هماتوکریت یا حجم فشرده گلبولی

 هماتوکریت یا حجم فشرده گلبولی Hematocn't or Paclced Cell Volume (PCV)
مقدمه
خون بافتی است که از 2 قسمت سلول ها و مایع تشکیل شده است. سلول ها عبارتند از گلبول های قرمز داریتروسیت ها، گلبول های سفید (کلوسیت ها) و پلاکت ها مایع خون را پلاسما گویند که حدوداً از 90 درصد آب و 10 درصد مواد جامد محلول در آن تشکیل شده است.
پلاسما شامل مواد پروتئینی، الکترولیت ها (مانند سدیم، پتاسیم، کلسیم، بیکربنات و …) قند، کلسترول، اسیدهای چرب، فسفولیپیدها، آنزیم ها و غیره می باشند.
اعمال مختلف خون در بدن عبارتند از:
1- حمل اکسیژن به بافت ها و خارج کردن دی اکسید کربن از آنها
2- حمل مواد غذایی به بافت ها
3- انتقال فرآورده های متابولیسمی برای دفع به کلیه ها، کبد، ریه، روده، پوست
4- تنظیم آب داخل و خارج سلولی
5- تنظیم حرارت بدن با انتشار خون در بافت ها
6- توزیع هورمون ها و سایر مواد
7- دفاع بدن و ایجاد ایمنی
خون به عنوان یک بافت با اعمال فوق دارای ویژگی هایی است که آن را از سایر بافتها متمایز کند. هنگامی که خون کامل دارای ماده ضد انعقاد سانتریفوژ می شود، فضایی که به وسیله گلبول های قرمز فشرده شده اشغال می شود، اصطلاحاً هماتوکریت نام دارد و به صورت درصد گلبول های قرمز خون نسبت به خون کامل بیان می شود.
به عبارت دیگر هماتوکریت یک نمونه خون، نسبت حجم گلبول های قرمز به حجم کل خون است .
همچنین هماتوکریت به عنوان PCV یا حجم گلبول های قرمز فشرده شده شناخته شده است مقادیر هماتوکریت کاملاً به موازات مقادیر و تعداد گلبولهای قرمز خون است. مقادیر نرمال هماتوکریت همانند هموگلوبین و تعداد گلبول های قرمز خون تحت تاثیر عوامل مختلفی مانند سن، جنس، نژاد و محیط و … قرار می گیرد.
روش های خون گیری از ماهی:
2 روش کلی خون گیری در ماهیان است:
1) روش خون گیری مکرر از یک ماهی Serial Blood Sampliny
2) فقط یک بار خون گیری Once Only Sampling
روش خون گیری مکرر به دلیل استرس ناشی از خون گیری کمتر استفاده می شود لذا محققان روش فقط یک بار خون گیری را توصیه می کنند.
زمانی که زنده بودن ماهی پس از خون گیری مهم نباشد می توان ماهی را کشت به 3 طریق:
1- یک ضربه محکم و سریع را با استفاده از یک شی فلزی دسته اسکالپر، به ناحیه اتصال جمجمه و ستون مهره ها در ناحیه سر وارد کنیم. در این حالت نخاع قطع شده و منجر به مرگ می شود.
2- نخاع را قطع کنیم و با فرو کردن و حرکت جانبی تیغه اسکالپر در محل اتصال جمجمه به اولین مهره ستون فقرات در ناحیه سر با یک حرکت افقی
3- استفاده از مواد بیهوش کننده با غلظت بیش از غلظت لازم برای بیهوشی
در صورتی که بخواهیم ماهی زنده بماند پودر Ms 222 را به نسبت خاص برای ماهی مورد نظر حل کرده ماهی ها را یکی یکی درون محلول گذاشته و پس از 2 دقیقه بیهوش می شوند ماهی را خشک کرده از پهلو روی میز گذاشته از بالای ساقه دمی باز اولیه 45 درجه در کنار خط جانبی وارد عضله شده وقتی سرنگ به ستون مهره جاندار رسید با بازی در آن به رگ های این قسمت رسیده و با کشیدن پیستون سرنگ مقدار خون مورد نیاز به دست می آید.
یا از انتهای باله مخرجی در قسمت ساقه دمی و از قسمت شکمی ماهی به صورت عمودی سوزن را وارد عضله ماهی کرده و وقتی بر ستون مهره رسید (به شبکه رگ های این قسمت) با کشیدن پیستون سرنگ ؟؟؟ تامین می شود (جمالزاده، 1380)
از نواحی مختلف می توان خون گیری کرد:
– قطع ساقه دهی در ماهی کوچک
– در ماهیان بزرگ تر خون را می توان با استفاده از آئورت پشتی یا Dosal aortic puncture آئورت شکمی -قلب به دست می آید.
زمانی که ماهی ما ارزش داشته باشد و زنده ماندن آن مهم باشد و ولش لوله گذاری Canultion مطرح است که مانند قرار دادن یک 3 راهی لوله ای نازک در وسط جریان خون است. که برای ماهیان بزرگ تر استفاده شود. سر لوله گره زده می شود و هر وقت نیاز باشد خون از این منطقه برداشته می شود. (محل قرارگیری 3 راهی لوله ای نازک کمان آبششی رگ های آوران – وابران است)
بهترین نتایج از تلفیق روش های کشتن ماهی Stunning به همراه استفاده از ماده ضد انعقاد مپارین و نگه داری نمونه خون گرفته شده در سرما و سرعت عمل در انجام مراحل حاصل می شود.
مواد و روش کار:
* ماهی از خانواده Cyprinidae (کپور-ماهی حوض)
* قیچی
* خط کش خواندن هماتوکریت
* سانترینوژ هماتوکریت
* خمیر هماتوکریت (موم) Cristoseal
* لوله هماتوکریت
هماتوکریت را ممکن است مستقیماً به وسیله سانتریفوژ و به روش های ماکرو یا Wintrobe و نیتروب و میکروهماتوکریت اندازه گیری کنند یا به صورت غیر مستقیم توسط دستگاه های اتوماتیک و از حاصل ضرب MCV در شمارش گلبول های قرمز به دست آورند.
روش و نیتروب در گذشته استفاده زیادی داشت ولی امروزه به علت زیاد بودن خون مورد نیاز، مدت زمان طولانی سانتریفوژ و زیاد بودن پلاسمای به دام افتاده در لابه لای گلبول های قرمز کاربرد کمی دارد.
روش میکروهماتوکریت Microhatocrit
در این روش از لوله های میکروهماتوکریت با طول تقریباً 7 سانتی متر و قلمرو یک میلی متر استفاده شود در انتهای لوله های میکروهماتوکریت یک حلقه رنگی وجود دارد. در لوله های میکروهماتوکریت فاقد ضد انعقاد، حلقه آبی و رنگ و در لوله های میکروهماتوکریت آغشته به ماده ضد انعقاد هپارین، حلقه قرمز رنگ یافت می شود. لوله های اخیر را با هپارین که به نسبت یک به 1000 رقیق شده است پر کرده و سپس در حرارت 56 تا 37 درجه سانتی گراد خشک می کنند اگر از خون دارای ماده ضد انعقاد استفاده می شد باید لوله های آبی رنگ استفاده شود ولی چنانچه از خون مویرگی استفاده می شود از لوله های میکروهماتوکریت با حلقه قرمز رنگ استفاده شود.
سانتریفوژ میکروهماتوکریت دارای حوزه سانتریفوژی 10000 تا 15000 است که پس از روشن شدن در عرض 3 ثانیه به حداکثر سرعت می رسد.
در روش میکرو، لوله های مو ئینه مدرج نیستند در این روش باید ارتفاع ستون خون را که شامل پلاسما گلبول های قرمز است با خط کش میلی متری مخصوص یا صفحه مدرج مخصوص میکروهماتوکریت، قرائت کرد.
اینجا *
1- ماهی را قطع ساقه دمی کرده لوله هپارینه را در تماس با خون قرار می دهیم لوله میکروهماتوکریت را به طوری که حباب مواد ایجاد نشود پر می کنیم.
2- انتهای خشک لوله میکروهماتوکریت را در وضعیت عمودی در خمیر هماتوکریت فرو کرده تا در حدود 6-4 میلی متر از انتهای لوله از خمیر پر شود. در حین عمل نباید به خون موجود در لوله فشار وارد شود.
3- دو لوله هماتوکریت را در شیارهای شعاعی سانتریفوژ، به طوری که در وضعیت مخالف و روبروی یکدیگر باشند قرار داده انتهای بسته لوله ها باید به طرف خارج صفحه سانتریفوژ قرار داشته باشد.
4- به مدت 5 دقیقه دستگاه را به کار بیاندازید با استاندارد 7000 rpm
5- به محض اینکه سانتریفوژ متوقف شد لوله های میکروهماتوکریت را از آن خارج کرده و با استفاده از خط کش یا جدول مدرج مخصوص، هماتوکریت را برحسب درصد قرائت می نمائیم اختلاف 2 لوله هماتوکریت باید در حدود درصد باشد در غیر این صورت باید آزمایش تکرار شود. (عامری 1378)
نتایج:
هنگامی که خون کاملاً سانتریفوژ می شود گلبول های قرمز به علت وزن مخصوص زیادتری که نسبت به سایر عناصر خونی دارند در ته لوله قرار می گیرند به طوری که به ترتیب از سر لوله به پایین طبقاتی به شرح زیر ایجاد می شود:
1- پلاسما: طبقه زرد رنگ
2- لایه بافی کوت (Buffy coot): طبقه خاکستری مایل به قرمز شامل:
الف- ترمبوسیت ها: طبقه رویی به رنگ کرم
ب- مکوسیت ها: طبقه خاکستری قرمز رنگ
ج- گلبول های قرمز هسته دار که در لایه بافی کوت در صورت وجود ایجاد رنگ قرمز می کنند.
3- طبقه گلبول های قرمز
(عامری 1378)
برای خواندن میزان هماتوکریت ها با خط کش هماتوکریت: لوله هماتوکریت را در شیار خط کش هماتوکریت قرار داده و انتهای پایین ستون گلبول های قرمز را با خط صفر تنظیم کرده سپس خط سفید متحرک میانی را با سطح بالای گلبولهای قرمز تنظیم و درصد حجم گلبولهای قرمز را از روی ستون مندرج می خوانیم. میزان Hc+ در ماهیان بالغ بیشتر از نابالغ است. (جمالزاده 1380)
این در آزمایش هماتوکریت به ترتیب زیر است:

