موضوع :
استخراج دوفازی آبی تمایلی بیوملکول ها
استاد:
دانشجو:
تابستان 94
Contents
مقدمه 4
هیدرات های کربن 5
بیومولکول ایزومریها 6
لیپیدها 6
پروتئین 8
استخراج 9
روش های جدا سازی مایع 10
استخراج مایع- گاز 10
استخراج مایع- جامد 11
استخراج سیال فوق بحرانی 11
استخراج دوفازی آبی تمایلی 14
سیستم دوفازی آبی پلیمر/ پلیمر 17
سیستم دوفازی آبی پلیمر/ نمک 18
سیستم دوفازی آبی بر پایه ی مواد فعال سطحی 19
تاثیر نوع سیستم دوفازی بر میزان استخراج آنزیم 26
اثر غلظت نمک بر میزان استخراج آنزیم لیپاز 28
تاثیر بار حجمی سوسپانسیون آنزیمی بر استخراج لیپاز 29
اثرpH، بر میزان استخراج آنزیم 31
اثر نسبت حجمی فازها بر میزان استخراج آنزیم لیپاز 33
نتیجه گیری 34
مقدمه
تغذیه و تنفس: یعنی فرآیندی که طی آن، جاندار با مصرف انرژیهای محیطی (قند، چربی، پروتئین) و استفاده از اکسیژن (تنفس) باعث بقای خودش میشود. تنفس دو حالت دارد:
داخلی: تنفس سلولی در میتوکندری
خارجی: تنفس شُشی رشد و نمو. هرموجود زنده طی فرآیندهای مشخصی که در هر سلول بدن رخ میدهد، رشد پیدا میکند و در مرحله ای از حیات سلولهای آن تمایز پیدا می کنند. (تمایز به معنی تخصصی شدن کار سلولها است یعنی هر سلول کارمشخصی به عهده میگیرد(.
ساختار شیمیایی سلول اصولاً سلول از مواد آلی ساخته شده است. در ساختار مواد آلی 4 عنصر اصلی کربن، هیدروژن، اکسیژن و نیتروژن دیده میشود. از بین این 4 عنصر در بدن موجودات زنده اکسیژن فراوانترین عنصر است. مواد آلی معمولاً توسط موجودات زنده سنتز می گردند و عنصر اصلی در ساختار تمام آنها عنصر کربن است. چهار گروه مهم از ترکیبات آلی بدن جانداران عبارتند از: [1]
هیدراتهای کربن – لیپیدها – پروتئینها – اسیدهای نوکلئیک
گام مهم در طراحی هر سیستم فرآیند تخمیری، رشدمناسب، روش های موثر جداسازی و تخلیص محصولات مطلوب است. از آنجا که اکثر بیومولکول ها دامنه پایداریبسیار کمی در برابر تغییرات pH، درجه حرارت، فشار اسمزی،بار سطحی و… دارند؛ انتخاب روش اختصاصی سازگارجداسازی و تخلیص چالش برانگیز و مهم است. در بین فرآیندهای جداسازی محصولات فرآیندهای شیمیایی،استخراج مایع- مایع راهکاری مناسب محسوب می شود. بهطور کلی، استخراج مایع – مایع، با انتقال اجزاء خاص از یکفاز به فاز دیگر انجام میشود. این فازها در یکدیگر نامحلول یانیمه محلول هستند و در تماس با هم قرار دارند. اما استخراج مایع – مایع که در صنعت و با به کارگیری حلال های آلی انجام می شود برای بازیابی محصولات فرآیندهای زیستی مناسب نیست زیرا بیومولکول هایی مانند پروتئین به اندازه کافی در حلال های آلی قابل انحلال نیستند و احتمال از بین رفتن آن ها وجود دارد. بنابراین سیستم های دو فازی آبی بایدجایگزین سیستم آب و حلال آلی شوند[2].
هیدرات های کربن
این گروه از فراوانترین مواد آلی موجود در طبیعت هستند گاهی کربوهیدراتها را مشتقات آلدهیدی یا کتونی الکل پلی هیدریک میدانند. بطور کلی کربوهیدراتها به انواع زیر طبقه بندی میکنند:
مونوساکاریدها: از یک واحد قندی ساخته شده اند.
دی ساکاریدها: از اتصال دو واحد قندی به یکدیگر ایجاد میشوند.
پلی ساکاریدها: از اتصال بیشتر از دو واحد قندی که شامل (هوموگلیکانها، هتروگلیکانها) ایجاد میشوند. مونوساکاریدها ممکن است دارای عامل آلدئیدی و یا دارای عامل کتونی باشند که بر این اساس نامهای متفاوتی دارند. مهمترین آنها عبارتند از: تریوزها، تتروزها، هپتوزها، هگزوزها
بیومولکول ایزومریها
بطور کلی چند نوع ایزومری در قندها وجود دارد که به شرح زیر هستند:
انانتیومر: تصویر آینه ای ایزومری .اگر مولکول قند نورپلاریزه را به طرف راست منحرف کند آن را با علامت (+) نشان داده و بنام راست بر می نامند و اگر مولکول قند نورپلاریزه را به طرف چپ منحرف کند آن را با علامت (-) نشان داده و بنام چپ بر می نامند.
لیپیدها
لیپیدها از 3 عنصر کربن، هیدروژن و اکسیژن ساخته شدهاند که میزان اکسیژن در آنها کمتر از دو عنصر دیگر است. لیپیدها ترکیباتی هیدروفوب (آبگریز) و دارای یکسری زنجیرهها هستند که باعث میشود خواص این مواد تغییر کند. به عنوان مثال آنها در آب غیر قابل حل باشند. لیپیدها به چند دسته تقسیم میشوند:
تری گلیسیریدها: تری گلیسیریدها، چربیهای خنثی هستند. اجزای تشکیل دهنده این نوع لیپیدها شامل یک گلیسرول و 3 زنجیره اسید چرب است که در برخی موارد زنجیرههای اسید چرب متصل شده به اسکلت گلیسرولی ممکن است اشباع یا غیراشباع.
