بسمه تعالی
آزمایشگاه بیو شیمی
(جهت رشته شیمی)
(یک واحد درسی )
بر اساس سر فصلهای مصوب دانشگاه
تهیه کننده: علی مولوی
دانشگاه پیام نور مشهد
1385
کاربرد اسپکترو فتو متری در بیو شیمی
1 – اسپکتروفتومتری
بوسیله اسپکتروفتومتر شدت رنگ محلولها را با دقت اندازه گیری می کنند.
دستگاههائی که برای رنگ سنجی به کار برده می شوند الکتروفتومترو یا اسپکتروفتومتر نامیده می شوند.
شمای ساده زیر قسمتهای مختلف یک الکتروفتومتر را نشان می دهد.
بطور کلی هر اسپکتروفتومتر:
یک منبع نورانی،
یک وسیله ایجاد نور تکرنگ با طول موج مشخص
یک سلول یا لوله مخصوص برای جادادن محلول رنگی
، یک سلول فتوالکتریک و یک گالوانومتر دارد.
اندازه گیری غلظت یک محلول
به دو روش می توان غلظت یک محلول را اندازه گیری کرد:
الف) از راه اندازه گیری نوری که از محلول رنگی خارج می شود و
به آن ،Transmitance ،یا عبور می گویند؛
ب) اندازه گیری مقدار نوری که جذب محلول رنگی می شود و به آن دانسیته اپتیک (OPTICAL DENSITY) O.D یا آبسوربنس می گویند.
الف) دانسیته اپتیک یا آبسوربنس
نوری که از یک محلول رنگی عبور می کند مقداری از آن جذب محلول رنگی می شود .
اگر Io شدت نور اولیه و I شدت نور خارج شده از محلول باشد بنابراین I a شدت نوری است که جذب محلول رنگی گردیده است.
Ia = I – Io
Log Io – log I =OD = Absorbanc
logI/I0=OD
(1) log I0/I=OD
جذب از دو قانون پیروی می کند:
مطابق قانون بیرولامبرت (BEER & LAMBERT) هنگامیکه نور یک رنگ از محلول رنگی عبور میکند مقدار نوری که به وسیله محلول جذب می شود ویا مقدار نوری که از محلول خارج می شود؛
به غلظت ماده رنگی موجود در محلول
به ضخامت لوله ایکه نور از آن عبور کرده بستگی دارد گردد.یعنی:
OD=KCL = جذ ب
قانون بیر لامبرت
logIo/I= KCL
که در آن K ضریب جذب ماده مورد آزمایش، C غلظت جسم مورد آزمایش و L قطر لوله می باشد و چون معمولاً قطر لوله را مساوی یک سانتی متر اختیار میکنند بنابراین خواهیم داشت: OD= log I0/I=KC
K یا ضریب جذب ماده برای مواد مختلف فرق می کند و به آسانی قابل اندازه گیری است.
میزان عبور یا ترا نسمیتا نس
ب) ترانسمیتانس ) عبور) :
مقدار نوری است که از محلول رنگی مورد آزمایش خارج می شود،
اگر شدت نور اولی I0 و نور خارج شده I باشد:
I0-I=Ia
I/I0=T Log I0/I=Log1/T OD=Log1/T
مثال در مورد جذب وعبور
اگر نور وارد شده در محلول 100 و نور خارج شده از آن 10 درصد نور اولیه باشد خواهیم داشت:
OD= log 100 –log 10
OD= 2-1
OD =1
نحوه درجه بندی دستگاه اسپکتروفوتومتر
روی صفحه مدرج دستگاه در قسمت بالا درصد نور عبور کرده یا ترانسمیتانس
در قسمت پائین درست در مقابل درجات ترانسمیتانس OD،یا ابز ربنس قرار می هند.
، درجات میزان عبور همه با هم مساوی است.
درجات O D به علت لگاریتمی بودن نامساوی هستند.
روش کار و اندازه گیری جذب یک محلول
آزمایش 1 – بهترین طول موج برای اندازه گیری غلظت یک محلول رنگی چیست؟
می دانید که از تجزیه نور سفید نورهای مختلف رنگی حاصل می شود که در قسمت مرئی دارای طول موجهای زیر می باشد.
بنفش 420-430، آبی470-490، سبز520-550 ، زرد580
انتخاب طول موج مناسب جهت اندازه گیری جذب
محلول مورد آزمایش رادرمعرض تابش نورهایی با طول موجهای مختلف قرارداده OD های قرائت شده را یادداشت می کنیم.
نمودار جذب برحسب طول موج را رسم می کنیم.
طول موج منا سب ،طول موجی است که ماکز یمم جذب را دارد.
روش انجام آزمایش
آزمایش 2 – جهت رسم منحنی دانسیته اپتیک بر حسب غلظت های مختلف:
6 لوله آزمایش انتخاب کرده آن ها را از 1 تا 6 شماره گذاری کنید
به ترتیب در آنها 0 ؛1، 2، 4، 6 و 8 میلی لیتر محلول بروموفنل( mg/L10 ) بریزید.
سپس به ترتیب 10 ، 9 ،8 ، 6 ،4 و2 میلی لیتر آب مقطر بریزید.
صفر دستگاه را با لوله شماره 1 میزان کنید.
مقدار دانسیته اپتیک لوله های بعدی را در 580 میلی میکرون اندازه بگیرید
منحنی تغییرات دانسیته اپتیک بر حسب غلظت محلول رسم نمائید.
در صورتیکه منحنی از قانون بیر متابعت کند به صورت یک خط مستقیم خواهد بود.
دو نکته: عملی
1 – در قرائت OD نتایج، زمانی قابل اطمینان است که:
0.7 < OD <0.1
بنابر این غلظت مجهول اگر زیاد باشد باید آنرا با حلال مربوطه طوری رقیق نمود که OD آن در حدود بیان شده قرار گیرد.
در این صورت ضریب رقت را باید در محاسبه منظور نمود.
2 – اگر قرائت OD چندین مجهول پشت سر هم بخواهد انجام گیرد در فواصل قرائت باید دستگاه را با شاهد (BLANK) روی صفر OD تنظیم نمود.
روشهای جدا کردن مواد از یکدیگر
دیالیز ، با استفاده از کیسه های سلوفان.
ژل فیلتراسیون “GEL FILTRATION”..
کروماتوگرافی های مختلف (لایه نازک – جذبی – تعویض یونی – کاغذی)
الکتروفورز
آزمایش قندها یا گلوسیدها
قندها یا ساکاریدها را به سه دسته تقسیم می کنند:
دسته اول – منوساکاریدها
پلی الکلهای 3 تا 7 کربنی هستند که یکی از عاملهای الکلی به عامل کربنیل تبدیل شده است و به ترتیب آنها را تریوز – تتروز- پنتوز- هگزوز- هپتوز می نامند.