(1979) Smeda , Hooston . (1979) Millich 8 Catlett
در مطالعات حجم خون پلاسما را 8/2 و 3 درصد محاسبه نموده اند. حجم خون ماهیان نسبت به سایر مهره داران کمتر است. در ماهیان اسلاموبرانش این میزان بین 6-8 میلی بیتر به ازاء 100 گرم و در استخوانی بین 2-4 میلی لیتر به ازاء 100 گرم است.
میزان هماتوکریت را با درصد نشان می دهند. معمولاً در ماهیان اسلاموبرانش (آبشش صفحه ای ها) میزان هماتوکریت کمتر از 25 درصد است.
در ماهیان استخوانی این میزان بین 10 تا 30 درصد متغیر است.
در کپور معمولی حدود 27 درصد است.
درماهیان دریایی فعال مثل تن ماهیان یا Thunnus بالاترین میزان هماتوکریت که حدوداً بیش از 50 درصد است مشاهده شده است. (هماتوکریت انسانی 45 درصد).
میزان هماتوکریت و به تبع آن هموگلوبین با توجه به عواملی چون گونه، فصل، دما، وضعیت تغذیه و بهداشت ماهی متفاوت است در برخی گونه های وجود تغییرات شبانه روزی هم گزارش شده است.
یکی از عوامل تغییر هماتوکریت ماهیان تنظیم فشار اسمزی است. در صورت عدم تنظیم فشار اسمزی در ماهیان آب شیرین به دلیل ورود بیش از حد آب به بدن خون این ماهیان رقیق شده و همودیلیشن از آب شیرین به شور بالا می رود. و Hct کاهش می یابد.
در ماهیان آب شور به دلیل خروج آب از بدن خون غلیظ شده و Hemoconcentration و Hct و هماتوکریت، آن بیشتر می شود به نظر می رسد Hct ماهیان دریایی از این نظر بیش از ماهیان آب شیرین است.
بحث:
1- سرعت و مدت کافی برای سانتریفوژ کردن شروط اساسی در به دست آوردن یک هماتوکریت صحیح است گلبول های قرمز توسط سانتریفوژ کردن باید آنقدر فشرده شوند که با سانتریفوژ کردن بیشتر حجم گلبول های قرمز متراکم، کاهش پیدا نکند.
2- اگر انتهای لوله های میکروهماتوکریت به طور ناقص بسته شود باعث کاهش کاذب نتایج خواهد شد.
3- عدم سانتریفوژ کافی و همچنین ماندن لوله ها به مدت بیشتر از 10 دقیقه پس از اینکه سانتریفوژ متوقف شد باعث افزایش کاذب نتایج خواهد شد.
4- اگر مقدار ماده ضد انعقاد بیش از حد نیاز باشد به علت چروکیده شدن گلبول های قرمز خون باعث کاهی کاذب خواهد شد.
5- در حین عمل سانتریفوژ کردن، بخش کوچکی از گلبول های سفید، پلاکت ها و پلاسما در میان گلبول های قرمز به دام می افتند که خطای ناشی از آن اهمیت چندانی ندارد. افزایش هماتوکریت حامل از پلاسمای به دام افتاده (Trapped Plasma) گاهی بیشتر از هماتوکریت حاصل از گلبول های سفید و پلاکتهای به دام افتاده است کاهش نیروی سانتریفوژ باعث افزایش مقدار پلاسمای به دام افتاده در میان گلبولهای قرمز می شود و همچنین مقدار آن در روش هاکر و بیش از میکرو است. در روش میکرو هماتوکریت، پلاسمای به دام افتاده حدود یک تا 3 درصد کل ستون گلبول های قرمز متراکم می باشد.
6- به علت کمتر بودن زمان سانتریفوژ و نیز خطای ناشی از پلاسمای به دام افتاده روش میکرو هماتوکریت بر روش ماکرو ارجحیت دارد و به عنوان روش مرجع توسط کیته بین المللی استاندارد کردن هماتولوژی (ICSH) توصیه شده است. میزان خطای این روش 2-1 درصد است.
7- برای به دست آوردن نتایج صحیح نمونه ها باید در سرما نگهداری شوند.
8- در هنگام قرائت Hc+ باید بالاترین حد لایه گلبول های قرمز خوانده شود این مطلب زمانی که تعداد گلبول های سفید یا پلاکت ها افزایش شدید دارد دارای اهمیت فراوان است. (عامری 1378)
9- مقدار هماتوکریت به اندازه تعداد گلبولهای سرخ و همچنین حجم پلاسما بستگی دارد اگر مقدار آن بیش از اندازه طبیعی باشد می تواند نمودار افزایش گویچه ها یا کاهش حجم پلاسما باشد.
– اگر مقدار هماتوکریت کمتر از حد طبیعی باشد ممکن است به دلیل کاهش تعداد گویچه های قرمز یا افزایش حجم پلاسما باشد (کم خونی- انسانی)
10- از آنجایی که هموگلوبین معمولاً حجم گلبول قرمز را اشغال می کند میتوان با تقسیم کردن PCV بر عدد 3 مقدار تقریبی Hd را برحسب گرم در دسی لیتر به دست آمد. و با توجه به اینکه PCV بستگی کامل به اندازه و مقدار گلبولهای قرمز موجود در واحد خون دارد می توان از تقسیم کردن PCV به عدد 6 مقدار تقریبی گلبول های قرمز را در یک میلی مترمکعب خون بر حسب میلیون به دست آورد. (عامری 1378)
تهیه گسترش خون (Blood Smear Preparation)
بررسی گسترش خونی بخش مهمی از ارزیابی هماتولوژی را تشکیل می دهد. قابل اعتماد بودن اطلاعات به دست آمده از بررسی گسترش خونی، بستگی زیاد به تهیه و رنگ آمیزی خوب گسترش ها دارد.
در اینجا سه روش برای تهیه گسترش های خون شرح داده می شود که عبارتند از: روش گسترش روی لام ( Slide Film) یا روش دو لامی یا روش گوه ای (The two slide or wedge method) روش گسترش روی لامل (Cover glass method) و روش خودکار یا چرخشی (Spinner method).
دو روش اضافه بر روش های فوق برای تهیه گسترش های خون در برخی موارد مورد استفاده قرار می گیرند. یکی از این موارد تهیه گسترش از لایه بافی کوت (Buffy coat) در لوله های میکروهماتوکریت است و هنگامی مورد استفاده قرار می گیرد که تعداد گلبول های سفید خون به شدت کاهش یافته است و این روش باعث تغلیظ سلول های هسته دار خون می گردد. روش دیگر تهیه گسترش ضخیم خون (Thick blood smear) است که معمولاً برای جستجوی انگل های خونی انجام می شود.
پس از تهیه گسترش خون، رنگ آمیزی های عمومی یا اختصاصی انجام شده و بررسی مرفولوژی سلول های خونی و شمارش افتراقی گلبول های سفید بر روی آن صورت می گیرد.
1- روش تهیه گسترش بر روی لام یا روش دو لامی یا گوه ای
1- دو عدد لام شیشه ای تمیز انتخاب کنید (لام هایی که برای تهیه گسترش خون به کار می روند باید کاملاً سالم و عاری از هر گونه آلودگی و غبار باشند (چنانچه این لام ها قبلاً مورد استفاده قرار گرفته اند باید ابتدا در الکل 95 درصد قرار داده و با پارچه تمیز کاملاً خشک شوند).