استروئیدها:
استروئیدها ساختارهای 4 حلقهای از اتمهای کربن هستند. مهمترین استروئید، کلسترول 27 کربنه است. کلسترول در غشا نیز وجود دارد و تنظیم سیالیت آن را برعهده دارد. همچنین به عنوان مهارکننده جنبشهای فسفولیپیدی غشایی عمل میکند. کلسترول در دماهای بالا و پایین تغییراتی در غشا میدهد و خاصیت دوگانه دارد. این لیپید مختص سلولهای جانوری است. در پروکاریوتها برخی از اسیدهای چرب در کنترل سیالیت غشا نقش دارند. اگر استروئید دارای گروه هیدروکسیل شود به آن استرول میگویند. استروئیدها در بدن انسان در قشر فوق کلیه و در گُنادها به وفور یافت میشوند، چون هورمونهای استروئیدی از آنها ساخته میشوند. ترکیبات دارای استروئید اگر چه خواص چربیها را ندارند، اما به راحتی از غشای سلول عبور میکنند. [3]
پروتئین
پروتئینها اساس ساختار بدن را تشکیل میدهند. ویژگی مهم آنها این است که علاوه بر کربن، اکسیژن و هیدروژن دارای نیتروژن نیز هستند. پروتئینها از واحدهای اسیدآمینه ساخته شدهاند و خود اسیدهای آمینه طبقه بندیهای مختلفی دارند. ساده ترین اسیدآمینه گلایسین است. پروتئینها در غشای سلولی نقشهای مختلفی دارند و میتوانند به عنوان گیرنده، کانال یا ناقل عمل کنند. از نظر درصد جِرمی در غشا، بیشترین ماده پروتئین است که زیاد بودن وزن آن به علت وجود عنصر نیتروژن در داخل مولکولهای پروتئین است. پروتئینها عملکردهای مختلفی دارند، به عنوان مثال میتوانند نقش ساختاری داشته باشند مثل پروتئینهایی که در تشکیل اسکلت سلولی یا اسکلت هسته ای نقش دارند. همچنین میتوانند نقش آنزیمی داشته باشند.
استخراج
استحصال یک گونه ی شیمیایی از نمونه های طبیعی یا آزمایشگاهی به منظور آنالیز یا کاربرد داروئی، خوراکی و صنعتی آنها مستلزم حذف سایر گونه های شیمیائی همراه در داخل نمونه است. به بیان دیگر همواره لازم است که گونه ی شیمیایی مورد نیاز خالص سازی شده سپس برای اهداف نامبرده مورد استفاده قرار گیرد. کلیه ی اعمال و فرایندهای فیزیکی یا شیمیایی که در این راستا به کار می روند، به نام روش های جداسازی نامیده می شوند. از روش های جداسازی می توان ته نشینی، نوبلورسازی، انجماد، تبخیر، تقطیر، استخراج مایع- مایع، استخراج فاز جامد، استخراج قطره ای، میکرواستخراج با فاز جامد، استخراج با گاز، مبادله ی یونی، جذب سطحی، کروماتوگرافی، الکتروکروماتوگرافی، الکترودیالیز، دیالیز و … نام برد. استخراج مایع- مایع به طور گسترده ای به عنوان یک تکنیک پیش تیمار برای جداسازی و پیش تغلیظ آنالیت در نمونه های آبی برای ترکیبات آلی و معدنی استفاده می شود. با این وجود این تکنیک دارای چندین نقطه ضعف از جمله تشکیل امولوسیون، استفاده از حجم زیاد حلال، گرانی روش و دشواری در اجرای روش می باشد. از این رو نیاز به دسته بندی نمودن استخراج مایع- مایع شد[4].
روش های جدا سازی مایع
استخراج مایع- گاز
استخراج مایع- گاز به طور گسترده ای برای گرفتن آلودگی های اتمسفری با روش های دینامیک یا غیرفعال استفاده می شود. نمونه گیری و پیشتغلیظ از آنالیت ها در یک مرحله می باشند. اخیراً مایعات می توانند به عنوان یک فاز جمع آوری کننده در بعضی تکنیک های فضای فوقانی استفاده شوند.
استخراج مایع- جامد
استخراج مایع- جامد برای جداسازی آنالیت ها از جامدات یا ماتریکس های سفید جامد به داخل حلال ها برهمزدن یک نمونه ی جامد در یک حلال گرم یا سرد انجام شود .
استخراج سیال فوق بحرانی
روش های استخراج سازگار با محیط اساساً به این معنی است که برای پیشتغلیظ نمونه از حلال های سازگار با محیط از جمله آب، سیال فوق بحرانی و مایعات یونی و غیره استفاده شود. استخراج سیال فوقبحرانی و آب فوق بحرانی جزء روش های استخراج سازگار با محیط می باشند. جدول4 خصوصیات فیزیکی و شیمیایی ترکیباتی را که به عنوان سیال فوق بحرانی در روشهای نوین جداسازی استفاده میشود را نشان میدهد.
خصوصیات فیزیکی ترکیبات معمول مورد استفاده به عنوان سیال فوق بحرانی.
سیال فوق بحرانی، تداخل فیزیکی بین حالت مایع و گاز میباشد که دارای خصوصیات منحصر به فردی می باشد. از خصوصیات این مایعات ویسکوزیتهی پایین تر از سایر تزکیبات، اجازه ی نفوذ سریع و به دنبال آن بازده بیشتر استخراج را می دهند. به وسیله ی بعضی سیال ها، استخراج سیال فوق بحرانی توانایی انجام یک استخراج انتخابی را مطابق با خصوصیات سیال به وسیله ی تنظیم کردن فشار، دما و مقادیر تعدیل شده می توان به دست آورد. دیاکسیدکربن یک حلال رایج انتخابی برای اندازهگیری ترکیبات غیرقطبی است، که استخراج با بازده بالا برای ترکیبات غیرقطبی یا با قطبیت پایین را انجام می دهد. حلال کربونیل ترکیب شده با دیاکسیدکربن یک یا مقادیر بسیار کمتر از تعدیل کننده ها سودمندی آن را برای ترکیبات قطبی حتی ترکیبات یونی را توسعه داده است. بیشمار پارامترهای تعدیلپذیر نه تنها استخراج سیال فوق بحرانی را تغییر نمی دهند، همچنین بهینهسازی و استفاده از آن را مشکل می کنند. نقاط مهم در مساعدت از استخراج سیال فوق بحرانی وابسته به زمان استخراج کوتاه، فشار ملایم و دمایی که استفاده می شود است، که خطرات کم شدن ظرفیت و باقی نگهداشتن تمامیت ترکیبات عاملی از غذا و فرآورده های طبیعی و ترکیبات ناپایدار از نمونه های محیطی را استخراج می کند. استخراج سیال فوق بحرانی بهترین کارکرد را برای پودرهای ریز جامدات با نفوذپذیری جذب از جمله جامدات و مواد گیاهی خشکبار دارد. استخراج از نمونه های آبی و مرطوب و محلولها نیز می تواند با سیال فوق بحرانی انجام شود اما با تعدادی مشکل. شکل زیر نمایی از این نوع استخراج را نشان میدهد[5].