منوساکاریدها ممکن است دارای عامل آلدئیدی یا ستنی باشند که در حالت اول آلدوز و در حالت دوم ستوز نامیده می شوند.
مهمترین پنتوزها: آرابینوز – گزیلوز – ریبوز و…
مهمترین هگزوزها: گلوکز-مانوز-گلاکتوز-فروکتوز … می باشند.
دسته دوم – الیگوساکاریدها
از الیگو ساکاریدها، دی ساکاریدها دارای اهمیت بیشتری هستند.
بعضی از دی ساکاریدها دارای خاصیت احیاکنندگی می باشند مانند: مالتوز و لاکتوز.
برخی دیگر دارای خاصیت احیاء کنندگی نیستند. مانند ساکارز یا سوکروز.
دسته سوم – پلی ساکاریدها
مهمترین پلی ساکاریدها شامل نشاسته، سلولز و گلیکوژن می باشد.
واکنش رنگی قندها
مهمترین واکنش های رنگی قندها به قرار زیرند:
1 – واکنش مولیش (Molisch) : - نفتل + اسید سولفوریک غلیظ ؛
این واکنش برای تمام ساکاریدها مثبت است.
2 – واکنش بارفود (Barfoed) : استات مس در اسید استیک 1%؛
این واکنش مخصوص منوساکاریدهاست.
3 – واکنش بیال (Bial)اورسینول در اسید کلریدریک + FeCl3 ؛
به پنتوزها مانند گزیلوز جواب مثبت می دهد.
–4 واکنش سلیوانف (Selivanoff) : رزورسینول در HCl ؛
این واکنش مخصوص ستوهگزوزها مانند فروکتوز می باشد آلدوهگزوزها بکندی واکنش می کنند.
5 – واکنش بندیکت (Benedict) : محلول قلیائی سیترات مس ؛
این واکنش به تمام قندهای احیاء کننده جواب مثبت میدهد مانند منوساکاریدها (گلوکز –فروکتوز) و دی ساکاریدهای احیا کننده نظیر لاکتوز و مالتوز
محلول فهلینگ (Fehling) نیز نظیر بندیکت واکنش می دهد.
6– واکنش ید (Iodine test) :
محلول ید با نشاسته و گلیگوژن ایجاد رنگ می نماید.
در حالیکه با سلولز و دکسترین و اینولین رنگی نمی دهد.
7
–7 واکنش تشکیل اوزازون (Osazone formation منو و دی ساکاریدهای احیاء کننده با محلول فنیل هیدرازین قلیایی تولید بلوریهای مشخص می نمایند. اوزازون گلوکز – فروکتوز و مانوز شبیه یکدیگرند . بعضی از اوزازون ها مانند لاکتوزازون در گرما محلولند.
واکنشهای اختصاصی قندها
1 – واکنش مولیش
این واکنش به تمام قندها جواب مثبت می دهد.
قندها در مجارت اسیدهای غلیظ آب از دست داده و تبدیل به فورفورال یا مشتقات آن می شوند؛
این جسم با محلول الکلی آلفا- نفتل ماده رنگی ایجاد می کند.
خلاصه واکنش ها به قرار زیر است:
2 – واکنش بارفود (Barfoed)
این واکنش وجود منوساکاریدها را مشخص می نماید.
به 4 میلی لیتر معرف بارفود یک میلی لیتر از قند مورد آزمایش اضافه می کنیم.
لوله آزمایش را به مدت 3 تا 5 دقیقه در آب جوش قرار می دهیم.
در منوساکاریدها رسوب قرمز اکسید کوئیورو در ته لوله تشکیل می گردد
.
این آزمایش را با یک پنتوز (گزیلور)، گلوکز یا فروکتوز، لاکتوز انجام دهید.
3-– واکنش مور (Moor)
این واکنش به قندهای احیاء کننده جواب مثبت می دهد.
، به 5 میلی لیتر محلول قند 1 میلی لیتر سود 10% افزوده و آنرا در آب جوش قرار می دهیم.
بعد از 5 دقیقه ایجاد رنگ قهوه ای و بوی مشخص دلیل بر مثبت بودن واکنش است.
محلول گلوکز، مالتوز، ساکارز، و نشاسته را آزمایش کنید.
4 – واکنش بندیکت (Benedict)
به قندهای احیاء کننده جواب مثبت می دهد.
به 5 میلی لیتر معرف بندیکت کیفی 8 تا 10 قطره از محلول مورد آزمایش اضافه کنید.
برای 5 دقیقه در آب جوش بگذا رید .
پس از سرد شدن در صورتی که رسوب سبز، زرد یا قرمز ایجاد شود دلیل بر وجود قند احیاء کننده است.
این آزمایش را بر روی گلوکز، فروکتوز، گزیلوز، ساکارز و مالتوز انجام دهید.
-5واکنش فهلینگ (Fehling)
فهلینگ A محتوی سولفات مس است.
فهلینگ B محتوی تارترات سدیم و پتاسیم و کمی هیدروکسید سدیم است.
1میلی لیتر فهلینگ A و 1 میلی لیتر فهلینگ B را مخلوط می کنیم.
2 میلی لیتر از محلول مورد آزمایش روی آن ریخته و می جوشانیم.
اگر محلول مورد آزمایش قند احیا کننده باشد رسوبی تولید می شود؛
که رنگ آن از زرد به قرمز متغییر است
–6 واکنش سلیوانوف (Selivanoff)
این واکنش به ستوزهائی که دارای عامل ستنی هستند جواب مثبت می دهد.
به 5 میلی لیتر معرف سلیوانف 5 قطره از محلول قند مورد آزمایش افزوده آنرا در حمام ماری جوشان برای 90 ثانیه و یا روی شعله مستقیم برای 45 ثانیه حرارت می دهیم .
رنگ یا رسوب قرمز دلیل وجود ستوز است.
اگررسوب را در الکل اتیلیک حل کنیم الکل به رنگ قرمز در می آید.
واکنش سلیوانف بسیار حساس است.
اگر قندهای دیگری با غلظت زیاد یعنی بیش از 2% بدان اضافه شود همین رنگ را تولید می نماید.
ساکارز اگر کمی بیشتر از زمان ذکر شده حرارت داده شود چون هیدرولیز می شود لذا به واکنش سلیوانف جواب مثبت می دهد.
.
فرمول احتمالی ترکیب قرمز رنگ در آزمایش سلیوانف :
–7 واکنش بیال (Bial)
برای تشخیص پنتوزها از واکنش بیال و تائوبر استفاده می شود.
بر روی 5 میلی لیتر معرف بیال 2 میلی لیتر از محلول مورد آزمایش اضافه می کنیم
.به ملایمت حرارت می دهیم تا بجوشد سپس آنرا سرد می کنیم.
رنگ آبی تا سبز وجود پنتوز را مشخص می کند.