2- از یکی از دو لام به عنوان لام پخش کننده استفاده کنید.
3- حتی المقدور گسترش خون را باید از خون تازه ای که به آن ماده ضد انعقاد افزوده نشده است تهیه کرد. چنانچه از خون دارای ماده ضد انعقاد استفاده می کنید باید در اسرع وقت نسبت به تهیه گسترش اقدام کنید.
4- به وسیله لوله میکروهماتوکریت یک قطره کوچک از خون مخلوط شده را در یک سانتی متری لبه لام قرار دهید.
5- لام را بر روی یک سطح صاف قرار دهید، در حالی که قطره خون در طرف راست شما قرار دارد (برای افراد چپ دست بهتر است در سمت چپ قرار گیرد).
6- توسط انگشت نشانه و شست دست چپ دو طرف لام را نگه دارید و لام پخش کننده را طوری در دست راست بگیرید که لام بین انگشت شست و چهار انگشت دیگر قرار گیرد (تصویر شماره 15).
7- انتهای لام پخش کننده را کمی جلوتر از قطره خون قرار دهید، به طوری که بین دو لام زاویه تقریباً 30 تا 45 درجه ایجاد شود.
8- لام پخش کننده را کمی به عقب بکشید تا با قطره خون تماس پیدا کند و خون در لبه لام به طور یکنواخت پخش گردد. چنانچه خون در سرتاسر لبه لام پخش نشد مقداری لام پخش کننده را حرکت دهید تا این خون در سرتاسر لبه لام پخش شود. دقت کنید که خون به قسمت جلوی لام پخش کننده سرایت نکند.
9- لام پخش کننده را با یک حرکت یکنواخت و ملایم در سطح لام دیگر حرکت دهید تا یک لایه نازک از خون به دست آید.
10- با تکان دادن گسترش در جریان هوا گسترش را به سرعت خشک کنید. گسترش را نباید به حرارت یا دمیدن به آن خشک کرد.
11- گسترش را می توان با نوشتن مشخصات بیمار نشانه گذاری کرد. نوشتن مشخصات توسط قلم الماس روی انتهای لام یا توسط مداد بر روی انتهای ضخیم گسترش خونی انجام می شود.
2- روش تهیه گسترش بر روی لامل
1- برای این روش، لامل های نمره 1 یا 5/1 (مربع به اضلاع 22 میلیمتر) توصیه می شود. لامل ها باید کاملاً تمیز باشند.
2- یکی از لامل ها را توسط دو گوشه آن بین انگشت شست و انگشت نشانه قرار دهید.
3- یک قطره کوچک خون به قطر 2 تا 3 میلیمتر در مرکز لامل قرار دهید.
4- با دست دیگر یک لامل را مثل لامل اول نگه دارید.
5- به آرامی لامل دوم را روی لامل اول که حاوی یک قطره خون است به صورت ضربدری قرار دهید، به طوری که قطره خون بین دو لامل دوم روی لامل اول قرار گیرد خون بین آن دو پخش می شود.
6- قبل از آنکه خون کاملاً بین دو لامل پخش شود، دو لامل را با یک حرکت سریع، ناگهانی، افقی و در دو جهت مخالف بکشید. دقت کنید که لامل دوم را نباید از روی لامل اول بلند کرد زیرا حفراتی در گسترش باقی خواهد ماند. همچنین باید از فشار دادن دو لامل بر روی یکدیگر خودداری شود.
7- هر دو لامل را به صورتی که سطح گسترش رو به بالا قرار گیرد، روی کاغذ تمیزی قرار دهید تا در مجاورت هوا خشک شوند.
بحث:
1- در گسترش روی لامل توزیع سلول ها اتفاقی تر از گسترش روی لام است ولی به علت کوچک و شکننده بودن لامل، فن و رنگ آمیزی گسترش بر روی لامل برای افراد مبتدی مشکل است.
2- به محض اینکه قطره خون روی لامل اول قرار می گیرد باید بدون تاخیر لامل دوم روی آن قرار گیرد. اگر قطره خون بیشتر از 5-3 ثانیه بماند، توده شدن پلاکت ها و گلبول های سفید و قرمز و پدیده رولو در گلبول های قرمز ایجاد می شود.
3- قرار دادن قطره بزرگ خون باعث ضخیم شدن گسترش تهیه شده می گردد.
4- یک روش اصلاح شده تهیه گسترش بر روی لامل به این ترتیب است که به جای یکی از لامل ها از یک لامل شیشه ای استفاده می شود. در این روش یک قطره خون در مرکز لام شیشه ای قرار دهید و در حالی که لامل بین دو انگشت شست و نشانه قرار دارد آن را روی قطره خون بر روی لام شیشه ای قرار دهید و قبل از اینکه پخش شدن خوب کامل شود، لامل را از لام به وسیله یک حرکت سریع جدا کنید در نتیجه گسترشی که بر روی لام ایجاد می گردد همانند گسترشی است که بر روی لامل ایجاد می شود.
3- روش تهیه گسترش اتوماتیک یا چرخشی
تهیه گسترش های خون به این روش، محاسن انجام ساده تهیه گسترش به روش روی لام و توزیع یکنواخت سلول ها به روش لامل را با هم دارد و به وسیله انواع خاصی از سانتریوفوژ به نام اسپینر (Spinner) انجام می شود. در این دستگاه یک لام شیشه ای تمیز روی یک صفحه پلاتین قرار گرفته و در حدود 2/0 میلی لیتر خون حاوی EDTA در مرکز لام گذاشته می شود. سپس دستگاه روشن و موتور به کار می افتد و در یک زمان مشخص یک گسترش یک لایه ای بر روی کل سطح لام ایجاد می شود. دستگاه های پیشرفته تر اسپینر مجهز به سیستم نوری هستند. در این نوع دستگاه ها دسته ای از نور از لام به یک دستگاه حساس برخورد می کند و در زمانی که سطح لام به میزان کافی از خون پر شد، دستگاه حساس آن را تشخیص داده و صفحه پلاتینی به طور خودکار از حرکت باز می ایستد. در این روش خون بر اساس هماتوکریت بیمار بر روی لام پخش می شود. در این روش گسترش به گونه ای ایجاد می شود که سلول ها از هم جدا بوده و هیچ کدام روی هم قرار نمی گیرند و گلبول های سفید را می توان به راحتی در هر نقطه از گسترش تشخیص داد.
گسترش ها باید در هوا خشک شوند (عامری 1378)
مرحله بعد تثبیت است که به 3 روش انجام می شود:
1) استفاده زا عبور گسترش ها 3-4 مرتبه روی شعله و توجه نمی شود.
2) استفاده از الکل 5 دقیق
3) استفاده از محلول 50 درصد الکل فرمالین 1 دقیقه
رنگ آمیزی به 3 روش
روش عمودی 1- Romanowsky method
جهت رنگ کردن چربی ها 2- Sudan Black B
جهت رنگ کربوهیدرات ها 3- Periodic Acid Schiff (PAS)
روش 2 و3 اختصاص ماهی ها هستند.
روش Romanowsky:
1- تهیه و خشک کردن گسترش ها در هوا
2- تثبیت در متانل 5 دقیقه