وسیلهی اندازهگیری استخراج با سیال فوق بحرانی.
استخراج سیال فوقبحرانی و سیال زیربحرانی تکنیک های متناظر با استخراج آب زیربحرانی و استخراج فشار مایع هستند.
گیراندازی حلال در استخراج سیال فوق بحرانی.
استخراج دوفازی آبی تمایلی
در بین فرایند هـا ی موجـود بـرای جداسـازی محصـولات فراینـد هـا ی شـیمیایی ، اسـتخراج مـایع- مـایع یـک راهکـار مناسـب محسوب میشود .به طور کلی، استخراج مایع- مایع، با انتقـال اجـزاء خـاص از یـک فـاز بـه فـاز دیگـر انجـام مـی شـود کـه ایـن فاز هـا در یکـدیگر نـامحلول یـا نیمـه محلـول هسـتند و در تمـاس بـا هـم قـرار گرفتـه انـد. امـا اسـتخراج مـایع- مـایع کـه درصنعت و با به کارگیری حلال های آلی انجـام مـیشـو د بـرای بازیـابی محصـولات فراینـد هـا ی زیسـتی مناسـب نمـی باشـد . چـراکه بیومولکول هایی مانند پـروتئین بـه انـداز ه ی کـافی در حـلال هـای آلـی قابـل انحـلال نیسـتند و احتمـال از بـین رفـتن آنهـا وجــود دارد .بنــابراین جــایگزین کــردن سیســتم آب و حــلال آلــی بــا سیســتم هــای دوفــازی آبــی مــیتوانــد انجــام شود.سیستم های دوفازی آبـی شـامل دو پلیمـر نـاسـازگار، یـک پلیمـر و یـک نمـک و یـا مـواد فعـال سـطحی در محلـولهـا ی آبـی مـی باشـد . اگـر ایـن اجزاء تشـکیل دهنـد ه ی فازهـا در غلظتـی بـالاتر از غلظت بحرانـی بـا هـم آمیختـه گردنـد، دوفازی شدن رخ خواهد داد. هـر فـاز بـه طـور عمـده شـامل آب (70 تـا90 درصـد وزنـی) و یـک جزء مـی باشـد . ویژگـی هـای متفـاوت الکترواستاتیکی اجزاء تشکیل دهنده ی هر فـاز باعـث مـی شـود تـا بیومولکـول هـا یی ماننـد پـروتئین هـا و آنـزیم هـا در یـک فـازتجمــع یابنــد و جــدایش آن هــا از ناخالصــی هــا انجــام شــود . اســاس ایــن جداســازی توزیــع اختصاصــی یــک بیومولکــول مشخص در دوفاز است که به مشخصـه هـا ی فازهـا، خـواص بیومولکـول و بـر هـم کـنش میـان آنهـا بسـتگی دارد . بـه علـت ماهیت آبی هردوفاز و کشش سطحی پایین (در مرتبه ی بزرگ ی – N.m50-1) در سیستم دوفازی آبی ،سطح تماس بسیار زیاد بین فاز ها وجود دارد و انتقـال جـرم مناسـب از یـک فـاز بـه فـاز دیگـر انجـام می شـود . بـه عـلاوه، پلیمـرهـای مـورداســتفاده بــرای دوفــازی شــدن محلــول آبــی ،نتــایجی را ارائــه مــی کننــد کــه حــاکی از افــزایش فعالیــت زیســتی و پایــداریپروتئین ها و آنزیم ها است .بـا توجـه بـه شـرایط محیطی معمـولی عـلاوه برجداسـازی سـریع و مقـرون بـه صـرفه، مـی تـوان از آن به عنوان یک روش جدید برای جداسازی پروتئینها استفاده نمود . سیستم های دوتایی مایع میتوانند با استفاده از محلول دو پلیمری که از پلیمر و یک نمک تشکیل شوند. این سیستم ها که با عنـوان سیسـتم هـا ی دوفـازی آبـی بررسـی مـی شـوند در سـال6981 توسـط ام . بیجرنیـک 1، میکروبیولوژیسـت آلمانی بـا مشـاهده ی دوفـازی شـدن محلـول ژلاتـین و آگـار مـورد توجـه قـرار گرفـت . هرچنـد گـزارش اولـین مشـاهده مـورد توجه قرار نگرفت تـا آن کـه آلبـرت سـان ، بیوشـیمیدان سوئیسـی در سـال 6591 م محلـول آبـی در حضور مـواد خـاص را بررسـی کـرد و آن را بـه عنـوان یـک پدیـده ی جدیـد بـرای جداسـازی اجـزاء غشـاء سـلولی یـا سـایرارگان هــای داخــل ســلول از محصــولات تجزیــه ای ســلولی و همچنــین خــالص ســازی اختصاصــی پــروتئین هــا و آنــزیم هــا معرفی کرد[6].