-8واکنش تشکیل اوزازن
این واکنش مخصوص تمام منوو دی ساکاریدهای احیاء کننده است.
درهر یک از چهار لوله 2 میلی لیتر از معرف فنیل هیدرازین.
و سپس بترتیب 2 میلی لیتر از قندهای آرابینوز، گلوکز، لاکتوز و مالتوز.
لوله ها را برای مدت 15 تا 30 دقیقه در آب جوش قرار می دهیم.
سپس در حرارت آزمایشگاه خنک می کنیم .
با یک پیپت یک قطره از رسوب را روی لام گذارده و با لامل آنرا می پوشانیم.
در زیر میکروسکوپ بلورهای آنها را مشاهده می کنیم.
زمان تشکیل اوزازن برای قندهای مختلف به شرح زیر است:
فروکتوز 2 دقیقه
گلوکز 15-19 دقیقه
لاکتوز پس از سرد شدن کاملاً سرد می کند.
مالتوز پس از سرد شدن کاملاً رسوب می کند.
ساکارز در مدت آزمایش رسوبی ایجاد نمی کند
بلورهای اوزازان از بالا و به ترتیب عبارتند از:
گلوکزازن گالاکتوزان
آرابینوزازن لاکتوزازن
مالتوزازن گزیلوزازن
–9 هیدرولیز ساکارز
در 3 میلی لیتر از محلول ساکارز یک تکه کاغذ قرمز کنگو ابیاندازید.
قطره قطره اسید کلریدریک 1% بیافزائید تا کاغذ به رنگ آبی درآید (PH در حدود 3-2).
مخلوط را برای مدت 5 دقیقه بجوشانید.
روی محلول هیدرولیز شده واکنشهای بندیکت – بارفود – سلیوانف را انجام داده و نتیجه را شرح دهید.
-10واکنش ید
این واکنش مخصوص پلی ساکاریدهایی نظیر نشاسته و گلیکوژن است.
به چند میلی لیتر از چسب نشاسته یک قطره محلول ید – یدوره اضافه می کنیم رنگ آبی بنفش تولید می شود.
اگر مخلوط را بجوشانیم بیرنگ شده و پس از سرد کردن رنگ آبی دوباره ظاهر می شود.
ید با گلیکوژن رنگ قهوه ای تولید مینماید.
تعیین مقدار گلوکز یا سایر قندهای احیاکننده به وسیله معرف بندیکت کمی
تئوری
محلول بندیکت کمی شامل مواد زیر است؛
سولفات مس، کربنات سدیم، سیترات سدیم، تیوسیانات پتاسیم و فروسیانور پتاسیم.
مس دو در محیط قلیایی و در مجاورت قندهای احیا کننده به مس یک ظرفیتی (Cu2O) تبدیل می شود.
برای تشخیص یک قند مجهول از جدول زیر استفاده میکنیم.
تعیین تیتر محلول بندیکت
در یک ارلن مایر صد میلی لیتری 20 میلی لیتر بندیکت کمی می ریزیم.
3 تا 5 گرم کربنات سدیم و کمی خرده شیشه بر روی آن می افزاییم،.
آن را در روی شعله به ملایمت می جوشانیم.
از بورت گلوکز 2 گرم در لیتر قطره قطره در حال جوش اضافه می کنیم تا رنگ آبی محلول از بین برود.
تیتر محلول بندیکت از رابطه زیر بدست می آید:
t.N
T=
N
تیترT, ,عبارت است از:
مقدارگرم قند احیا کننده ای که بتواند یک لیتر محلول بندیکت را احیا نماید.
دررابطه ؛ T= t.n/N
t غلظت گلوکز (2 گرم در هزار)
n میلی لیتر گلوکز مصف شد
N میلی لیتر بندیکت (ml 20) است.
تعیین مقدار قند احیا کننده
قنداحیاء کننده مورد آزمایش را در بورت ریخته.
عملیات را عیناً مانند آزمایش قبل (تیتراسیون بندیکت) انجام می دهیم .
غلظت قند را بر حسب گرم در لیتر از تساوی زیر بدت می آوریم:
T.N
X=
n
T تیتر بندیکت و N حجم بندیکت مورد مصرف (ml 20) و n لیتر محلول قند مصرف شده است.
تبصره : می توان اندازه گیری غلظت گلوکز را با محلول فهلینگ در مجاورت فروسیانور پتاسیم نیز انجام داد ولی محلول بندیکت به علت خواص زیر بر محلول فهلینگ رجحان دارد:
1 – خاصیت قلیایی محلول بندیکت از محلول فهلینگ کمتر است لذا باعث پلیمریزاسیون شدن قندها نمی شود.
2 – محلولهای احیاء کننده ضعیف مانند اسید اوریک بر محلول بر محلول بندیکت اثر نداشته در صورتیکه محلول فهلینگ را احیاء می نماید.
بنابر این سنجش گلوکز در مجاورت احیا کننده های ضعیف دیگر (مانند ترکیب ادرار) به کمک بندیکت به سهولت انجام پذیر است.
گلوکزاوری
گلوکز اوری glucosuria یعنی وجود گلوکز در ادرار .
گلیکوز اوری glycosuria یعنی وجود هر نوع قندی .
جواب مثبت کاذب ممکن است در بیمارانیکه سالیسیلات، مورفین و بعضی از داروهای دیگر خورده اند، دیده شود.
به طور معمول یک انسان سالم حداکثر یک گرم گلوکز از راه ادرار دفع مینماید
درگلوکزاوری مقداری گلوکز دفع شده از این مقدار بیشتر است.
گاهی گلوکز به طور اتفاقی از ادرار دفع می شود که در حالات، هیجان، شوک، تحریک، ورزشکاران در ورزش های سنگین،
15 درصد از بیمارانی که گلوکز در ادرار دارند، مربوط به بیماری قند نیست.
بهترین تست برای گلوکز؛ تست گلوکز اکسیداز است.
گلوکز در اثر آنزیم گلوکز اکسیداز تبدیل به اسید گلوکونیک gluconic و آب اکسیژنه (هیدروژن پراکسید) می شود .
هیدروژن پراکسید حاصل، در مجاورت پراکسیداز ، اورتولوئیدین را اکسید (که آبی رنگ است) می نماید.
جستجوی گلوکز و قندهای احیا کننده به روش بندیکت
تهیه معرف بندیکت برای گلوکز
3/17 گرم سولفات مس در 100میلی لیتر آب حل کنید.
173 گرم-سیترات تری سدیک دو آبه و100گرم کربنات سدیم ایندر، در600 میلی لیترآب بکمک حرارت حل کرده به حجم 1 لیتر برسانید.
دو محلول فوق را با یکدگر مخلوط وبه حجم یک لیتر برسانید.
جستجوی گلوکز در ادرار
طریقه آزمایش:
5 میلی لیتر معرف بندیکت در لوله آزمایش ریخته و روی آن 8 تا 10 قطره ادراربریزید.