3- قرار دادن در رنگ Commercial leishman stain مدت 2 دقیقه
4- شستشوی کامل در آب
5- رنگ آمیزی با محلول Commercial Bfferd Gimsa 2 دقیقه
6- شستشو در بافی فسفات از مولار با PH 4/6 و سپس آب مقطر
7- خشک کردن در هوا
در این روش سیتوپلاسم قرمز و هسته به رنگ آبی تیره و بنفش دیده می شود.
2- روش سودان بلک B:
1- تهیه و خشک کردن گسترش ها در هوا
2- تثبیت در فیکاتیو 10 میلی لیتر فرمالین و 90 میلی لیتر اتانل به مدت 5 ثانیه
3- شستشو در آب جاری به مدت 10 دقیقه
4- خشک کردن در هوا
5- رنگ آبزی با سودان بلک B به مدت 30-60 دقیقه دمای اتاق
6- شستشو در اتانل 70 درصد
7-رنگ آمیزی به صورت lightly ملایم و سریع با Commercial Bufferd Gimsa مشابه روش رومانوسکی
در نتیجه این روش چربی ها در سلول ها به رنگ سیاه و سایر ساختمان به رنگ خاکستری روشن می شود.
3- روش PAS:
1- تهیه و خشک کردن گسترش ها در هوا
2- تثبیت در فیکاتیو فرمالین – اتانل به مدت 10 دقیقه
3- شستشو در آب جاری به مدت 10 دقیقه
4- رنگ آمیزی با Commercial Periodic به مدت 20 دقیقه
5- شستشو با آب شیر
6- غوطه ور کردن گسترش ها در Commercial Schiff reagent 20 دقیقه
7- شستشو و رنگ آمیزی با Commercial hemato yliue lightly
8- شستشو و خشک کردن در هوا
در نتیجه این رنگ آمیزی در صورت مثبت بودن PAS رنگ قرمز تیره یا Rich magenta قرمز فلفلی یا بنفش ظاهر می شود که البته درجه بروز رنگ متفاوت است.
بحث در روش گسترش با 2 لامل
1- به محض قرار گیری قطره خون بر روی لام و بدون هیچ تاخیری باید گسترش تهیه شود هر گونه تاخیر باعث توزیع غیر طبیعی گلبول های سفید شود به طوری که در انتهای نازک گسترش ها تجمع حاصل می کنند. و ممکن است گلبول های قرمز تولید حالت رولو کنند و پلاکت ها تجمع یابند.
2- ضخامت بستگی به اندازه قطره خون، زاویه بین 2 لام و سرعت حرکت لام پخش کننده بر روی لام دیگر دارد. در یک سرعت معین افزایش زاویه لام پخش کنند باعث افزایش ضخامت گسترش خواهد شد.
3- گسترش نباید تمام سطح را بپوشاند در گسترش خوب یک قسمت ضخیم یک قسمت نازک یک قسمت تغییر تدریجی از ضخیم به نازک وجود دارد.
4- گسترش ما باید ظاهری صاف و هموار داشته و هیچ گونه برآمدگی و موج فرو رفتگی نداشته باشند.
5- در هنگام نشانه گذاری از خودکار نباید استفاده کرد.
6- به محض تهیه گسترش در جریان هوا خشک شود دیر خشک شدن سبب تجمع سلول ها و دندانه دار شدن اریتروسیت ها می شود.
بحث در روش 2 لامل:
1- در گسترش روی لامل توزیع سلول ها اتفاقی تر از گسترش روی لام است ولی به علت کوچک و شکننده بودن لامل، فن و رنگ آمیزی گسترش بر روی لامل برای افراد مبتدی مشکل است.
2- به محض قرار دادن قطره خونی روی لامل باید لامل دوم قرار گیرد زیرا بیشتر ماندن قطره خون سبب توده شدن پلاکت ها و گلبول های سفید و قرمز می شود.
مقدمه
خون نوعی بافت همبند است که ماده بنیادی آن پلاسما و رشته های آن فیبرین و عناصر سلولی آن گلبول های قرمز و سفید و ترومبوسیت ها و پلاکت ها می باشد.
تعیین فاکتورهای خونی و توجه به تغییرات گلبول های قرمز و سفید همواره به عنوان یک شاخص مهم در تشخیص بسیاری از بیماریها بوده است. ماهیانی که دارای سرعت حرکت بیشتری هستند هموگلوبین و گلبول های قرمز بیشتری دارند در حالی که گلبول های سفید آنها نسبت به ماهیان کم تحرک کمتر است. هیپوکسی روی مقادیر پارامترهای خونی ماهیان تاثیر می گذارد به طوری که کاهش اکسیژن محیط موجب افزایش تعداد گلبول های قرمز و مقادیر هموگلوبین می گردد. همچنین افزایش دما بر روی ماهیان کپور، حوض، سرگنده، نقره ای و روی رشد و پارامترهای خونی آنها تاثیر داشته به طوری که موجب افزایش تعداد گلبول های قرمز و موجب افزایش رشد شود.
در مطالعاتی که روی Sea bass انجام شده دریافتند که تعداد گلبولهای قرمز و هموگلوبین تغییرات فصلی معنی داری را در رابطه با تغییرات فصل و سیکل جنسی و سایر مواد فیزیولوژیک نشان می دهد.
بعضی محققان اشاره کرده اند که حجم خون در بین کل ماهیان به صورت فیلو ژنیک کاهش می یابد. ماهیان استخوانی عالی تر دارای سیستم و دستگاه عروقی کامل تری هستند و به خون کمتری برای انتقال اکسیژن و سایر مواد نیاز دارند.
خون از 2 قسمت سرم یا پلاسما و گلبول ها و سلول های خونی تشکیل شده است.
پلاسما شامل مواد پروتئینی، الکترولیت ها، قند، چربی و … می باشد.
و سلول های خونی عبارتند از: گلبول های قرمز دار یتروسیت ها، گلبول های سفید (لکوسیت ها) و پلاکت ها (عامری 1378).
گلبول های قرمز یا ارتیروسیت ها:
گلبول های قرمز ماهیان دارای یک هسته مدور یا بیضی شکل در مرکز بوده و عموماً سیتوپلاسم آنها به رنگ های ارغوانی- مسی، صورتی – مسی و یا آبی کمرنگ دیده می شوند و به هنگام رنگ آمیزی با گیمسا به سبب وجود هموگلوبین به رنگ صورتی یا مایل به زرد در می آیند. مقدار اریتروسیت ها در ماهیان مختلف بسته به جنس، سن و فصل و شرایط محیطی با هم تفاوت زیادی داردند.
مثلاً جنس های مختلف fundulus که ساکن آبهای لب شورند دارای گلبولهای قرمز کوچکتر نسبت به گونه های مشابه شان در آب شیرین می باشند نقش عمده گلبولهای قرمز و انتقال و حمل اکسیژن است و در ماهیان به علت وجود هسته از کارایی آن نسبت به پستانداران که گلبول های قرمز آنها فاقا هسته می باشند، کاسته می شود. (شاهسونی 1377)
ترومبوسیت ها (پلاکت ها): Thrombocytes
مانند پلاکت های خونی پستانداران هستند و نقش آنها نیز در انعقاد خون است این سلول ها بیضوی یا روی شکل باز و ائدسیتوپلاسمی که در هر یک از دو انتهای سلول وجود دارند قابل تشخیص هستند این سلول ها دارای مقدار کمی سیتوپلاسم و هسته ای بیضی شکل و بزرگ با شبکه کروماتین دانه دار مشاهده می شوند. (جمالزاده 1380)

