدم یا تفاوت glycosylation در میکروبها
آنالوگهایی با فعالیت، توزیع، نیمه عمر و ایمنی زایی متفاوت
اتصال کووالان glycol Monomethoxy polyethylen به پروتئینها
افزایش نیمه عمر ، اما هنوز آنالوگ
تولید نسل دوم آنالوگها بوسیله مهندسی پروتئین

38
مشکلات تولید پروتئینهای درمانی
زده شدن انتهای پروتئینهای خارجی بوسیله پروتئاز MO حداقل در E. coli
جداسازی تکه ها برای پیشگیری از واکنش ایمنی
تبدیل پروتئینهای خارجی به اجسام انباشته (inclusion bodies)
غیرفعال، بازیابی بسیار مشکل
تسهیل ساخت و چین دادن برخی از پروتئینها بوسیله ملازم (Chaperon) های مولکولی (یک نوع پروتئین)

39
یک نمونه اصلی ملازم: پروتئین GroEL E. coli ، تسهیل چین خوردن پروتئینهای خاص بدون شرکت در ساختمان نهایی
یک کاربرد نسبتا جدید پروتئینهای کلون شده:
کلونینگ گیرنده های آدرنرژیک انسان در E. coli
حفظ خواص اتصالی گیرنده ها در بافتهای پستانداران
استفاده آسانتر در مطالعات فارماکولوژیک
غربالگری سریع داروهای جدید

40
ویژگیهای پروتئینهای درمانی تزریقی
خلوص <95%
ناهمگنی> حد مجاز
DNA آلاینده> 10 pg/dose
آندوتوکسین > حد مجاز
مواد سمی (هنگام تخلیص)> حد مجاز
فعالیت ویژه < Min مجاز
غیاب MO

41
Glycosylation پروتئینها
افزوده شدن کربوهیدراتها
بعد از ترجمه (post-translational)
به پروتئینهای ترشح شده یا
وابسته به سطح
در ارگانیسمهای عالی تر
تغییر در خواص فیزیکوشیمیایی
و فیزیولوژیک: فعالیت، توزیع، ایمنی زایی و نیمه عمر

42
Glycosilation

43
پلی ساکاریدهای میکربی
مزایای پلی ساکاریدهای میکروارگانیسمها:
تامین یکنواخت و قابل اتکا
خواص فیزیکوشیمیایی نسبتا ثابت
تجمع پلی ساکاریدها بیرون دیواره
excess C،limiting  Nافزایش سنتز
Batch و Continuous
Chemostat : یکنواخت
sugars N limiting neutral
acid sugars  Metal ions limiting
تاثیر ژنتیک کلاسیک در بیش تولید< recombinant DNA

44
پلی ساکاریدهای میکربی تجارتی

45
Polyhydroxyalkanoates (PHAs)
بسیاری باکتریها
ذخیره داخل سلولی
مشهورترین: poly(3-hydroxybutyrate)
:PHB 20 سال، Biodegradable thermoplastic
اخیرا PHAs بهتر
1990: ظرف شامپو Biodegradable کوپلیمر
گران  Cloning
تجهیزات پزشکی
حاملهای دارویی