پروتئازها از مهم ترین آنزیم هـا ی صـنعتی بـه حسـاب مـی آینـد کـه سـهم شش درصـدی کـل بـازار آنـزیم جهـانی را بـه خـوداختصــاص داده انــد. پروتئــازهــا دارای کــاربرد هــای صــنعتی در تولیــد شــوینده هــا، صــنایع غــذایی، دارویــی، نســاجی وغیره می باشند. انواع پروتئاز هـا منـابع حیـوانی، گیـاهی، باکتریـایی و قـارچی را دارا مـی باشـند. مطالعـات انجـام شـده نشـان میدهند کـه جداسـازی آنـزیم پروتئـاز هـا از منـابع مختلـف ذکـر شـده بـا اسـتفاده از سیسـتم هـای دوفـازی آبـی امکـان پـذیراست.در بـین منـابع حیـوانی، مـاهی تـن بسـیار زیـاد صـید مـی شـود . اعضـای داخلـی بـدن آن کـاربری غـذایی نـدارد و حـاوی مقادیر زیادی از پروتئازهاست. در بین نتایج استخراج پروتئاز با استفاده از سیستم آبی دو فازی پلی اتیلن گلایکول و منیزیوم سولفات، تا نسبت غلظـت3 برابـر پـروتئین در فـاز بـالا بـه فـاز پـایین مشـاهده شـده اسـت .در یـک پـژوهش، بـا هدف پیدا کردن شرایط بهینه ی جداسازی پروتئاز موجود در پوست میو ه ی انبه، سیستم دوفازی آبی الکل و نمک مورد بررسی قـرار گرفـت. در ایـن سیسـتم اتـانول و پروپـانول و نمـک هـا ی سـدیم سـیترات و پتاسـیم فسـفات بـه کـار گرفتـه شد .همچنین در منابع، اسـتخراج آنـزیم پروتئـاز از شـیره ی یـک گونـه گیـاه اسـتوایی بـا اسـتفاده از سیسـتم دوفـازی آبـی گــزارش شــده اســت[7] . محصــول فراینــد تخمیــر میکروارگانیســم کلســتریدیوم پرفینژنــاز حــاوی پروتئــاز اســت. در یــک مطالعه استخراج پروتئاز با استفاده از سیستم دوفازی آبی پلی اتیلن گلایکول و سدیم سیترات انجام شد. در این مطالعــه، غلظــت هــای متفــاوت نمــک و پلیمــر (بــا وزن مولکــولی متفــاوت ) مــورد بررســی قــرار گرفــت و در بهتــرین حالــت جدایش، غلظـت پـروتئین در فـاز بـالا بـه3/5 برابـر غلظـت آن در فـاز پـایین گـزارش شـد. پروتئـاز بـا منبـع قـارچ نیـز ازجمله محصولاتی است کـه جداسـازی آن بـا ایـن روش مطـرح اسـت. در ایـن زمینـه قابلیـت پروتئـاز اسـیدی حاصـل از تخمیـرگونه ی پنـی سـیلیوم روکفـورتی بـرای جداسـازی بـا سیسـتم دوفـازی آبـی مـورد آزمـایش قـرار گرفـت و شـرایط بهینـه بـرای انجام آن مشخص شـد. در برخـی فراینـد هـا ی تخمیـری ، پروتئازهـا بـه عنـوان محـدود کننـده بـرای رشـد میکروارگانیسـم به حساب می آیند. بنابراین اسـتخراج همزمان بـا تخمیـرباسـیلوس کـروس مـورد مطالعـه قـرار گرفـت کـه در آن بـا اسـتفاده از سیستم دوفازی آبی محلول داخل فرم انتور به دوفاز تبدیل میشود. بنابراین برای رفع مشکل محدودیت محصول پروتئینی میتوان پژوه شهای بیشتری در این زمینه انجام داد.
تـا به حال سیستم های دوفازی آبی بر اساس اجـزاء تشکیل دهنده ی فازهای آنها در چهار دسته ی اصلی طبقه بندی شده اند. 1)پلیمر/پلیمر 2)پلیمر/ نمک)3 مواد فعال سطحی 3)مایع یونی/ نمک .
موارد سوم و چهارم جـزء یافته های دانشمندان در سال های اخیـر هسـتند و بـه عنـوان نـوآوری در زمینـه ی سیسـتم هـا ی دوفـازی آبـی مطـرح شـده انـد.
سیستم دوفازی آبی پلیمر/ پلیمر
در سیستم دوفازی آبی پلیمر/پلیمر، ویژگی های سطحی پلیمرهایی که از نظر الکترواستاتیکی غیره سازگارهستند عامـل دوفـازی شـدن محلـول آبـی مـی باشـد. پلـی اتـیلن گلایکـول و دکسـتران بـا وزن مولکـولی بـالا دو پلیمـری هستند که به خاطر ساختار فیزیکی و شیمیایی پایدار و خصوصیات غیرسمی برای جداسازی محصولات فراینده ای زیستی به کار میروند .هرچنـد سـه مشـکل در کـاربرد هـای عملـی دارنـد؛اولا، فـاز غنـی از دکسـتران در سیسـتم دوفـازی آبـی پلی اتیلن گلایکول/دکستران گران روی زیادی دارد که جدایش فازها را سخت میکند. دوم آنکه ،قیمت بالای دکستران کاربرد آن برای استخراج در مقیاس صنعتی را محدود میکند. و سومین مساله که ذکر آن لازم است، مشکلات اجرای سیستم بازیابی برای پلیمر ها در یک فرایند جداسازی است.
برای رفع مشکلات ذکر شده، بسیاری از پلیمر های جدید در سال های اخیر معرفی شده اند. پژوهش گران برای جایگزین کـردن دکسـتران گـران قیمـت بـا پلیمـر هـا ی ارزان تـر ماننـد زانتـان و مشـتقات نشاسـته در سیسـتم دوفـازی آبـی،مطالعات زیادی را انجام داده انـد. در یـک بررسـی آزمایشـگاهی، بـا اسـتفاده از سیسـتم دوفـازی آبـی پلـی اتـیلن گلایکـول و زانتان، پروتئین آلبومین سرم گاوی استخراج شد. از ویژگیهای این سیستم میتوان به گران روی پایین زانتان و امکان بازیابی آن اشاره کرد[8] .
سیستم دوفازی آبی پلیمر/ نمک
سیستم های آبی دوفـازی پلیمـر/نمـک، نسـبتا از سیسـتم هـا ی پلیمـر/ پلیمـر ارزان تـر هسـتند و کـاربرد ها ی گسـترده ای در بیوتکنولــوژی دارنــد . در بــین مــوارد ی کــه بــرای جداســازی اســتفاده مــیشــود، سیســتم دوفــازی آبــی پلــی اتــیلن گلایکــول/فســفات تــرجیح داده مــیشــود .چــرا کــه مشخصــه هــایی ماننــد هزینــه ی کــم، گرانروی جدایش سـریع و کـاربرد هـای گسـترده دارد.بـه طـور کلـی در بیشـتر ایـن سیسـتمها،فـاز غنـی از پلیمـر در قسـمت بـالاتجمع مییابد و فاز غنی از نمک در قسمت پایین جمع میشود.