محلول های رقیق کننده Diluting fluids
در شمارش سلول های خونی به وسیله هموسیترمتر یا دستگاه های اتوماتیک از محلول استفاده می شود که در عین رقیق کردن خون، ایزوتونیک بوده و بر مورفولوژی سلول ها تاثیر نامطلوب نداشته باشد و در حالی که سلول های مورد شمارش را حفظ می کند سایر سلول های خونی را لیز کند.
محلول هندریکس (1952) Hendricks جهت شمارش گلبول قرمز ماهی:
1- ترکیبات محلولی با این نام جهت رقیق کردن گلبول قرمز:
Na2soy ……..logr
Nael ………..1.5 gr
Nacitrate……….. 1.5 gr
Glacial acetic acid ………. 50ml
Distilles water…………..to 500 ml
2- محلول Dacie
(1973) Daisley & Blaxhall
خطرناک40% Formaldelyde solution…………….. 10ml
Trisodium Citrate ……………… 31/3 gl
Brilliant Cresylblue………..lgr
Distilled water …………..to Ilit

لام هموسیتوقر 3 دسته اند:
– لام های فوش رزنتال
– لام های توما
– لام های نئوبار
– لام های نئوبار اصلاح شده

لام مخصوص شمارش سلول های خونی (Counting Chamber)
1- لام هموسیتومتر (Hemocytometer)
لام های مدرج که برای شمارش گلبولهای قرمز، سفید یا پلاکت ها ساخته شده اند هموسیتومتر نامیده می شوند. این وسیله برای شمارش دستی سلول های خونی به کار می رود و در انواع مختلف ساخته شده است. متداول ترین آنها لام شیشه ای بسیار ضخیمی است که حاوی دو حجره مخصوص شمارش می باشد (Double Counting Chamber). مدل های مختلفی از این لام وجود دارند که هر یک مصارف خاصی دارند و از میان آنها می توان به دستگاه آدیس (Addis) برای آزمایش ادرار و دستگاه پتروف – هوزر (Petroff – Hauser) برای شمارش باکتری اشاره کرد. ولی لام نئوبار (Neubauer) که در هماتولوژی به کار می رود برای شمارش سلول های خونی بوده و رایج ترین نوع آن لام نئوبار تکمیل شده (Improved Neubauer) می باشد.
2- لام نئوبار تکمیل شده (Improved Neubauer)
این لام حاوی دو حجره (Chamber) مخصوص شمارش است که هر یک توسط خطوط متقاطع موازی به مربع های کوچکتری تقسیم شده است. مجموع مربع های هر حجره به ابعاد کلی 3*3*1/0 میلی متر می باشند که حجمی برابربا 9/0 میلی متر را تشکیل می دهند. سطح حجره به 9 مربع مساوی تقسیم شده که هر یک حجمی برابر 1/0 میلیمتر مکعب را ایجاد می کند.
مربع مرکزی که برای شمارش گلبول قرمز مورد استفاده قرار می گیرد توسط خطوط موازی به 25 مربع کوچک تر تقسیم شده است که هر یک حجمی به ابعاد 2/0 * 2/0 * 1/0 را بوجود می آورند که برابر 004/0 میلی متر مکعب است.
چهار مربع گوشه ای برای شمارش گلبولهای سفید به کار می روند و هر کدام از 16 مربع کوچکتر به وجود آمده اند که ابعاد هر یک 25/0* 25/0*1/0 می باشد و در نتیجه هر مربع کوچک حجمی برابر 00625/0 میلی متر مکعب به وجود می آورد.
لام نئوبار تکمیل شده مدل Spencer – Brigh هموسیتومتر انتخابی در بسیاری از آزمایشگاه ها می باشد. این لام بیشتر برای شمارش گلبولهای قرمز و سفید به کار می رود ولی از آن می توان در شمارش ائوزینوفیل، پلاکت، اسپرم و شمارش سلول مایع مغزی – نخاعی (CSF) استفاده کرد. موارد استفاده دیگر آن شامل شمارش آدیس (Addis Count)، شمارش مخمرها (Yeast) یا استاندارد کردن واکسن ها به روش شمارش سلولی است.
برای شمارش دقیق گلبول ها باید از هر دو حجره لام نئوبار استفاده کرد و اگر اختلاف شمارش دو حجره بیشتر از باشد شمارش دقیق نبوده و باید تکرار گردد.
در شمارش سلولی گلبول هایی را که کاملاً در داخل مربع می باشند به اضافه سلول های منطبق با دو ضلع از چهار ضلع مربع مربوط شمارش می کنند و از سلول هایی که روی دو ضلع دیگر قرار گرفته اند صرف نظر می شود.
ج – پی پت های شمارش سلول های خونی (Blood Counting Pipettes)
پی پت های مخصوصی برای شمارش گلبول های خون ساخته شده است که برای رقیق کردن خون به میزان معین به کار می روند (Diluting Pipettes). از میان آنها پی پت نوع توما (Thoma) متداول است زیرا موجب سهولت و تسریع در شمارش گلبولی می گردد.
1- پی پت گلبول قرمز (RBC Pipette)
این پی پت دارای درجات 5/0، 1 و 101 می باشد که بین درجه 1 و 101 حباب نسبتاً بزرگی تعبیه شده است و گلوله قرمز رنگی در داخل آن قرار دارد. برای استفاده از این پی پت آن را تا درجه 5/0 از خون پر کرده و بقیه آن را تا درجه 101 از محلول رقیق کننده پر می کنند. در نتیجه محلولی از خون با رقت به دست می آید. در کم خونی (Anemia) می توان پی پت را تا درجه 1 از خون پر کرد که در این صورت رقت به دست آمده خواهد بود. با این پی پت همچنین می توان پلاکت ها و گلبولهای سفید را در لکوسیتوز شدید ویا لوسمی ها (Leukemia) شمارش کرد.
2- پی پت گلبول سفید ( WBC Pipette)
این پی پت دارای درجات 5/0، 1 و 11 می باشد که بین شماره 1 و 11 حبابی تعبیه شده است و گلوله سفید رنگی در داخل آن قرار دارد. در استفاده از این پی پت آن را تا درجه 5/0 از خون پر کرده و بقیه آن را تا درجه 11 از محلول رقیق کننده پر می کنند و بدین ترتیب محلولی از خون به رقت به دست می آید. در شرایط لکوپنی شدید می توان پی پت را تا درجه 1 از خون پرکرد که در این صورت رقت به دست می آید. این پی پت علاوه بر شمارش تام لکوسیت ها در شمارش ائوزینوفیل ها و سلول های مایع مغزی-نخاعی (CSF) نیز کاربرد دارد.