1-2 دقیقه روی شعله نگاه دارید..
اگر گلوکز در ادرار زیاد باشد تمام محتوی لوله زرد آجری شده و رسوب می کند ، اگر مقدار آن متوسط باشد دارای رسوب و رنگ آن کاملاً آجری می شود .
اگر مقدار آن کم باشد، زرد مایل به سبز می شود
لیپیدها یا چربی ها
تعریف – لیپیدها یا چربیها مواد طبیعی حیوانی یا گیاهی هستند که:
در آب نامحلول اند.
در بعضی از حلالهای آلی مانند:
اتر – کلروفرم – بنزن و الکل گرم و غیره حل می شوند.
طبقه بندی لیپیدها
لیپدیها را به دسته های مختلف زیر طبقه بندی می کنند.
1- اسیدهای چرب
2 – چربیهای خنثی (گلیسیریدها)
3 – مومها
4- فسفولیپیدها الف- گلیسروفسفولیپیده
ب- اسفنگوفسفولیپیدها
5 – استروئیدها
آزمایشهای لیپیدها
1 – حلالیت
مقدار جزئی پیه گوسفند را در هر یک از چهار لوله آزمایش بریزید.
به هر کدام به ترتیب 3 میلی لیتر از حلالهای آب – الکل اتیلیک ـ اتروکلروفرم بیلفزائید.
ومیزان حلالیت یا عدم حلالیت چربی را در هر کدام مشاهد ه و گزارش کنید.
سپس محتوی لوله چربی و الکل اتیلیک را گرم نموده و نتیجه را یادداشت کنید.
2 – هیدرولیز گلیسریدها
25 میلی لیتری آب و 50 میلی لیتر سود 10% و 4 میلی لیتر از یک تری گلیسرید (پیه ذوب شده)در یک بشر می ریزیم .
مدت یک ساعت مخلوط را می جوشانیم. باید از کم شدن حجم محلول جلوگیری نمود.
تری گلیسرید هیدرولیزوصابونی می شود.
واکنش صابون با یون کلسیم
به 5 میلی لیتر محلول صابون 5 میلی لیتر آب افزوده
سپس چند میلی لیتر کلرور کلسیم اضافه می کنیم
رسوبی تشکیل می شود این رسوب چیست؟
چرا صابون در آب سخت ،خوب کف نمی کند ؟
واکنش صابون با اسید
20 تا 25 میلی لیتر از محلول صابون را در یک بشربریزید.
بتدریج آنقدر اسید کلریدریک به آن بیافزایید و به هم بزنید تا دیگر رسوبی تشکیل نشود.
محلول را سرد کنید، در سطح آن اسید چرب جمع می شود.
3 – آزمایش چربیهای اشباع نشده
الف) واکنش چربیهای اشباع نشده با ید.
چند قطره روغن زیتون را در 2 تا 3 میلی لیتر کلروفرم حل کنید.
چند قطره محلول الکلی کلرور مرکوریک 5 درصد و چند قطره محلول الکلی ید رقیق بدان بیافزائید.
رنگ قهوه ای ید از بین می رود. ( Cl2Hg نقش کاتالیزور را دارد).چرا؟
ب) اکسیداسیون چربی های اشباع نشده به وسیله پرمنگنات پتاسیم
چند قطره روغن زیتون را در چند میلی لیتر محلول کربنات سدیم حل کنید.
سپس چند قطره محلول رقیق پرمنگنات پتاسیم بدان بیافزائید.
رنگ پرمنگنات از بین می رود (کربنات سدیم با ایجاد PH قلیایی موجب حل شدن چربی در فاز آب می شود).
ازبین رفتن رنگ پرمنگنات به علت اکسیداسیون چربیهای اشباع نشده است که در محل پیوند های دوگانه چربیها و اسیدهای چرب انجام می گیرد
ج) تشخیص چربیهای اشباع شده از چربیهای اشباع نشده
چند قطره اسید اولئیک یا روغن زیتون را در لوله آزمایش می ریزیم.
و یک تا دو قطره محلول اسید اسمیک 2% بدان می افزاییم، رنگ سیاهی ایجاد می شود.
این آزمایش با اسید پالمیتیک خالص منفی خواهد بود.
اسید اسمیک محل پیوندهای دو گانه را اکسید می کند .
استرهای اسید اسمیک که سیاه رنگ می باشند تشکیل می شود:
4 – شناسایی گلیسرول درترکیب یک گلیسرید
در لوله آزمایش کاملاً خشکی یک تا دو قطره روغن زیتون می ریزیم.
و سپس قدری پودر سولفات پتاسیم بدان می افزاییم.
و مخلوط را روی شعله حرارت می دهیم .
ابتدا بی سولفات پتاسیم در 200 درجه حرارت ذوب می شود.
و سپس در اثر حرارت روغن زیتون تجزیه می شود و گلیسرول آن آزاد می گردد.و در اثر بی سولفات پتاسیم که به شدت آبگیر است، گلیسرول تبدیل به آلدئیدی بنام اکرولئین می شود.
بخارات سفید اکرولئین که از لوله متصاعد می شود دارای بوی مشخصی است و باعث تحریک دستگاه تنفسی می گردد.
5 – روشهای مختلف تشخیص گلیسرول
گلیسرول را به چند طریق می توان مشخص کرد:
الف) تبدیل گلیسرول به اکرولئین و تشخیص اکرولئین به وسیله بوی مخصوص آن و یا به وسیله معرف شیف (Schiff).
ب) تبدیل گلیسرول به آلدئید گلیسریک و دی هیدروکسی استن
ب) تبدیل گلیسرول به آلدئید گلیسریک و دی هیدروکسی استن
اگر 1 میلی لیتر گلیسرول را با 20 قطره آب برم مخلوط کنیم .
و برای مدت 20 دقیقه در آب جوش بگذاریم رنگ محلول کاملاً از بین می رود.
در صورتیکه رنگ به کلی از بین نرود، باز محلول را می جوشانیم تا بیرنگ شود.
در این عمل مخلوطی از آلدئیدگلیسریک و دی اکسی استن در اثر اکسیداسیون گلیسرول به وسیله آب برم به وجود می آید.
کلسترول
کلسترول در اکثر نسوج حیوانی یافت می شود.
و به مقدار زیاد در نسج عصبی و صفرا وجود دارد.
تحقیق روی بیوسنتزو متابولیسم این استرول اخیراً خیلی مورد توجه قرار گرفته است.
زیرا در آترواسکلروز (Atherosclersis) مقدار این ترکیب خیلی زیاد می شود.
[
1]
شنا سایی کلسترول
الف) آزمایش سالکوفسکی (Salkowski)
چند میلی گرم از ماده را در لوله آزمایش ریخته ودر 3 میلی لیتر کلروفرم حل کنید.