در یک مطالعه، از سیستم دوفازی آبـی پلـی اتـیلن گلایکـول و منیزیـوم سـولفات (پلیمـر /نمـک ) بـرای خـالص سـازی آنـزیم اینورتاز که از مخمر نـان استحصـال مـی شـود، اسـتفاده شـد. در ایـن بررسـی تمایـل زیـاد آنـزیم اینورتـاز بـرای تجمـع در فـازغنی از نمک گزارش شد. چنین میتـوان اسـتنباط کـرد کـه آنـزیم اینورتـاز بسـیار آب دوسـت اسـت . چـرا کـه آب گریـزی فـازقسمت بالا حاوی پلی اتیلن گلایکول بسـیار بیشـتر از فـاز پـایین اسـت. شـایان ذکـر اسـت که در حضـور مقـدار مشـخص پلـی اتیلن گلایکول افزایش دادن ترکیب درصد وزنی منیزیوم سولفات تا 02% به شاخص های جداسازی بهتر منجر شد . [9]
سیستم دوفازی آبی بر پایه ی مواد فعال سطحی
در ایــن سیســتم هــا، دوفــازی شــدن بــا اســتفاده از توانــایی مــواد فعــال ســطحی بــرای تشــکیل ســاختار مایســلار انجــام میشود .که ممکن است از یـک مـاده ی فعـال سـطحی یـا مخلـوطی از آن هااسـتفاده شـود . در سیسـتم دوفـازی آبـی بـر پایـه ی یک ماده ی فعال سطحی (اغلبـا مـواد فعـال سـطحی غیـر یـونی)، یـک فـاز تهـی از مولکـولهـا ی مـاد ه ی فعـال سـطحی و یـکفاز حاوی ماده ی فعال سـطحی خـواهیم داشـت. ایـن فراینـد بـه خـاطر ماهیـت دوگانـه دوسـت مـواد فعـال سـطحی و از طریـق ایجاد ساختار مایسل امکـان پـذیر اسـت. مایسـلهـا یـک محـیط آب گریـز، بسـته و مسـتقل بـرای محصـولات زیسـتی ایجـادمی کنند .بنابراین استفاده از ایـن روش بـرای جداسـازی بیومولکـول هـا ی آب گریـز مناسـب اسـت در حـالی کـه باقیمانـده هـا ی آب دوست در فاز تهی از سـورفکتنت تجمع می یابند و جداسازی آنها ممکن میشود .موارد متعددی از استفاده از مخلوط مواد فعـال سـطحی (کـاتیونی یـا آنیـونی) در سیسـت م هـا ی دوفـازی آبـی بـرای جداسـازی بیومولکـولهـا گـزارش شـده است .دو مزیت اصلی سیستمهای دوفازی آبی برای جداسازی بیومولکولها عبارت اند از[9]؛
1) هردو فاز بالا و پایین دارای محتـوای بالای آب( تا 99%) هستند ،چرا که غلظت کل مـواد فعال سطحی پایین انتخاب میشود.
2) بارهای مثبت و منفی در این نوع از سیستم دوفـازی آبـی بـه خـاطر وجـود مـواد فعـال سـطحی کـاتیونی و آنیـونی مـی توانـد بـه بـرهمکنشهای قوی آنها با بیومولکولها در فرایند استخراج منجر شود سیستم دوفازی آبی برپایه ی مایع یونی
مایعــات یــونی معمــولا از کــاتیونهــای آلــی بــزرگ و آنیــو نهــای غیــر آلــی کوچــکتر تشــکیل شــده انــد. ایــن نــوع از سیستم های دوفازی آبی یـک نـوآوری در جداسـازی محصـولات فراینـدهای بیوتکنولـوژی عرضـه مـی کنـد . پـژوهشهـا در ایـن زمینه به منظور یافتن یک سیستم دوفازی آبی سازگار با محصولات بیوتکنولوژی ادامه دارد . مطالعات انجام شده استخراج آلکانوئیـد ، تستوسـترون و اپـی تستوسـترون را گـزارش کـرده انـد.
بررسـیهـا نشـان مـی دهنـد کـه بـرهم کـنش هـا ی آبگریزی، الکترواسـتاتیکی و نمـک هـای متفـاوت پارامترهـای تـاثیر گـذار بـر جداسـازی پـروتئینهـا بـا اسـتفاده از ایـن روش هستند . یکی از چالش های موجـود در جداسـازی آنـزیمهـا ی صـنعتی بـا اسـتفاده از سیسـتم دوفـازی آبـی، تعیـین بهتـرین سیسـتم برای جداسازی یـک آنـزیم مشـخص اسـت. همـان طـور کـه ذکـر شـد، جداسـازی یـک پـروتئین بـه مجموعـه ی پـارامتر هـا یی مانند آب گریـزی، وزن مولکـولی، خـواص الکتروشـیمیایی، شـکل مولکـولی پـروتئین و اجـزاء تشـکیل دهنـده ی فازهـا بسـتگی دارد.
از آنجا که مکانیسـم دقیـق ایـن فراینـد نامشـخص اسـت و رفتـار قابـل پـیش بینـی نـدارد، بنـابراین بـرای تعیـین حالـت بهینــه، بایــد شــرایط مختلــف را مــورد آزمــایش قــرار داد به طور کلی گروههای سطحی پروتئینها و نحوه ی تماس آ نها با اجزاء تشکیل دهند ه ی فازها بر جداسازی پروتئین ها بـا اسـتفاده از سیسـتم آبـی دو فـازی تـاثیر مـی گـذارد .