پی پت های فوق را توسط آب گرم که با فشار از داخل آن رد می شود شست وشو می کنند. برای از بین بردن رسوبات حاصل می توان از محلول کلوروکس (Clorox) استفاده کرد. برای خشک کردن آنها می توان از محلول استون و سپس هوا استفاده کرد یا در اتو (Oven) آنها را خشک کرد.
3- پی پت های نیمه اتوماتیک برای رقیق کردن خون
برای رقیق کردن خون به میزان معین می توان از پی پت های مویین یک بار مصرف استفاده کرد پی پت های فوق به مخزن پلاستیک مخصوص که مجهز به دستگاه تنظیم کننده دقیق می باشند، متصل می گردند. با استفاده از دستگاه تنظیم کننده، میزان معین خون به داخل پی پت کشیده شده و به طور اتوماتیک با میزان معین از محلول رقیق کننده مخلوط و به لوله آزمایش ریخته می شوند. این سیستم که به نام اتودیلاتور (Autodiluter) مشهور است، به انواع مختلف یافت می شود و رایج ترین آن سیستم یونوپت (Unopette) ساخت کارخانه دیکنسون (Dickenson Company) می باشد. یونوپت سیستمی است که بر اساس همراهی یک لوله میکروکاپیلر (موئینه کوچک) و یک ویال پلاستیکی محتوی حجم از قبل اندازه گیری شده مایع رقیق کننده ساخته شده است و برای رقیق کردن دستی نمونه ها، سیستم با ارزشی به شمار می رود. یونوپت همراه با رقیق کننده ها برای شمارش گلبول قرمز، گلبولهای سفید، پلاکت ها، ائوزینوفیل و رتیکولوسیت ها و همچنین برای اندازه گیری غلظت هموگلوبین و شکنندگی اسمزی در دسترس است. به طوری که محلول رقیق کننده برای گلبول قرمز کلرور سدیم، برای گلبول سفید اسید استیک یک درصد، برای ائوزینوفیل معرف ارغوانی برموکرزول، برای پلاکت محلول یک درصد اکسالات آمونیوم و برای هموگلوبین درابکین است.
یک یونوپت استاندارد از قسمت های زیر ساخته شده است:
– مخزن (Reservoir) : حجم معینی دارد و به وسیله یک پوشش نازک پلاستیکی (Diaphragm) که در گردن مخزن قرار دارد، مسدود می شود.
– پی پت : در اندازه های مختلف وجود دارد و به صورت خودکار پر می شود. هر پی پت بر اساس اندازه دارای یک علامت رنگی است. طرف مقابل نوک پی پت، Overflow Chamber نام دارد.
– سرپوش پی پت (Pipet Shield) : این سرپوش محافظ پی پت است و برای کشیدن و سوراخ کردن دیافراگم استفاده می شود.
– روش کار
1- بلافاصله قبل از استفاده، پی پت را از سرپوش پی پت خارج کنید. سپس انتهای سرپوش پی پت را محکم وارد دیافراگم مخزن کنید تا این که فضای کافی برای پی پت ایجاد شود.
2- پی پت را در وضعیت افقی قرار دهید (تقریباً زاویه 15 درجه با سطح افق ایجاد کند) و نوک آن را با نمونه خون تماس دهید. هنگامی که خون با گردن پی پت تماس برقرار کند، با استفاده از خاصیت موئینگی پی پت به طور خود به خود پرخواهد شد و خون بیشتری وارد آن نخواهد گردید (چنانچه پی پت کمی کج و از وضعیت افقی خارج گردد، پی پت از خون لبریز خواهدشد). پس از پرشدن پی پت، به دقت خون اضافی در خارج پی پت را پاک کنید و انگشت نشانه را محکم در بالای منطقه Overflow قرار دهید.
3- مخزن را به آرامی فشار دهید (با انگشت به دقت اتاقک Overflow را بپوشانید و مواظب باشید که هیچ گونه مایعی از پی پت خارج نشود.) سپس پی پت را در وضعیت عمودی داخل مخزن قرار دهید و در داخل گردن مخزن آن را محکم کنید.
4- فشار وارده بر مخزن را برطرف کنید و انگشت نشانه را از روی اتاقک Overflow بردارید. سپس نمونه از پی پت خارج شده و وارد مایع رقیق کننده می گردد. به منظور خارج کردن تمام خون از پی پت چندین مرتبه مخزن را فشار دهید و سپس آزاد کنید. این عمل باید آنقدر به دقت انجام شود که نمونه رقیق شده از انتهای اتاقک خارج نشود.
5- انگشت نشانه را روی اتاقک Overflow قرار دهیدو مخزن را چندین مرتبه وارونه کنید تا نمونه خون کاملاً مخلوط شود.
6- قبل از انجام آزمایش، مخلوط را به دقت به وسیله وارونه کردن مخزن مخلوط کنید و در حین مخلوط کردن، با فشار مخزن پی پت را چندین مرتبه شست وشو دهید.
7- برای خارج کردن نمونه رقیق شده از مخزن چندین روش وجود دارد که بستگی به آزمایش مورد نظر ر ا دارد:
الف – برای شمارش سلول ها، به محض اینکه نمونه کاملاً مخلوط شد، مخزن را فشار دهید و نمونه را به داخل اتاقک Overflow وارد کنید. سپس انگشت نشانه را روی پی پت قرار دهید و از مخزن خارج کنید. نمونه از پی پت کشیده خواهد شد.
ب – ممکن است مخزن به یک قطره چکان تبدیل شود که این عمل با حذف پی پت و قرار دادن آن در مخزن به شکل معکوس و وارونه کردن اتاقک Overflow در گردن مخزن، عملی است. در این روش، برای شمارش سلول های خونی با فشار مخزن سه یا چهار قطره اول دور ریخته می شود و سپس با یک فشار ملایم به مخزن، اتاقک شمارش ازنمونه پرخواهد شد.
ج – اگر نمونه خون رقیق شده کاملاً از مخزن خارج شده است می توان پی پت را خارج کرد و سپس مخزن را معکوس کرد و فشار داد تا تمام محتویات داخل آن از طریق گردن مخزن خارج شود.
8- برای نگهداری نمونه رقیق شده می توان سرپوش را بر روی انتهای اتاقک Overflow نصب نمود یا این که پی پت را از مخزن جدا کرد و سرپوش پی پت را محکم در مخزن جای داد. چون دقت آزمایش های مربوط به شمارش سلولی بستگی کامل به دقت اندازه گیری حجم خون مایع رقیق کننده دارد، اتودیلاتورهای فوق در عین سرعت عمل، دقیق هستند ولی به علت یک بار مصرف بودن نسبت به پی پت های متداول گران تر می باشند.