3میلی لیتراسید سولفوریک خالص اضافه کرده و به آرامی تکان دهید.
بگذارید دو لایه محلول جدا شود رنگ ظاهر شده را یادداشت کنید.
لایه کلروفرمی کدام یکی است؟
رنگ لایه اسید سولفوریکی را بنویسید.
ب) آزمایش لیبرمن – بورشارد (Liebermann-Burchard)
یک نمونه محلول کلروفرمی کلسترول مانند آزمایش قبل تهیه کنید.
و به آن 10 قطره انیدرید استیک و 2 قطره اسید سولفوریک غلیظ اضافه کرده به آرامی تکان دهید وبگذارید 5 دقیقه بماند.
رنگ حاصله داخل لوله را یادداشت کنید.
این دو آزمایش را از نظر حساسیت با یکدیگر مقایسه کنید.
ج) رسوب کلسترول بادیژیتونین
دو میلی گرم کلسترول را در 2 میلی لیتر الکل حل کنید.
این محلول را به 2 میلی لیتر محلول الکلی 1% دیژیتونین اضافه کنید.
رسوب تشکیل شده کلسترول آزاد است.
7 – اندیس صابونی کردن (Saponification)
تعریف – عدد صابونی ؛مقدار میلی گرم پتاسی است که برای صابونی کردن کردن یک گرم چربی لازم است.
عدد صابونی اطلاعات مفیدی از چگونگی اسیدهای چربی که با گلیسرول ترکیب شده اند بما می دهد.
کار برد عدد صابونی
مقدار پتاسی که برای صابونی کردن اسیدهای چرب مختلف لازم است با وزن ملکولی آنها نسبت معکوس دارد.
برای هر نوع چربی طبیعی عدد صابونی شناخته شده است.
با اندازه گیری عدد صابونی می توان به درجه خلوص چربی ها پی برد.
در کنترل و بازرسی مواد غذایی و شناخت تقلب چربی ها، اندازه گیری اندیس صابون متداول می باشد.
8 – اندیس ید (Iodine Number)
تعریف – اندیس ید چربی ها عبارت از مقدار گرم یدی است که صد گرم چربی می تواند جذب کند.
ید جذب شده پیوندهای دو گانه اسیدهای چرب غیراشباع را، اشباع می کند .
چربی هایی مایع و غنی از اسیدهای چرب غیر اشباع نسبت به چربی های جامد یا نیمه جامد، اندیس ید بزرگتری خواهند داشت.
صابونی کردن چیست؟
صابونی کردن :هیدرولیز یک استر به الکل و اسید و یا نمک مربوطه است.
در مورد چربیها صابونی کردن واکنش بین قلیایی و چربی است که ؛
منجر به تشکیل صابون و گلیسیرین می شود.
از طرف دیگر اصطلاح صابونی کردن به هر نوع هیدرولیز چربی نیز اطلاق می شود.
اندیس صابونی
اندیس صابونی که بعضی مواقع عدد صابونی نیز نامیده می شود؛
عبارتست از مقدار میلی گرم هیدروکسید پتاسیمی که برای صابونی کردن یک گرم روغن لازم است.
اندیس صابونی مربوط به میانگین وزن مولکولی روغن است.
معادل صابونی[1] – عبارتست از مقدار گرم روغنی که به وسیله یک مولکول گرم (108/56 گرم) هیدروکسید پتاسیم صابونی می شود.
اندیس خنثی و معادل خنثی[2]- به ترتیب همان تعاریف فوق می باشد که به جای گلیسیریدها اختصاصاً برای اسیدهای چرب بکار می روند.
[1] – Saponification equivalent.
[2] – Neutralization Vilue, Neutralization equivalent.
اندازه گیری اندیس صابونی
اساس روش:
حرارت دادن هیدروکسید پتاسیم با مقدار معلوم روغن تا تکمیل صابونی شدن؛
و تیتراسیون قلیای اضافی به وسیله اسید استاندارد است.
اندیس صابونی از مقدار قلیائی که با نمونه واکنش می دهد محاسبه می شود.
C3H5(COOR)3 + 3KOH→ 3RCOOK + C3H5(OH)3
مواد و محلولهای لازم
محلول تقریباً یک دوم نرمال پتاس الکلی
محلول اسید کلریدریک یک دوم نرمال دقیقاً استاندارد شده
شناساگر فنل فتالئین
وسایل لازم:
بالن 250 میلی لیتری
بن ماری جوش
مبرد تر جیحا حلزونی
روش کار
اگر روغن مایع نباشد آنرا ذوب کرده و با کاغذ صافی صاف کنید .
حدود 2 گرم روغن صاف شده دقیقاً وزن کرده وآنرا به بالن 250 میلی لیتری منتقل نمائید.
با یک پیپت دقیقاً 25 میلیمتر محلول پتاس الکلی نیم نرمال به بالن اضافه کنید .
بالن را به مدت یک ساعت در حالت رفلو قرار دهید.
همزمان یک شاهد را اجرا کنید.
پس از یک ساعت با محلول اسید نیم نرمال تیتر( فنل فتالئین ) کنید.
. اندیس صابونی را از رابطه زیر بدست آورید:
28.05(A-B)
W
A = مقدار میلی لیتر اسید کلریدریک 5/0 نرمال بکار رفته برای تیتراسیون شاهد.
B= مقدار میلی لیتر اسید کلریدریک 5/0 نرمال بکار رفته برای تیتراسیون نمونه.
W = وزن روغن بر حسب گرم.
اندیس پراکسید
اندازه گیری اندیس پراکسید بهترین وسیله موجود برای ارزیابی اکسیداسیون روغن می باشد.
زیرا وقتی که در روغن پراکسیدها یافت شوند مسلماً در آن اکسیداسیون بوجود آمده است.
اما سوالی که جواب دقیق به آن مشکل است اینستکه روغن تا چه حد اکسید شده است.
اندیس پراکسید را معمولاً با روش یدومتری تعیین میکنند .
دو منبع اصلی خطا با روش یدومتری عبارتند از:
الف – جذب ید در باندهای اشباع نشده مواد چرب
ب – آزاد شدن ید از یدور پتاسیم به علت اکسیژن موجود در محلول تیترشونده.
الف – خطای ناشی از اکسیژن
اکسیژن محلول در نمونه، حلال و سایر مواد واکنش کننده باعث آزاد شدن ید ازیدور پتاسیم می شود
4I+ O2 2I2+2H2O
این واکنش که به نام واکنش خطای اکسیژن نامیده شده است، باعث می شود که اندیس پراکسید بیش از حد واقعی بدست آید.