پـروتئین از آمینواسـید هـایی تشـکیل شـده اسـت کـه دارای گروه هـای بـار دار بـا بـار مثبـت یـا منفـی (بسـته بـه مشخصـات اسـیدی بـودن یـا بـازی بـودن گـروه) هسـتند و مجمـوع بـارالکتریکی گروه هـا ی آمینـو اسـید بـار خـالص پـروتئین نشـان مـی دهـد . همچنـین سـطح پروتئین هـا ی کـروی دارای گـروه هـا ی آب گریز و غیر قطبی هستند. بنابراین می توان پیشنهاد داد که توزیع گروه های آبدوست و آبگریز و ترکیبات بــاردار و گــرو ههــای قطبــی در ســطح پــروتئین، حلالیــت یــک پــروتئین در محلــول آبــی و در نهایــت جــدایش آن را تعیــین میکند یکی از مهـم تـرین مراحـل ، تعیـین دیـاگرام فـاز اسـت کـه بـرای سیسـتم هـا ی مختلـف (بسـته بـه نـوع پلیمـر، نمـک و یـا ماده ی فعال سطحی) متفاوت است[10].
اطلاعاتی که میتوان از دیاگرام فاز به دست آورد، عبارت اند از؛
• غلظت های لازم برای تشکیل سیستم با دو فاز که در حال تعادل با یکدیگرند
• غلظت های هر یک از اجزاء تشکیل دهنده ی فازها در قسمتهای بالایی و پایینی
• نسبت حجم هریک از فا زها
گام مهم در طراحی هر سیستم فرآیند تخمیری، رشد مناسب، روش های موثر جداسازی و تخلیص محصولات مطلوب است. از آنجا که اکثر بیومولکول ها دامنه پایداری درجه حرارت، فشار اسمزی، ،pH بسیار کمی در برابر تغییرات بار سطحی و… دارند؛ انتخاب روش اختصاصی سازگار جداسازی و تخلیص چالش برانگیز و مهم است. در بین فرآیندهای جداسازی محصولات فرآیندهای شیمیایی، استخراج مایع- مایع راهکاری مناسب محسوب می شود. به طور کلی، استخراج مایع – مایع، با انتقال اجزاء خاص از یک فاز به فاز دیگر انجام میشود. این فازها در یکدیگر نامحلول یا نیمه محلول هستند و در تماس با هم قرار دارند. اما استخراج مایع – مایع که در صنعت و با به کارگیری حلال های آلی انجام م یشود برای بازیابی محصولات فرآیندهای زیستی مناسب نیست زیرا بیومولکول هایی مانند پروتئین به اندازه کافی در حلال های آلی قابل انحلال نیستند و احتمال از بین رفتن آن ها وجود دارد. بنابراین سیستم های دو فازی آبی باید جایگزین سیستم آب و حلال آلی شوند[10].
سیستمهای دو فازی آبی شامل دو پلیمر ناسازگار، یک پلیمر و یک نمک و یا مواد فعال سطحی در محلول های آبی می باشد. سیستم دو فازی آبی محیطی خاص را به وجود م یآورد که منجر به جداسازی بیومولکول ها یا مولکول های هدف در یک فاز م یشود. از آنجا که بخش عمده ای از هر دو 80 %) شامل آب است بنابراین ساختار ذاتی -% فاز ( 85 بیومولکول ها حفظ میشود[11].
استخراج با استفاده از سیستم دوفازی آبی جایگزین بسیار مناسبی برای مراحل متعدد فرآیندهای پایین دستی مانند تصفیه ، تغلیظ و… می باشد. به علاوه انتقال جرم تعادلی به سادگی حاصل می گردد و جداسازی به سرعت انجام می شود. سیستم دو فازی آبی قابلیت استفاده در مقیاس صنعتی بزرگ و در کشت های پیوسته را دارد. سیستم های دوفازی آبی پلیمر- پلیمر و سیستم های پلیمر-نمک نسبت به روش های متداول استخراج با حلال های آلی مزیت های بیشتری دارند و از آنها به طور گسترده برای جداسازی پروتئین و سایر مولکول های زیستی استفاده شده است و PEG جداسازی پروتئی نهای هدف به وزن مولکولی اجزای تشکیل دهنده سیستم دوفازی آبی بستگی دارد زیرا این پارامترها از طریق تغییر میزان برهمکنش های آب گریزی که به برهمکنش بین پلی اتیلن گلایکول و نواحی آب گریز پروتئی نها مربوط م یشود، بر تفکیک پروتئی نها تاثیر م یگذارند. تفکیک مولکول های زیستی در سیستم های ،pH دو فازی آبی همچنین تا حدودی متاثر از عواملی چون دما، خواص سطحی، اندازه و غلظت مولکول های زیستی و نوع پلیمر و نمک است. انتخاب غلظت مناسب نمک از مهم ترین فاکتورهای جداسازی پروتئین ها در سیستم های دو فازی آبی است. افزایش غلظت نمک تا حدی م یتواند موجب کاهش حجم آزاد موجود در فاز نمکی شده و باعث حرکت پروتئی نها به سمت فاز پلیمری شود. در غلظت های بالای آن موجب ترسیب پروتئی نها در salting out نمک خاصیت فصل مشترک دو فاز م یگردد لذا ضریب جداسازی و درصد استخراج بیومولکول های هدف کاهش م ییابد. بنابراین انتخاب درصد مناسب غلظت نمک از اهمیت بالایی برخوردار می باشد[12]
تاثیر نوع سیستم دوفازی بر میزان استخراج آنزیم
ویژه و فاکتور تخلیص آنزیم لیپاز در سیستم های نمکی اگزالات پتاسیم و تارتارات سدیم و پتاسیم را نشان می دهد. نتایج نشان داد که با افزایش وزن مولکولی پلیمرها، پارامترهای فوق کاهش یافتند. خود موجب افزایش هیدراتاسیون (آب پوشی) پروتئین ها رفتار PEG می شود. همچنین با افزایش زنجیره پلیمری آبگریزی آن افزایش می یابد. بنابراین با افزایش وزن مولکولی پلیمر ضریب جداساز ی کاهش می یابد. باید توجه نمود که استفاده از پلیمرهایی با وزن های مولکولی خیلی کم نیز توصیه نمی گردد زیرا با کاهش بیش از حد وزن مولکولی پلیمر، سایر پروتئین ها (غیر از آنزیم ) در فاز پلیمری تجمع می یابند، در نتیجه جداسازی و تخلیص آنزیم از سایر پروتئین ها دشوار خواهد شد. از آنجا که در سیستم شامل نمک اگزالات پتاسیم و پلی اتلین گلیکول 8000 ، ضریب جداسازی سایرپروتئین ها نسبت به آنزیم افزایش یافت بنابراین فاکتورهای فعالیت ویژه آنزیمی و فاکتور تخلیص آنزیم نسبت به سایر پروتئین ها در این سیستم کاهش پیدا کرد. به همین دلیل در ادامه تحقیق، سیستم نمک اگزالات پتاسیم و پلیمر پلی اتیلن گلیکول با وزن مولکولی 4000 انتخاب گردید.