روش شمارش سلول های خونی
1- شمارش گلبولهای قرمز
الف – پرکردن پی پت مخصوص شمارش گلبول قرمز
1- چنانچه خون مورد آزمایش با ماده ضد انعقاد مخلوط شده است برای شمارش گلبول قرمز باید لوله حاوی خون را حداقل 20 مرتبه به ملایمت زیرورو کرد (از تکان دادن شدید لوله خودداری شود).
2- پی پت گلبول قرمز را با نمونه خون تا علامت 5/0 دقیقاً پرکنید. چنانچه خون از خط مزبور کمی زیادتر وارد شد با تماس سرانگشت با تماس سرانگشت مرطوب یا پنبه زیادی خون را خارج کنید. توصیه می شود از کاغذ خشک کن و مواد جاذب استفاده نشود زیرا با جذب مایع خون، خون غلیظ می گردد.
3- نوک پی پت در هنگام فرو بردن در محلول رقیق کننده نباید آلوده به خون باشد. مایع رقیق کننده را باید یکنواخت و مداوم و تا علامت 101 به داخل پی پت کشید. به این ترتیب ضریب رقت خواهد بود.
4- برای جدا کردن لوله پلاستیکی از سرپی پت ابتدا با انگشت نوک پی پت را مسدود کرده و آن را به حال افقی نگاه دارید و سپس لوله لاستیکی سرپی پت را از آن جدا سازید.
5- با دو انگشت دو سر پی پت را نگاه دارید و آن را با حرکت دایره ای مداوم چند دقیقه تکان دهید تا خون و مایع رقیق کننده کاملاً مخلوط شوند. برای اینکار می توان از دستگاه تکان دهنده الکتریکی (Shaker) استفاده کرد.
ب – شمارش
1- از لام نئوبار برای شمارش استفاده می شود. ناحیه خط کشی شده لام و لامل مخصوص آن باید کاملاً تمیز باشند.
2- لامل را روی حجره .شمارش لام قرار دهید.
3- سه تا چهار قطره از مایع درون پی پت را تخلیه کرده و سپس نوک پی پت را به سطح مشترک بین لام و لامل قرار دهید تا خون رقیق شده در فاصله بین آن دو جریان یافته و حجره لام را پرکند، به طوری که حباب هوا ایجاد نگردد. در این هنگام نوک پی پت را از کنار لام بردارید.
4- چنانچه مایع بیشتری بر روی لام یا لامل جریان یافت باید لام و لامل را تمیز کرده و مجدداً عمل فوق را تکرار کرد.
5- یک دقیقه صبر کنید تا سلول های خونی بر روی حجره لام نئوبار و زیر لامل بی حرکت شوند.
6- لام را زیر میکروسکوپ قرار داده، ابتدا با عدسی 10، مربع مرکزی واقع بین 9 مربع دیگر را در وسط میدان میکروسکوپی قرار دهید. برای این کار ابتدا دیافراگم کندانسور میکروسکوپ را تا اندازه ای ببندید تا نور کم شود.
7- با عددسی 40 گلبول های قرمز موجود در پنج مربع از 25 مربع مرکزی را شمارش کنید. هر یک از ابعاد این مربع ها با سه خط موازی مشخص شده اند.
8- شمارش را از سمت چپ ردیف بالایی (چهار مربع کوچک) به سمت راست شروع کرده و بعداً از سمت راست به چپ خانه های ردیف پائین تر را شمارش کنید و به همین ترتیب ادامه دهید.
9- گلبول هایی که در روی خط کناری مربع ها قرار دارند، فقط آنهایی را شمارش کنید که در خط محدود کننده مربع در سمت بالا و سمت راست قرار دارند. در انتخاب محل های شمارش سلول ها خارج از خط آزاد هستید ولی باید دقت کنید که دو طرفی که برای شمارش انتخاب می شوند همیشه ثابت باشند.
ج – محاسبه
تعداد گلبولهای قرمز در یک میلی متر مکعب خون مجموع تعداد گلبولهای قرمز شمارش شده در 5 مربع کوچک (R)
رقت خون در محلول رقیق کننده
مساحت 5 مربع (با علامت R) میلی متر مربع
ارتفاع هر مربع (با علامت R) میلی متر مربع
یا به طور خلاصه :
تعداد گلبول های قرمز در یک میلی متر مکعب خون = مجموع تعداد گلبولهای قرمز شمارش شده در 5 مربع کوچک (R)
د-بحث
1- در مواردی که گلبولهای قرمز به شدت کاهش یافته اند مثلاً در کم خونی های شدید باید خون را به جای 5/0 تا علامت یک به داخل پی پت کشید که در این صورت فاکتور رقیق شدن خون به جای عدد 200، عدد 100 خواهد بود و باید حاصل شمارش در 5 مربع را در عدد 5000 ضرب کرد.
2- در برخی موارد مانند پلی سیتمی (Polycythernia) ممکن است تعداد گلبولهای قرمز به شدت بالا باشد که این امر در شمارش صحیح ایجاد اشکال می کند. در این موارد باید خون را بیشتر رقیق کرد. به همین منظور خون را تا درجه 3/0 بکشید و تا درجه 101 بامحلول رقیق کننده، پرکنید. در این صورت فاکتور رقت 333 به دست می آید.
3- مطمئن شوید که محلول رقیق کننده عاری از خون و هرگونه آلودگی است.
4- اطمینان حاصل کنید که پی پت ها، لام هموسیتومتر و لامل سالم بوده و بدون گرد و غبار، ذرات پنبه و خون خشک شده هستند.
5- به علت زیاد بودن تعداد گلبولهای قرمز، شمارش آنها وقت گیر است. بنابراین با سرعت مناسب آزمایش را انجام دهید.
6- تبخیر شدن محلول اتاقک شمارش باعث عدم صحت تعداد نهایی گلبول های قرمز می شود.
7- میزان خطا در روش دستی شمارش گلبولهای قرمز 20-10 درصد است.
8- مواد بروز خطا عبارتند از :
8-1- بی دقتی در میزان خون یا محلول کشیده شده به داخل پی پت مخصوصاً در مواردی که خون از درجه 5/0 تجاوز کند یا اینکه در هنگام تمیز کردن پی پت مقداری از خون کشیده شده و خارج گردد.
8-2- مرطوب یا کثیف بودن پی پت مصرف شده.
8-3- وجود لخته در داخل خون یا مایع مصرف شده.
8-4- وجود حباب های هوا در داخل پی پت در هنگام کشیدن خون یا مایع رقیق کننده.
8-5- آلودگی مایع رقیق کننده مثلاً آلودگی قارچی و غیره.
8-6- استفاده از پی پت یا لام شکسته یا ترک خورده.
8-7- استفاده از چند قطره اول در پرکردن حجره هموسیتومتر.
گلبولهای سفید (لکوسیت ها) شامل :
* بدون دانه (Agranulacy tes) نظیر انفوسیت های بزرگ و کوچک و مونوسیت ها که فاقد دانه در سیتوپلاسم بوده و هسته آنها فاقد لوب می باشد.
* دانه دار (Granulocytes) نظیر :
– نوتروفیل ها Neutrophils
– ائوزینوفیل ها Eosinophils
– بازوفیل ها Basophils
انفوسیت ها بیشترین تعداد گلبولهای سفید را به خود اختصاص داده اند دارای هسته مدوریا بیضی شکل هستند که اندازه این سلولها در ماهیان استخوانی از 5/4 تا 2/8 میکرون متغیر می باشد.
لنفوسیت های T,B در ماهیان مشابه پستانداران بوده و نقش آنها در تولید آنتی بادی ایمن سازی Immunization می باشد.
منوسیت ها کمترین تعداد گلبولهای سفید را به خود اختصاص داده اند به طوری که در تعداد بسیار کمی از ماهیان اغلب دیده نمی شوند به نظر می رسد که این سلولها از کلیه ها منشاء گرفته و زمانی در خون ظاهر شوند که اجسام خارجی به داخل جریان خون و یا بافت ماهی راه یابند، عمل اصل مونوسیت ها فاگوسیتوز می باشد. (Blood macrophages)
فوتروفیل ها دارای تعداد بیشتری در میان سلول های خونی سفید ماهیان می باشند به طوری که حدود فوتروفیل ها دارای تعداد بیشتری درمیان سلول های خونی سفید ماهیان می باشند به طوری که حدود 25 درصد از کل گلبولهای سفید ماهی آزاد را تشکیل عموماً این سلول ها چند سلولی است اما در بعضی ماهیان هستند دولوبی نوتروفیل دیده می شود.
دانه های موجود در سیتوپلاسم آنها در گردش خون محیطی به رنگ های صورتی، قرمز یا بنفش دیده می شوند.
پر اکسید هیدروژن موجود در این دانه های آزروفیل (Azurophil granoles) خاصیت باکتری کشندگی دارد درماهی طلایی حوض (Carassius auratos) 3 نوع از این دانه ها شناسایی شده اند.
نوتروفیل ها فاگوسیتوز کنند ه های فعال هستند که در هنگام عفونت به محل التهاب یافته جهت مقابله با میکروب ها مهاجرت می کنند.
* ائو.زینوفیل ها عموماً سلول هایی گرد با سیتوپلاسمی دانه دار و هسته ای لوب دار میباشند که به همراه بازوفیل ها در مواقع استرس به عنوان آنتی ژن حساس و فاگوسیت عمل می کنند.
بازو فیل ها که عموماً گرد یا بیضی شکل می باشند و ؟؟ وجود ندارند.
(سعیدی، 1377)
ائوزینوفیل ها با رنگ های ائوزینوفیلی رنگ می گیرند. در پستانداران عمل نشان حمله به انگل ها است و در ماهی ها هم احتمالاً چنین عمل را انجام می دهند. ماهی هرچه به کف یا بستر نزدیک تر باشد و مواد غذایی خود را از بستر تهیه کند میزان ائوزینوفیلی آن بیشتراست.
در ماهیان پلاژیک و نریتیک این سلول ها در حالت طبیعی دیده نمی شوند و یا در صد نشان کم است. ماهی آزاد دریاچه خزر اینگونه است و یک ماهی Anadromous رود کوچ است و بیشتر در قسمت نریتیک به سر می برد این سلول ها در ان مشاهده شده است در حالی که در ماهیان خاویاری این سلولها دیده شده است دپورغلام و همکاران 1377)

محلول جهت کردن گلبول های سفید درماهیان:
Show Hesser (1960)
که شامل 2 محلول است که زمان رقیق سازی نمونه مخلوط می شوند:

Solution 1:
Nevtral red ——————————0/25 mg
Nacl ———————————————–0/9 gr
Distilled water —————————100 ml

Sootion 2:
Ctistal violet ——————————12 mg
Sodiom Ctrate ———————————– 3.8 mg
Standard Formaldehyd Solution———————–0/4 ml
Distilled water ——————————- 100 ml