(روش سرد)
نمونه شماره 1 141 – 113 116 116
(روش سرد)
نمونه شماره 2 150 123 121 121 –
(روش داغ)
نموه شماره 1 135 – 115 113 112
(روش داغ)
نمونه شماره 2 139 116 110 112 112
حلال مناسب برای اندازه گیری پر اکسید
بهترین حلال مخلوطی از اسید استیک و کلروفرم به نسبت حجمی (2+ 3) است
در حال حاضر نیز از این مخلوط استفاده می شود.
در صورتی که نسبت اسید استیک به کلروفرم تغییر کند نتیجه آزمایش ممکن است تغییرنماید.
ج – شرایط واکنش
زمان واکنش در روشهای مختلف از یکدقیقه تا یک ساعت است.
درجه حرارت آزمایشگاه تا نقطه جوش محلول پیشنهاد شده است.
در مورد نمونه هائیکه اندیس پراکسید بالائی دارند، واکنش یکساعته نتایج بهتری می دهد.
محلولهای لازم در اندازه گیری اندیس پراکسید
مخلوط اسید استیک و کلروفرم2) : 3 .(
محلول یدور پتاسیم اشباع شده تازه.
محلول تیوسولفات سدم 1/0 نرمال
محلول شناساگر نشاسته ،محلول 1 درصد.
روش اندازه گیری اندیس پرکسید
5گرم نمونه در ارلن وزن کنید.
30 میلی لیتر مخلوط اسید استیک وکلروفرم.
5/0میلی لیتر محلول یدید پتاسیم.
30میلی لیتر آب مقطر.
با تیو سولفات 1/0 تیتر کنید ، پس از زایل شدن رنگ زرد ،نشاسته اضافه کنید
تا از بین رفتن رنگ آبی ادامه دهید.
محاسبه
اندیس پراکسید بر حسب میلی اکی والان پراکسید در 1000 گرم نمونه برابر است با:
S×N×1000
W
S = میلی لیتر تیوسولفات مصرفی
= Nنرمالیته محلول تیوسولفات سدیم
W = وزن نمونه بر حسب گرم
اسیدهای آمینه و پروتئین ها
پروتئین ها پلی مرهای اسیدهای آمینه می باشند.
وزن ملکولی پروتئن ها زیاد می باشد.
بیست اسید آمینه مختلف در پروتئینهای حیوانی و گیاهی شرکت می کنند.
واکنشهای اختصاصی اسیدهای آمینه
1 – حلالیت
حلالیت اسیدهای آمینه در آب متفاوت است.
در حدود 50 میلی گرم از اسیدهای آمینه گلیسین، تیروزین را در دو لوله جداگانه می ریزیم .
به هر یک 10 ملی لیتر آب مقطر افزوده و خوب تکان می دهیم
حلالیت این دو را در آب مشاهده ونتیجه را گزارش می کنیم.
2 – واکنش گزانتو پروتئیک (Xanthoproteic)
یک میلی لیتر از اسید آمینه گلیسین و یک میلی لیتر تیروزین (که قبلاً تهیه کرده ایم) در دو لوله جداگانه می ریزیم.
یک میلی لیتر اسید نیتریک غلیظ افزوده و می جوشانیم .
رنگ محلول تیروزین زرد می شود چنانچه کمی سود غلیظ به آن اضافه کنیم محلول نارنجی می گردد.
ایجاد رنگ زرد مربوط به حلقه بنزنی است.
3 – واکنش میلون (Millon)
2 تا 3 میلی لیتر از محلول گلیسین و تیروزین را جداگانه در دو لوله آزمایش می ریزیم. و چند قطره از معرف میلون (نیترات و نیتریت جیوه در اسید نیتریک) به هر یک اضافه می کنیم .
محلول را می جوشانیم لوله محتوی تیروزین قرمز رنگ می شود.
پیدایش این رنگ مربوط به وجود بنیان حلقه فنلی تیروزین است.
5 – واکنش نین هیدرین (Ninhydrine)
کلیه اسیدهای آمینه که دارای آلفا آمینوی آزاد هستند (به استثنای پرولین و هیدروکسی پرولین) بانین هیدرین (هیدرات تری ستوهیدرندن)واکنش می دهند.
انیدرید کربنیک و آمونیاک آزاد می شود.
یک ترکیب آبی رنگ ایجاد می شود.
روش آزمایش با نین هیدرین
3 میلی لیتر از محلول یکی از اسیدهای آمینه را در لوله آزمایش بریزید.
چند قطره از محلول 0.1 درصد نین هیدرین در استن به آن اضافه کنید.
لوله را به مدت 10 دقیقه در حمام آب جوش قرار دهید.
ر نگ آبی حاصل را مشاهد کنید.
6 – آزمایش اسیدهای آمینه گوگرد دار (Sulfur Test)
در یک لوله آزمایش مقدار کمی سیستین ودرلوله دیگرمتیونین بریزید.
بهر کدام 5 میلی لیتر سود 10% اضافه کنید.
.لوله ها را 15 دقیقه در حمام آب جوش قراردهید.
10 قطره استات سرب 5% بهر یک اضافه ی کنید.
رنگ محلول تیره شده به سیاهی می گراید.
به آرامی 2 میلی لیتر اسید کلریدریک غلیظ اضافه کنید.
بوی نامطبوعی استشمام میشود(؟)
7 – آزمایش ساکا گوچی (Sakaguchi)
یک میلی لیتر محلول آرژی نین را در لوله آزمایش تهیه می کنیم .
مقدار جزئی محلول الکلی آلفانفتل و 2 تا 3 قطره محلول هیپوبرمیت سدیم و مقدار کمی هیدروکسید سدیم بدان می افزائیم.
رنگ قرمزی ایجاد می شود.
این واکنش مربوط به ریشه گوانیدین می باشد و برای یک در میلیون محلول آرژی نین مثبت است.
این آزمایش را با محلول اسیدهای آمینه تیروزین یا تریپتوفان نیز انجام دهید.
تشخیص و تعیین مقدار یک اسید آمینه به وسیله فرمل تیتراسیون
ابتدا به وسیله فرمالدئید عامل آمینی را مهار کرده.
سپس جسم حاصل را مثل اسید آلی می سنجیم .
این آزمایش به نام روش سورنسن Soraensen یا فرمل تیتراسیون نامیده می شود.
NH2 HN-CH2OH HOCH2-N-CH2OH
H2C=O H2C=O
R-C-COO- R-C-COO- R-C-COO
H H H
تعیین مقدار یک اسید آمینه
در یک ارلن کوچک 10 میلی لیتر از اسید آمینه می ریزیم.
10 میلی لیتر فرمل باPH حدود 9 1اضافه می کنیم.
با سود 1/0 نر مال تیترمی کنیم تا رنگ صورتی کم رنگ مجدداً ظاهر گردد
از مقدار سود مصرفی غلظت اسید آمینه را محاسبه میکنیم.
1به روی 20 میلی لیتر فرمل در مقابل فنل فتالئین قطره قطره سود دسی نرمال می افزائیم تا رنگ صورتی کمرنگ ایجاد شو.د PH= 9.
