بررسی قابلیت های SNP در ژنتیک جنایی با اجرای روش RFLP-PCR و مقایسه آن با روشهای مبتنی با STR
استادان راهنما:
دکتر محمود تولایی
دکتر مهرداد بهمنش
پژوهشگر
امیرحسین احمدی
کاربرد زیست شناسی در علوم جنایی
علوم جنایی مرزهای گسترده ای دارد و شامل علوم مختلفی چون زیست شناسی، شیمی، فیزیک و ریاضی می باشد.
کشف گروههای خونی ABO در سال 1900
شناسایی تعداد بسیار زیادی از مارکرهای گروه خونی و مارکرهای پروتئینی محلول در سرم
تکنیک های سرولوژیکی ابزار قدرتمندی بودند اما در بسیاری از موارد جنایی به واسطه نیاز به حجم زیاد از نمونه های زیستی با محدودیت هایی همراه بودند.
در طول بیست سال گذشته تجزیه و تحلیل دزوکسی نوکلئیک اسید (DNA) سبب تحولی عمده در تحقیقات جنایی شده است.
مارکرهای ژنتیکی مورد استفاده در تعیین هویت
توالی های تکراری با تعداد متغیر (VNTRs)
توالی های تکراری کوتاه(STRs)
چند شکلی های تک نوکلئوتیدی (SNPs)
لوکوس هایی از DNA که می توانند در ژنتیک جنایی مورد بررسی قرار گیرند باید ویژگی هایی زیر را دارا باشند:
داشتن تنوع بالا
آسان و ارزان بودن شناسایی آنها
پروفایل به دست آمده از آنها باید به آسانی آنالیز شود
نباید این مناطق تحت فشار انتخابی قرار داشته باشند
این مناطق باید نرخ جهش کمی داشته باشند
VNTRs
پلی مورفیسم های VNTR غالبا در نزدیک نواحی تلومری کروموزوم ها قرار گرفته اند و هسته توالی تکراری آنها متشکل از 6 تا 100 جفت باز می باشد.
در سال 1984 الک جفری به پتانسیل کاربرد توالی های تکراری با تعداد متغیر (VNTR) در حل مسائل جنایی پی برد.
این روش شامل استخراج DNA و برش آن با استفاده از آنزیم های محدودالاثر، ساترن بلاتینگ و هیبریداسیون پروب برای شناسایی لوکوس های پلی مورفیک می باشد.
محدودیت ها
نیاز به میزان زیادی از DNA با وزن مولکولی بالا
دشواری هایی تفسیر نتایج آنها
STRs
پیشرفت اساسی در تاریخ ژنتیک جنایی با ظهور PCR حاصل شد. استفاده از PCR سبب افزایش حساسیت آنالیز DNA می شود به طوریکه تنها با دردسترس بودن تعداد کمی سلول باقی مانده امکان آنالیز فراهم می شود.
ساختار STRها. هسته تکرار شونده می تواند بین 1 تا 6 نوکلئوتید باشد. این مثال نشان دهنده ساختار دو آلل از لوکوس D8S1179 می باشد. آلل ها بر حسب تعداد تکرارهایی که حاوی آنها می باشند نامگذاری می شوند.
STRها تمامی نیاز یک مارکر جنایی را تامین می کنند
امکان آنالیز طیف وسیعی از مواد زیستی
نتایج به دست آمده از آنالیز آنها در آزمایشگاه های مختلف به خوبی قابل مقایسه است.
توان تفکیک بسیار بالا
حساسیت بسیار بالا
آسان و کم هزینه بودن ایجاد پروفایل از STRها
تعداد بسیار زیادی STR وجود دارد که در سرتاسر ژنوم تحت هیچ فشار انتخابی قرار ندارند.
در ایالت متحده، تکنولوژی STR با انتخاب 13 لوکوس با عنوان لوکوس های CODIS (Combined DNA Index System) به کارهای جنایی معرفی شده است. این لوکوس ها می توانند تنها در یک PCR مورد آنالیز قرار گیرند.
پلی مورفیسم های تک نوکلئوتیدی ساده ترین نوع از پلی مورفیسم های DNA به شمار می آیند.
SNP ها به طور طبیعی دارای دو آلل می باشند.
SNP جز پلی مورفیسم های به شدت آگاهی دهنده به شمار نمی روند.
SNP ها در سراسر ژنوم بسیار فراوان می باشند و از نظر تئوریک این امکان وجود دارد تا صدها عدد از آنها تعیین نوع شوند. این مسئله سبب می شود تا قدرت تفکیک در مجموع بسیار بالا رود.