8-8- تجمع سلول های خونی در یک نقطه هموسیتومتر. در شمارش گلبول ها باید دقت کرد که سلول ها به طور یکنواخت در لام منتشر شده باشند و اگر اختلاف بارز در تعداد سلول های موجود در مربع های مختلف مشاهده شد باید آزمایش تکرار شود. اختلاف بارز در مورد گلبول های قرمز بیشتر از 20 عدد در مربع های کوچک و در مورد گلبول های سفید بیشتر از 10 عدد در مربع های بزرگ می باشد.
2- شمارش گلبول های سفید
الف – پرکردن پی پت مخصوص شمارش گلبول های سفید
1- روش عمل مانند پرکردن پی پت گلبول قرمز است، با این تفاوت که در اینجا پی پت مخصوص رقیق کردن خون از نظر حجم و درجه بندی اختلاف دارد. بنابراین خون را باید تا علامت 5/0 به داخل پی پت کشیده و بقیه را از محلول رقیق کننده تا علامت 11 پر کنید.
2- به این ترتیب ضریب خون خواهد بود.
ب – شمارش
1- روش پر کردن لام هموسیتومتر مشابه با گلبول قرمز است.
2- پس از اینکه مایع به اندازه کافی در زیر لام و لامل پر شده مدت یک دقیقه آن را به حال خود بگذارید تا گلبول ها از حرکت باز ایستند.
3- در زیر میکروسکوپ و با عدسی 10 و نور کم تعداد لکوسیت ها را در چهار مربع که در چهار گوشه مربع بزرگ قرار دارند و با علامت W مشخص شده اند شمارش کنید.
4- روش شمارش مشابه با گلبول های قرمز است. در یک تنظیم مناسب نور، گلبول های سفید خون به صورت ذرات سیاه کوچک به نظر می رسند.
5- برای یک شمارش صحیح، باید سلول ها در تمام چهار مربع توزیع شده باشند و اختلاف مربع ها با یکدیگر بیش از 10 سلول نباشد.
6-سلول های موجود در حجره شمارش طرف مقابل را هم شمارش کنید. تعداد شمارش شده باید نزدیک به تعداد شمارش شده در اتاقک اول باشد، در غیر اینصورت آزمایش را از مرحله اول مجداداً تکرار کنید.
ج – محاسبه
تعداد گلبول های سفید در یک میلی متر مکعب خون =
رقت خون در محلول رقیق کننده =
مساحت هر مربع (با علامت W ) 1 میلی متر مربع
ارتفاع هر مربع ( با علامت W )= میلی متر مربع
تعداد مربع شمارش شده ( باعلامت W ) = 4
یا به طرز خلاصه:
تعداد گلبول های سفید در یک میلی متر مکعب خون = 50* تعداد گلبولهای سفید شمارش شده در 4 مربع
د – بحث
1- در برخی موارد مانند لکوسیتوز یا لوسمی ها، تعداد گلبولهای سفید ممکن است به شدت افزایش یابد. اگر تعداد گلبولهای سفید بالاتر از 30000 در میلی متر مکعب خون باشد، بهتر است از رقت های بالای خون برای شمارش استفاده شود. در این موارد از پی پت شمارش گلبول های قرمز استفاده کنید ( به قسمت شمارش گلبولهای قرمز مراجعه کنید). خون را تا درجه یک بکشید و آن را تا درجه 101 توسط محلول رقیق کننده گلبول های سفید رقیق کنید. در این صورت رقت به دست می آید.
اگر تعداد گلبولهای سفید افزایش قابل توجهی نشان می دهد باید خون را به نسبت رقیق کرد مانند برخی از لوسمی ها که ممکن است تعداد گلبول های سفید به 100 تا 300 هزار در میلی متر مکعب خون برسد. به همین منظور خون را تا درجه 5/0 پی پت گلبول قرمز کشیده و تا علامت 101 از محلول رقیق کننده گلبولهای سفید پر کنید. بقیه روش را مانند قبل ادامه دهید. در این حالت باید به ضریب رقت در محاسبات دقت شود.
2- هرگاه تعداد گلبولهای سفید کمتر از 3 هزار در میلی متر مکعب خون باشد (لکوپنی) رقت کمتری از خون باید تهیه کرد تا شمارش صحیح تر انجام شود. در چنین مواردی خون را باید تا درجه یک پی پت شمارش گلبول سفید کشید و تا علامت 11 توسط محلول رقیق کننده گلبول های سفید رقیق کرد که رقت به دست می آید. سپس شمارش گلبول های سفید همانند قبل ادامه پیدا می کند و ضریب رقت 10 در محاسبات باید منظور شود.
3- این موضوع حائز اهمیت است که مایع رقیق کننده باید بدون هرگونه آلودگی باقی بماند. اغلب مقدار کمی از خون وارد محلول رقیق کننده شده و باعث ایجاد مشکل و عدم صحت در شمارش گلبول های سفید خون می شود.
4- باید دقت کرد که لام، لامل و پی پت مورد استفاده بدون هرگونه گرد و غبار، خون خشک شده و الیاف پنبه باشند. آلودگی باعث ایجاد مشکل و اشتباه در شمارش گلبول های سفید می شود. بنابراین حجره شمارش و لامل باید بلافاصله پس از انجام آزمایش تمیز شوند.
5- هنگامی که یک هموسیتومتر پر می شود شمارش سلول ها باید بدون تاخیر انجام شود. اگر مدت زمان زیادی از آن گذشت مایع درون حجره بخار شده و باعث ایجاد اشتباه در شمارش گلبول های سفید می شود.
6- در روش شمارش دستی گلبول های سفید، تقریباً 15 -10 درصد وجود دارد.
هـ – شمارش تصحیح شده گلبول های سفید
محلول های رقیق کننده گلبول های سفید همه سلول های بدون هسته را لیز می کنند. در برخی حالات مثلاً در پاسخ به کم خوی، گلبول های قرمز هسته دار (NRBD) در خون محیطی به تعداد زیادی مشاهده می شوند و چون این سلول ها هسته دار هستند از گلبول های سفید تشخیص داده نمی شوند. بنابراین در شمارش گلبول های سفید بر روی گسترش خون رنگ آمیزی شده هرگاه در برابر 100 عدد گلبول سفید 5 عدد یا بیشتر گلبول قرمز هسته دار مشاهده شود باید تعداد گلبول های سفید مطابق زیر تصحیح شود:

شاخص های گلبول قرمز (Red Blood Cell Indices)
شاخص های گلبول قرمز بریا توصیف اندازه گلبول ها و میزان هموگلوبین آنها به کار می رود و از شمارش گلبول قرمز، غلظت هموگلوبین و هماتوکریت به دست می آیند. شاخص های گلبول قرمز در مشخص کردن خصوصیات مرفولوژیک کم خونی ها مفید هستند. هنگامی که اندازه گیری این شاخص ها با بررسی گلبول های قرمز بر روی گسترش خون طبیعی محیطی توام باشد، می توان تصویر واضحی از مرفولوژی گلبول های قرمز به دست آورد.
1- حجم متوسط گلبولی یا mcv (Mean Corpuscular Volume)
حجم متوسط گلبولی عبارت است از متوسط حجم هراریتروسیت که به وسیله رابطه زیر محاسبه و بر حسب فمتولیتر (fl) بیان می شود:

10* هماتوکریت = MCV
تعداد گلبول های قرمز ( بر حسب میلیون در میلی متر مکعب )
یک فمتولیتر (fl) برابر با 15-10 لیتر یا یک میکرومتر مکعب است.

بحث
1- MCV نشان دهنده حجم متوسط گلبول های قرمز است. گلبول قرمز با MCV به میزان طبیعی نورموسیت است. اگر MCV کمتر از میزان طبیعی قرمز میکروسیت و اگر بیشتر از میزان طبیعی باشد ماکروسیت است.
2- گلبول های قرمز نرموسیتیک در کم خونی های ناشی از سرکوب مغز استخوان بخصوص در بیماریهای مزمن مانند عفونت ها، بدخیمی ها و برخی از اختلالات غدد درون ریز دیده می شوند.
3- گلبول های قرمز ماکروسیتیک در کمبود ویتامین B12 و فولات، پس از برداشت طحال، بیماری های شدید کبدی و برخی از لوسمی ها و همچنین در دوره فروکش کردن خونریزی های حاد یا کم خونی همولیتیک حاد به علت رتیکولوسیتوز مشاهده می شوند.
4- گلبول های قرمز میکروسیتیک عمدتاً در کم خونی ناشی از فقر آهن مشاهده می شوند.

فهرست مطالب
مقدمه 1
روش های خون گیری از ماهی: 2
مواد و روش کار: 5
روش میکروهماتوکریت Microhatocrit 6
نتایج: 8
بحث: 11
تهیه گسترش خون (Blood Smear Preparation) 13
1- روش تهیه گسترش بر روی لام یا روش دو لامی یا گوه ای 15
2- روش تهیه گسترش بر روی لامل 17
3- روش تهیه گسترش اتوماتیک یا چرخشی 19
رنگ آمیزی به 3 روش 20
بحث در روش گسترش با 2 لامل 23
مقدمه 24
ترومبوسیت ها (پلاکت ها): Thrombocytes 27
محلول های رقیق کننده Diluting fluids 28
لام هموسیتوقر 3 دسته اند: 30
لام مخصوص شمارش سلول های خونی (Counting Chamber) 31
روش شمارش سلول های خونی 40
محلول جهت کردن گلبول های سفید درماهیان: 49
شاخص های گلبول قرمز (Red Blood Cell Indices) 55

1