محا سبه مقدار میلی گرم اسید آمینه
n=میلی لیتر سود مصرف شده
M= وزن مولکولی اسید آمینه
نقطه ایزو الکتریک اسیدهای آمینه و پروتئینها
مقدمه
پروتئینها، اسیدهای آمینه، فسفولیپیدها و …
در ساختمان مولکولی خودعامل اسیدی و قلیایی توائم دارند
.این ترکیبات دارای خاصیت آمفوتری هستند .
یعنی هم خاصیت اسیدی دارند وهم خاصیت بازی.
تعریف PH ایزو الکتریک
یونیزاسیون اسیدهای آمینه و پروتئینها در PH معینی به حداقل می رسد.
، در نتیجه یونهای مثبت و منفی آن برابر می شوند،
این PH را نقطه ایزوالکتریک میگویند.
اغلب پروتئین ها در PH ایزوالکتریک به مقدار ناچیزی در آب حل می شوند،
نقطه ایزوالکتریک چند اسید آمینه و پروتئین به قرار زیر است:
اندازه گیری PH ایزو الکتریک کازئین
روش کار :
در یک بالن ژوژه 100 میلی لیتری 0.5 گرم کازئین خالص و 40 میلی لیتر آب و 10میلی لیتر سود نرمال می ریزیم.
پس از حل شدن کامل کازئین 10 میلی لیتر اسید استیک نرمال افزوده .
حجم را تا 100 میلی لیتر با آب مقطر کامل می کنیم .
خوب مخلوط می نمائیم.
در9 لوله آزمایش، طبق جدول بعد، محلولهای لازم را در هر یک می ریزیم.
به هر یک از لوله ها یک میلی لیتر از محلول کازئین افزوده؛
لوله ها را بلافاصله تکان می دهیم ،
کدورت حاصله را بعد از 10 و 30 دقیقه ملاحظه می کنیم،
نتیجه را بر حسب شدت کدورت از صفر تا چهار (+) مشخص می نمائیم.
در کدام یک از لوله ها رسوب بیشتر ایجاد شده است ؟
PH نقطه ایزوالکتریک کازئین چقدر است؟
کلسترول
کلسترول از گروه الکل های جامد حلقوی به نام استرول می باشد .
که به
با اسیدهای چرب ایجاد استریدها (یک نوع لیپید) می نماید،
کلسترول به طور طبیعی در خون و سلولهای تمام بافتهای حیوانی به مقادیر مختلف یافت می شود.
علاوه بر کلسترول که توسط مواد غذایی به بدن می رسد
تقریباً در تمام سلولهای بدن و به ویژه در کبد کلسترول از طریق متراکم شدن ریشه های دو کربن دار استات تولید می شود،.
کلسترول در کبد به اسیدهای صفراوی، در غدد فوق کلیوی و غدد مترشحه هورمونهای جنسی به هورمونهای استروئیدی و بالاخره در زیر پوست (مشتق دهیدروکلسترول) به ویتامینD تبدیل می گردد.
اصول روش اندازه گیری کلسترول در سرم
کلسترول را به کمک حلالهای آلی از سرم و پروتئینها جدا نموده.
بر روی محلول آن یک واکنش رنگی انجام می دهیم.
شدت رنگ حاصل را با یک محلول استاندارد کلسترول می سنجیم.
معرف ها:
محلول استاندارد کلسترول 100 میلی گرم درصد میلی لیتر کلروفرم
محلول اتر و الکل (یک حجم اتر و سه حجم الکل)
انیدرید استیک خالص
اسید سولفوریک خالص
کلروفرم
روش کار
1 – ده میلی لیتر مخلوط اتر و الکل را در یک لوله سانتریفوژ ریخته 0.2 میلی لیتر سرم به آن اضافه می نمائیم.
2 – دهانه لوله را بسته و یک الی دو دقیقه به شدت تکان می دهیم و ده دقیقه به حال خود می گذاریم.
3 –پنج دقیقه سانتریفوژ می نمائیم.
4- محلول را با دقت در داخل یک بشر کوچک T) ) می ریزیم.
5 – بشر را بر روی بن ماری جوش قرار می دهیم تا محلول تبخیر شود.
ادامه روش کار
6 – 0.5 میلی لیتر محلول استاندارد کلسترول در بشر کوچک دیگری( S )می ریزیم.
7 – دقیقاً 6 میلی لیتر کلروفرم به بشر T و 5.5 میلی لیتر به بشر S اضافه کرده کاملاً مخلوط می نمائیم.
8 – به هر یک از دو بشر دو میلی لیتر انیدرید استیک اضافه و مخلوط می نمائیم.
9 – به هر یک از دو بشر 0.1 میلی لیتر اسید سولفوریک خالص می افزائیم و کاملاً مخلوط می نمائیم و.
بشرها را برای مدت 5 دقیقه در حرارت 25 درجه (حرارت آزمایشگاه) و در محل تاریکی قرار می دهیم تا رنگ کامل شود .
اندازه گیری دانسیته اپتیک ومحاسبه
1 –طول موج 660 میلی مو را نتخاب می کنیم.
2 –با یک لوله حاوی کلروفرم (بلانک) جذب را صفر می کنیم.
3 – دانسیته اپتیک محلولهای بشر T و S را به ترتیب می خوانیم.
4-درصد کلسترول را محاسبه می کنیم
آنزیم ها
آنزیم ها یا کاتالیزورهای حیاتی ساختمانی پروتئینی دارند.
بعضی آنزیمها از پروتئین های ساده تشکیل شده اند (مانند پپسین) .
ولی اکثر آنزیمها از پروتئین های ترکیبی به وجود آمده اند؛
ساختمان آنها از دو قسمت تشکیل شده است:
یکی قسمت پروتئینی به نام آپوآنزیم ،
و یک قسمت غیرپروتئینی بنام ریشه پروستتیک که به آن کوآنزیم گفته می شود.
واکنش های عمومی آنزیم
عوامل موثربر سرعت واکنش آنزیم ها :
1 – درجه حرارت
2 – همبستگی فعالیتهای آنزیمی با غلظت سوبسترا و غلظت آنزیم.
3 – PH روی فعالیت آنزیمها
4 – اختصاصی بودن عمل آنزیمها
5 – اثر مهار کننده ها و مواد ضد عفونی کننده.
1 –بررسی اثر درجه حرارت روی فعالیت آنزیمها
در هر یک از 4 لوله آزمایش 5 میلی لیتر شیر (سری A).
در هر یک از 4 لوله دیگر (سری (B یک میلی لیتر محلول 0.5 درصد Rennin می ریزیم.
از هر سری یک لوله انتخاب می کنیم.
دو لوله محتوی شیر و رنین را به ترتیب لوله های اول را در بشر آب و یخ
لوله های دوم را در حرارت آزمایشگاه
لوله های سوم را در آب 37 تا 40 درجه
و لوله های چهارم را در آب 80 درجه قرار می دهیم.