پلی مورفیسم های تک نوکلئوتیدی (SNPs)
یکی از چالش های همیشگی در کارهای جنایی آنالیز DNA ای می باشد که به شدت تجزیه شده است و باید از نمونه هایی چون استخوان و دندان افرادی که مدت هاست جان سپرده اند استخراج شود.
در چنین مواردی استفاده از STR ها امکان پذیر نمی باشد چراکه STR های استاندارد طول amplicon بلندی دارند و بر روی نمونه های تجزیه شده به خوبی جواب نمی دهند.
علاقه به استفاده از پلی مورفیسم های تک نوکلئوتیدی(SNP) رو به افزایش است که از دلایل آن می توان به کمتر بودن نرخ موتاسیون و امکان آنالیز DNA های خرد اشاره کرد.
اهمیت SNP ها در ژنتیک جنایی
SNP ها در مقایسه با STR ها در مطالعات جنایی
مزایای SNP ها
SNP میزان موتاسیون کمتری نسبت به STR ها دارند.
امکان آنالیز آنها از amplicon های کوتاه وجود دارد.
امکان مطالعه High-throughput درباره آنها وجود دارد.
معایب SNP ها
به تعداد بالایی SNP نیاز است
تعداد بالای SNP های مورد نیاز انجام multiplex genotyping را مشکل می سازد.
یکی دیگر از ایرادهای SNP ها در مقایسه با STR ها تعدد روش های تشخیص SNP بدون ارائه روشی استاندارد می باشد.
خصوصیات SNP های مورد استفاده در تعیین هویت
قرار گرفتن در قسمت غیر کد کننده ژنوم
SNP های انتخاب شده حداقل 2Mbp از یکدیگر فاصله داشته باشند به عبارت دیگر SNP ها دارای توارث غیر وابسته و مستقل از هم باشند.
فراوانی آللی بین 0/8-0/2 (فراوانی بالا در میان جمعیت).
اطلاعات کاملی در مورد توالی اطراف SNP ها وجود داشته باشد که در طراحی PCR به کار آید.
حفاظت شده باشند و نسبت به موتاسیون پایداری داشته باشند.
فاقد بیان فنوتیپی باشد و عدم پیوستگی SNP ها با بیماری ها
آزمایش تعیین والدین
تعیین هویت از جمله آزمایشاتی است که به منظور تایید رابطه پدر و فرزندی (تعیین ابوت) و یا مادر و فرزندی انجام می گیرد.
در این آزمایش نمونه DNA پدر یا مادر فرضی با نمونه فرزند مقایسه می شود.
چون هر فرد نیمی از ژن های خود را از پدر و نیمی را از مادر دریافت می کند، می توان روابط خویشاوندی را با استفاده از این مارکرها اثبات کرد.
به طور معمول در آزمایشگاه ها حداقل 15 تا 16 مارکر مورد مقایسه قرار می گیرند که شامل 13 مارکر CODIS نیز می باشند.
عوامل تعیین کننده در انتخاب ماکرهای مناسب برای تست تعیین والدین
احتمال یکسان بودن (PI)
این فاکتور به معنای احتمال آنست که دو فرد غیر مرتبط با هم که به صورت تصادفی انتخاب شده اند ژنوتیپ چند لوکوسی مشابه با هم را نشان دهند.
PI برای یک لوکوس احتمال آنست که دو فرد دارای ژنوتیپ مشابه در آن لوکوس باشند و با جمع مجذور فراوانی ژنوتیپ ها محاسبه می شود.
PI = (aa فراوانی) 2 + (ab فراوانی ) 2 + (bbفراوانی ) 2
a, b = آلل های یک ژنوتیپ
میزان کل PI برای همه لوکوس ها (CPI) برابر با حاصاضرب PI هر یک از لوکوس ها در یکدیگر است:
CPI = PI 1 × PI 2 × PI 3 × … × PI n
عوامل تعیین کننده در انتخاب ماکرهای مناسب برای تست تعیین والدین
قدرت محروم کردن (PE):
این فاکتور به معنای قدرت مارکر ژنتیکی در مستثنی کردن یک فرد غیر مرتبط که به صورت تصادفی از بین جمعیت انتخاب می شود، به عنوان کاندیدای پدر قانونی می باشد. این فاکتور به صورت زیر برای هر مارکر قابل محاسبه است:
PE= h2 (1-2hH2)
که در آن h برابر با فراوانی هتروزیگوت ها و H فراوانی هموزیگوت ها می باشد.
همچنین مجموع کل PE برای همهی مارکرها CPE از طریق فرمول زیر قابل محاسبه است:
CPE = 1 – (1 – PE1)(1 – PE2)(1 – PE3)…(1-PEN)