اثر غلظت نمک بر میزان استخراج آنزیم لیپاز
برای بررسی اثر غلطت نمک بر میزان استخراج آنزیم لیپاز در سیستم دوفازی آبی حاوی نمک اگزالات پتاسیم و غلظت محلول نمکی از 16 تا 28 درصد وزنی ، PEG 4000 افزایش داده شد. نتایج نشان داد که با افزایش غلطت نمک درصد استخراج آنزیم به طور محسوسی کم میشود (شکل 2 افزایش غلظت نمک در فاز پایین روی برهمکنش های آبگریز پروتئین ها و فاز پلیمری تاثیر می گذارد. وقتی که ضریب جداسازی آنزیم در فاز پلیمری بیشینه باشد حاکی از آن است که توازن خوبی بین آب گریزی پلیمر و خاصیت نمک وجود دارد. از آنجا که یون های نمک با salting out گروه های باردار با بار مخالف پروتئین ها برهمکنش دارند، با تشکیل لایه های دوتایی از گروه های یونی موجب دهیدراته
شدن حذف مولکول آب پروتئین ها می شوند. این خاصیت آب پوشی یون های نمک و دهیدراته کردن پروتئین ها باعث گسترش نواحی آب گریز پروتئین ها می شود .
تاثیر بار حجمی سوسپانسیون آنزیمی بر استخراج لیپاز
تاثیر بار حجمی سوسپانسیون آنزیمی اضافه شده به سیستم دو فازی در استخراج و تخلیص محصول هدف حائز اهمیت می باشد. میزان بار حجمی سوسپانسیون آنزیمی اضافه شده به سیستم دوفازی نه تنها موجب تغییر نسبت های فازی بلکه موجب تغییر در رفتار ماکرومولکولهای تشکیل دهنده دو فاز و بنابراین موجب تغییر رفتار تفکیک پذیری پروتئین های هدف نیز می شود شکل زیر تاثیر میزان سوسپانسیون آنزیمی اضافه شده را بر استخراج لیپاز در سیستم دوفازی آبی نشان می دهد. افزایش بیش از حد مقدار آنزیم لیپاز و سایر اجزای موجود در سوسپانسیون تخمیری می تواند موجب تغییر نسبت حجمی دو فاز و کاهش کارایی سیستم های دو فازی آبی شود. در این تحقیق مقادیر مختلفی از سوسپانسیون آنزیمی به سیستم های دو فازی حاوی درصدهای یکسانی از محلول هایپلیمری و محلول های نمکی اضافه شد و بررسی ها نشان داد 10 درصد نتایج بهتری برای جداسازی / که در میزان بار حجمی 2 آنزیمی حاصل شد[13].
اثرpH، بر میزان استخراج آنزیم
pH برای مطالعه تاثیر و نمک اگزالات پتاسیم در PEG سیستم دو فازی پلیمر 4000 محدوده 5 تا 9 تنظیم شد. نتایج نشان داد که با افزایش از 5 تا 9 ضریب جداسازی آنزیمی کاهش و ضریب جداسازی پروتئین افزایش یافت آنزیم لیپاز ،pH این بدان معنی است که با افزایش بیشتری در فاز غنی از نمک تجمع یافت. در حالیکه سایر بیشترین پروتئین ها در فاز غنی پلیمر تجمع یافتند. در 5 مقدار فعالیت ویژه آنزیمی و همچنین گزینش پذیری حاصل برای سیستم های دو فازی pH گردید لذا این استخراج آنزیم لیپاز تولید شده مناسب تشخیص داده شد[13]
نتایج مشابهی توسط در استخراج آنزیم لیپاز حاصل از مخمر pH بررسی اثر ارائه شده است به طوری که در acepacia Burkholderi از فعالیت آنزیمی لیپاز حفظ بین 5تا7 محدوده های بازی فعالیت آنزیمی کاهش یافت. مشاهده گردید و در بر آنزیم ناشی از ایجاد تغییر در حالت های pH تاثیر یونیزاسیون مواد تشکیل دهنده سیستم می باشد بنابراین عامل مهمی در استخراج آنزیم ها محسوب می گردد اگر میکروارگانیسم ها در شرایط قلیایی رشد کنند، آنزیم بهینه قلیایی خواهد بود و اگر در شرایط pH تولید شده دارای بهینه اسیدی pH اسیدی رشد کنند آنزیم تولید شده دارای خواهد بود. به طور کلی پروتئین از آمینواسیدهایی تشکیل شده است که دارای گروه های باردار با بار مثبت یا منفی بسته به برخورداری از گروه های اسیدی یا بازی هستند و مجموع بار الکتریکی گروه های آمینو اسید بار خالص محیط برابر با pH پروتئین را تشکیل می دهد. در صورتی که نقطه ایزوالکتریک باشد، مجموع بارالکتریکی گروه های pH یک محلول آبی pH آمینو اسید معادل صفر است. اگر مقدار حاوی پروتئین بالای نقطه ایزوالکتریک باشد، پروتئین دارای بار منفی خواهد بود و در غیر این صورت بار مثبت دارد. سیستم بالاتر از نقطه ایزوالکتریک پروتئین هدف pH چنانچه فرآیند استخراج تنظیم گردد، با برهم کنش الکتریکی بین پروتئین حامل بار منفی و پلی اتیلن گلایکول، استخراج بهتر ممکن است نتیجه pH انجام می شود اما افزایش بیش از حد معکوس در پی داشته باشد
اثر نسبت حجمی فازها بر میزان استخراج آنزیم لیپاز
برای بررسی اثر نسبت حجمی فازهای تشکیل دهنده سیستم استخراج آنزیم، نسبت های حجمی مختلف از دو فاز مورد بررسی قرار گرفت. / 1/25 و 5 ،1 ،0/75 نتایج نشان داد که با تغییر نسبت حجمی فازها ضریب جداسازی آنزیم تغییر چندانی نمی کند باید توجه نمود که رفتار تفکیک پذیری پروتئین ها تحت پذیری نسبی پروتئین تغییر نمی کند. این حقیقت که نسبت حجمی دو فاز می تواند فاکتور تخلیص استخراج آنزیمی را تحت تاثیر قرار دهد از این نظر حائز اهمیت است که با کاهش بیش از حد نسبت حجمی مقدار فاکتور خلوص کاهش می یابد. این امر به دلیل ترسیب و تقلیب برخی پروتئین ها در فصل مشترک دو فاز و ناشی از کاهش حجم فاز بالایی غنی از پلیمر است. زیرا با کاهش شدید حجم آزاد در فاز بالایی میزان لیپاز موجود در این فاز کاهش می یابد لذا برای ارزیابی اثر نسبت حجمی دو فاز بر میزان استخراج آنزیم تنها به یک فاکتور نباید بسنده نمود و پارامترهای دیگری مانند فاکتور تخلیص و فعالیت ویژه آنزیمی نیز به طور همزمان باید در نظر گرفته شوند همان طور که مشاهده گردید در بیشترین مقدار فاکتور / نسبت حجمی دو فاز معادل تخلیص آنزیمی بدست آمد و در این نسبت حجمی از سیستم دوفازی میزان تخلیص لیپاز بیشتر بوده است. [13]