ادامه بررسی اثر دما روی فعالیت انزیم
بعد از چند دقیقه محلول رنین را به لوله های محتوی شیر نظیر خود می افزائیم .
فوراً مخلوط کرده و زمان را یادداشت می کنیم.
لخته شدن شیر را در لوله ها به دقت تحت نظر قرار می دهیم.
بعد از یک دقیقه، 5 دقیقه ، 10 دقیقه و 30 دقیقه تغییرات حاصله در لوله ها را بررسی میکنیم.
در کدام یک از لوله ها انعاقد انجام نگرفته است. بهترین درجه حرارت برای فعالیت رنین رامشخص می کنیم.
2 – فعالیت آنزیم
الف ) اثر غلظت آنزیم
در سه لوله آزمایش به ترتیب 1 میلی لیتر 0.5 میلی لیتر، 0.25 میلی لیتر رنین 0.2 درصد می ریزیم.
سپس به لوله دومی 0.5 و به سومی 0.75 میلی لیتر آب اضافه می کنیم.
در سه لوله دیگر و در هر یک 5 میلی لیتر شیر می ریزیم.
لوله های محتوی آنزیم و شیر را در حمام 37 تا 40 درجه قرار می دهیم.
پس از چند لحظه هر یک از لوله های شیر را به محتوی هر لوله آنزیم اضافه می کنیم.
لوله ها را مخلوط کرده و زمان را یادداشت می کنیم.
زمانی را که طول می کشد تا هر یک از لوله ها منعقد گرددتعیین کنید..
ب) اثر غلظت سوبسترا
در سه لوله آزمایش به ترتیب 10 و 8 و 6 میلی لیتر شیر میریزیم.
هر یک را با آب به 10 میلی لیتر می رسانیم.
لوله ها را در حمام 37 تا 40 درجه قرار می دهیم.
به هر لوله 2 میلی لیتر رنین 2/0 اضافه می کنیم.
زمانی که جهت انعقاد هر لوله لازم است یادداشت می کنیم.
از این دو آزمایش (الف – ب) چه نتیجه ای می گیریم؟
3 – اثر PH روی فعالیت آنزیمها
با جویدن پارافین جامد مقداری از بزاق خود را جمع آوری کنید.
سپس آنرا با کلرور سدیم 1% تا 5 بار رقیق کنید.
در چهار لوله آزمایش به ترتیب:
در اولی 2 میلی لیتر اسید کلریدریک 0.4 درصد((PH=1،
در دومی 2 میلی لیتر اسید لاکتیک 0.1 درصد(PH=5)،
در سومی 2 میلی لیتر آب مقطر(PH=7)
و در چهارمی 2 میلی لیتر کربنات سدیم 1% (PH=9) بریزید.
ادامه آزمایش اثر PH روی فعالیت آنزیم
به هر لوله 2 میلی لیتر نشاسته 1% (پخته) ؛
2 میلی لیتر بزاق رقیق شده اضافه کنید .
لوله ها را خوب مخلوط کرده و در حمام 37 تا 40 درجه قراردهید.
پس از 15 دقیقه لوله ها را از حمام بیرون آورده ؛
در مورد هر یک آزمایش ید را انجام دهید.
ادامه آزمایش اثر PH
در روی یک کاشی سفید(یا 4 لوله آزمایش) 4 قطره ید به طور جداگانه قرار دهید.
.ازهر لوله یک قطره نشاسته به قطره ید مربوطه اضافه کنید.
ایجاد رنگ آبی دلیل بر وجود نشاسته هضم نشده است.
در کدام لوله هضم نشاسته بهتر صورت گرفته است ؟
بهترین را PHمشخص کنید.
4 – اختصاصی بودن عمل آنزیمها
هر آنزیمی روی سوبسترای مشخصی عمل می نماید.
اوره آز روی اوره اثر کرده و آمونیاک آزاد می کند .
در حالیکه روی تیواوره که از نظر فرمول کاملاً شبیه اوره می باشد اثری ندارد
اوره 2 (2 CO(NH تیواوره CS(NH2)2
آزمایش اختصاصی بودن آنزیمها
در دو لوله آزمایش در اولی 5 میلی لیتر اوره 1% و در دیگری 5 میلی لیتر تیو اوره 1% می ریزیم.
به هر دو لوله چند قطره فنل رد و سپس 1 میلی لیتر اوره آز فعال اضافه می کنیم
لوله ها را در حمام آب 37 تا 40 درجه قرار می دهیم.
پس از 15 دقیقه تغییر رنگ را در دو لوله مشاهده می کنیم.
فنل رد در محیط اسیدی زرد رنگ و در محیط قلیایی قرمز رنگ است.
از این آزمایش چه نتیجه ای می گیریم؟
5 – اثر مهار کننده ها و ضد عفونی کننده ها
در چهار لوله و در هر یک 5 میلی لیتر شیر می ریزیم .
سپس 7 تا 8 قطره ؛
تولوئن به لوله اول کلروفرم به لوله دوم ، فنل 5% به لوله سوم و
آب مقطر به لوله چهارم اضافه می کنیم .
لوله ها را در حمام آب 37 تا 40 درجه قرار می دهیم .
سپس به هر یک از چهار لوله یک میلی لیتر رنین 0.2 درصد اضافه می کنیم.
پس از 5 دقیقه انعقادرا در لوله ها نسبت به لوله کنترل مورد توجه قرار می دهیم.
انعقاد در کدام یک از لوله ها صورت نمی گیرد؟ چرا؟
منابع فارسی
1-شاملو،یوسف.کامیاب،ثریا.آموزش آزمایشگاهی بیوشیمی عمومی،مرکز نشر دانشگاهی تهران ،1361.
2-هاشمی تنکابنی،سید ابراهیم.آزمایش روغنها وچربیها،مرکز نشر دانشگاهی ،چاپ اول ،1364 .
3-مورای ،روبرت.ک،گرانر.داریل ،ک.ترجمه ملک نیا، ناصر.شهبازی ،پرویز.بیوشیمی هارپر.جلد اول. جلد دوم. نشر شهر آب،1380 .
4- دانیال زاده،آلبرت.اصول بیوشیمی.جلد اول.نشر دانشگاهی. چاپ چهارم.1372 .
5- رضا،رضایی. روش های نوین آزمایشگاهی ،جلد اول.انتشارات دفتر مرکزی جهاد دانشگاهی.1364 .
منابع انگلیسی
6- Lehninger,Albert.Principles of Biochemistry Worth publisher,Inc.First Edition . 1982
7-Bishop,Nichael L.Duben-von Laufen Janet L. Clinical Chemistry.J.B.Lippincott Company ,1985.
8-Tietz Norbert W.Fundamentals of clinic Chemistry.