نتیجه گیری
هدف از بررسی توزیع بیومولکول در سیستم های دوفازی آبی دستیابی به شرایط مناسب برای افزایش بازدهی جداسازی بیومولکول ها خصوصاً آنزیم ها از محیط تخمیر است. ملایمت سیستم های دوفازی آبی در مقایسه با سیستم های استخراج با حلال آلی، نسبت به مواد بیولوژیک باعث می شود این مواد در اثر جداسازی آسیب ندیده و تغییر شکل ندهند.
یافته های پژوهش حاضر نشان داد که ترکیب فازی سیستم های دو فازی آبی اثر معنا داری بر تفکیک آنزیم لیپاز دارند. در این تحقیق انواع سیستم های دو فازی حاوی پلی اتیلن و غیره مورد بررسی قرار گرفتند به طور کلی از انجا که بیوملکولها ملکولهای درشتی هستند و بخشهای قطبی و غیر قطبی دارند جداسازی و استخراج آنها بسته به نوع ملکول و ساختار آن فرق می کند استفاده از سیستم های دو فازی آبی تمایلی نیز همین مساله را نشان میدهد چرا که برای جداسازی و استخراج هر ملکول خاص باید از فاز تمایلی ویژه ای استفاده کرد که با ساختار ترکیب مورد نظر سازگار بوده و فرایند استخراج کامل گردد از انجا که پایداری ساختار ملکولی مواد تابع پارامترهای مختلف می باشد در نتیجه بازده فرایند استخراج نیز تابع همین پارامترها خواهد بود.
[1] A. Houde, A. Kademi, and D. Leblanc (2004) "Lipases and their industrial applications" Applied Biochemistry and Biotechnology 118, 155-170.
[2] N.G. Edwinoliver, K. Thirunavukarasu, R.B. Naidu, M.K. Gowthaman, T.N. Kambe, and N.R. Kamini (2010) "Scale up of a novel tri-substrate fermentation for enhanced production of Aspergillus niger lipase for tallow hydrolysis" Bioresours Technology 101, 6791- 6796.
[3] P. Ellaiah, T. Prabhakar, B. Ramakrishna, A. Thaer Taleb, and K. Adinarayana (2004) "Production of lipase by immobilized cells of Aspergillus niger" Process Biochemistry 39, 525-528.
[4] N.D. Mahadik, U.S. Puntambekar, K.B. Bastawde, J.M. Khire, and D.V. Gokhale (2002) "Production of acidic lipase by Aspergillus niger in solid state fermentation" Process Biochemistry 38, 715-721.
[5] E. Rigo, J.L. Ninowa, M.D. Luccio, J.V. Oliveira, A.E. Polloni, D. Remonatto, F. Arbter, R. Vardanega, D. de Oliveira, and H. Treichel (2010) "Lipase production by solid fermentation of soybean meal with different supplements" LWT – Food Science Technology 43, 1132-1137.
[6] K. Naganagouda, and V.H. Mulimani (2008) "Aqueous two-phase extraction (ATPE): An attractive and economically viable technology for downstream processing of Aspergillus oryzae a-galactosidase" Process Biochemistry 43, 1293-1299.
[7] B.Y. Zaslavsky (1995) "Aqueous two-phase partitioning:physical chemistry and bioanalytical applications" pp. 221-290. Marcel Dekker Inc., NY, USA.
[8] G. Khayati, and M. Anvari (2012) "Aqueous two-phase systems composed of different molecular weight of polyethylene glycol and diammonium phosphate for extraction of Bovine Serum Albumin" Italian Journal of Food Science 24, 279-283.
[9] G. Khayati (2013) "Optimization of Propionic Acid Extraction by Aqueous Two-Phase System Using Response Surface Methodology" Chemical Engineering Communications 200, 667-677.
[10] K.L. Berna, and T. Leman (2013) "Initial purification of catalase from Phanerochaete chrysosporium by partitioning in poly(ethylene glycol)/salt aqueous two phase systems" Separation and Purification Technology 105, 8-14.
[11] K.E. Nandini, and N.K. Rastogi (2011) "Liquid-Liquid Extraction of Lipase Using Aqueous Two-Phase System" Food Bioprocess Technology 4, 295-303.
[12] N.R. Kamini, J.G.S. Mala, and R. Puvanakrishnan (1998) "Lipase production from Aspergillus niger by solid state fermentation using gingelly oil cake" Process Biochemistry 33, 505-511.
[13] M. Kordel, B. Hofmann, D. Schomburg, and R.D. Schmid (1991) "Extracellular lipase of Pseudomonas sp. strain ATCC 21808: purification,
21